In mammals, tectal and tegmental divisions of the brainstem are involved in attentional mechanisms and responses to threatening stimuli such as predators. These centers are regulated by ascending connections, but the anatomical and neurochemical details of this drive are not fully known. The nucleus incertus (NI) in the pontine tegmentum is the source of ascending GABA projections to forebrain cognitive/emotional centers and NI neurons contain a number of neuropeptides, including relaxin-3 (RLN3). Tract-tracing studies have described NI projections within the tectum; and in this study we describe the distribution of relaxin-3 fibers within tectal and tegmental areas/nuclei of rat brain. RLN3-immunostained sections were also reacted with antisera against other neurochemical markers, as synaptophysin, nitric oxyde synthetase, tyrosine hydroxylase, calbindin, calretinin and 5-HT, to assist in demarcation of the area. RLN3-containing fibers were concentrated in the medial, olivary and ventrolateral pretectal nuclei; the medial intermediate grey layer of superior colliculus; and the pericentral area of inferior colliculus. Some labeled fibers were also detected in the cuneiform, parabigeminal and sagulum nuclei. RLN3 fibers were concentrated around the commissural bundles along the midline of the tectum, in the dorsal columns of the periaqueductal gray and in the dorsal raphe. In all areas, RLN3 and synaptophysin staining co-existed, indicating an association of the peptide with synapses. RLN3 projections target structures within the tectum and tegmentum that comprise the defensive system involved in detection of and response to unexpected threatening stimuli. NI neurons, which are a major source of RLN3 fibers and express corticotrophin-releasing factor receptors, may contribute to these responses following activation by stress-related stimuli. / Nos mamíferos, as divisões tectal e tegmental do tronco cerebral estão envolvidas em mecanismos de atenção e de respostas a estímulos ameaçadores, como os predadores. Esses centros são regulados por conexões ascendentes, mas os detalhes anatômicos e neuroquímicos desta unidade não são totalmente conhecidos. O núcleo incertus (NI) no tegmento pontino é a fonte de projeções ascendentes de GABA para prosencéfalo cognitivo/centros emocionais, e os neurônios do NI contêm alguns neuropeptídeos, incluindo relaxina-3 (RLN3). Estudos com traçadores descreveram projeções do NI para o tectum, e neste estudo, descrevemos a distribuição de fibras relaxina-3 nas áreas tectal e tegmental. Foram feitas imunocitoquímica para RLN3 conjugadas com outros marcadores neuroquímicos, tais como, sinaptofisina, óxido nítrico sintase neuronal, tirosina hidroxilase, calbindina, calretinina e 5-HT, para ajudar na demarcação da área. Fibras contendo RLN3 estavam concentradas na nucleos pretectais ventrolaterais, olivar e medial; na camada intermediária medial cinzenta do colículo superior; e na área pericentral de colículo inferior. Algumas fibras marcadas também foram detectadas nos núcleos cuneiforme, parabigeminal e sagulum. Fibras RLN3 foram concentradas em torno da feixes comissurais ao longo da linha mediana do tectum, nas colunas dorsais da substância cinzenta periaquedutal e na rafe dorsal. Em todas as áreas, a marcação para RLN3 e sinaptofisina co-existiu, indicando uma associação do péptideo com as sinapses. Estruturasalvo para as projeções de RLN3 do tecto e tegmento compõem o "sistema defensivo" envolvidos na detecção e resposta a estímulos ameaçadores. Neurônios do NI, são uma importante fonte de fibras RLN3 e expressam fatores de liberação de receptores para corticotropina, que podem contribuir para a respostas ao estímulos de estresse.