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Thesis (doctoral)--Eberhard-Karls-Universität zu Tübingen, 2006.

Tübingen, University, Diss., 2005 (Nur beschränkt für den Austausch).

Synaptophysin (Syp) is a major integral synaptic vesicle (SV) protein; there are 31 copies of Syp per vesicle, which totals up to 10% of the total SV protein content. Despite being the major SV protein, little is known about the interaction partners of Syp and as a result there has been no clear role attributed to it. One key feature of Syp is that its cytoplasmic C-terminus contains 10 pentapeptide repeats, nine of which are initiated by a tyrosine residue. Syp is the major tyrosine phospho-protein on SVs. The kinase thought to phosphorylate Syp in vivo is the ubiquitously expressed non-receptor kinase C-Src. There are two splice variants of C-Src, N1- and N2-Src, which are only expressed in neuronal tissues. Although the 3 Srcs are structurally similar, they differ by a small insert of amino acids into their SH3 domains (the N-Src loop). Examination of the amino acid sequence of the cytosolic C-terminus of Syp revealed a putative type one SH3 domain interaction motif. A screen using SH3 domains of synaptic proteins as bait in GST-pull downs from nerve terminal lysate allowed an inventory of potential interaction partners of Syp to be created. Reciprocal experiments using the C-terminal of Syp as bait confirmed many of these interactions. Single point mutations of the SH3 interaction motif on Syp highlighted that syndapin and C-Src bound to Syp via this motif. These binding mutants were inserted in Syp superecliptic synaptophluorin (SypHy) to determine the functional consequences of these interactions. These mutants did not affect the trafficking of Syp when expressed in cortical neurons derived from Syp knockout mice. However, the SH3 interaction motif was fundamental for the retrieval of VAMP (vesicle associated membrane protein) when expressed in Syp knockout cultures. Importantly, this role is not mediated through a direct interaction with VAMP with the SH3 interaction motif implicating either syndapin, C-Src or both in Syp-dependent VAMP retrieval. The 3 different Srcs had different methods of interaction with Syp, and in vitro protein kinase assays the ability of the three Src splice variants to phosphorylate Syp was assessed. Key differences in both speed and efficiency of Syp phosphorylation was observed for the different Src splice variants. Mutagenesis of either all 9 tyrosine residues, only previously identified sites resulted in changes in Syp interactions in GST-pull down assays from nerve terminal lysates. To investigate the role of Syp phosphorylation in the SV lifecycle, the tyrosine pentapeptide repeats were truncated from the C-terminal of Syp in both a mCerulean tagged Syp and SypHy. The experiments showed that these potential tyrosine phosphorylation sites were not involved in the trafficking of Syp but key in the retrieval of VAMP from the plasma membrane during the SV lifecycle. I have indentified an SH3 interaction motif on the C-terminal of Syp that is critical in forming a complex of proteins that are responsible for the retrieval of VAMP during the SV lifecycle. Further experiments have shown that this key interaction is potentially phosphorylation dependent. My preliminary mass spectrometry analysis has provided a catalogue of proteins that can potentially interact with Syp, identifying proteins that may bind to either the Syp C-terminus SH3 interaction motif or to other regions in a phosphorylation dependent manner. This has provided a list of potential candidate proteins for the VAMP retrieval complex.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

In der synaptischen Vesikelmembran adulter Neuronen bildet Synaptobrevin mit Synaptophysin den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex. Der Komplex wird im Gegensatz zum SNARE-Komplex nicht in embryonalen Membranen gebildet, sondern erst während der neuronalen Entwicklung hochreguliert. Dabei erfährt Synaptophysin wahrscheinlich eine posttranslationale Modifizierung, die durch einen niedermolekularen Faktor bewirkt wird. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex spielt eine entscheidende Rolle innerhalb der Präsynapse bei der Bereitstellung von Synaptobrevin zur Bindung seiner SNARE-Partner an der Plasmamembran. Im Zustand erhöhter exozytotischer Aktivität der Synapse beschleunigt der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex die Rekrutierung von Synaptobrevin für eine erneute Bildung des SNARE-Komplexes und ermöglicht damit schnelle Exozytose-Endozytose-Zyklen bei erhöhter präsynaptischer Stimulation. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und der SNARE-Komplex schließen sich gegenseitig aus. Synaptische Membranen sind aus Lipiden und Proteinen aufgebaut, welche miteinander in Wechselwirkungen stehen. Innerhalb der Membranen formieren sich Subdomänen wie Lipid Rafts die durch eine besondere Lipidzusammensetzung stabilisiert werden und mit speziellen Proteinen bevorzugt assoziieren. Durch die spezielle Organisation des Membranaufbaus können die Prozesse der Endozytose und der Exozytose zum Teil reguliert werden. Synaptische Vesikel, die zu den kleinsten Zellorganellen zählen, zeigen einen besonders hohen membranären Cholesterolgehalt. Synaptophysin ist ein integrales Membranprotein synaptischer Vesikel und konnte zusätzlich als spezifisch cholesterolbindendes Protein identifiziert werden. Durch die Assoziation mit cholesterolreichen Nanodomänen der synaptischen Vesikelmembran könnten die Funktionen von Synaptophysin bei der Membranstabilisation und im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex der synaptischen Vesikelmembran beeinflusst werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nach Cholesterolverminderung der Membranen von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen mittels Filipin und Methyl-ß-cyclodextrin Synaptophysin in dem Detergens Triton X-100 unlöslicher wird. Die Cholesterolverminderung der Membranen von Neuronen aus Rattengehirngewebe und Hippokampuskulturen mittels Methyl-ß-cyclodextrin und Lovastatin führte weiterhin zu einer verminderten Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes in der synaptischen Vesikelmembran. Somit scheint die Cholesterolassoziation von Synaptophysin und damit die Organisation der synaptischen Vesikelproteine innerhalb von Membrandomänen entscheidend an der Regulation der Proteininteraktionen im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex beteiligt zu sein. Zusätzlich trägt Synaptophysin durch seine Cholesterolbindung wahrscheinlich zur Stabilisierung des hohen Krümmungsgrades der Membran der synaptischen Vesikel bei. Die Auswirkungen des verminderten Cholesterolgehaltes auf Synaptophysin und den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex konnten auch bei homozygoten Mausmutanten für die Niemann-Pick Krankheit nachgewiesen werden. Der Cholesterolgehalt synaptischer Vesikel ist also für die Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes entscheidend und beeinflusst direkt die synaptische Effizienz. / Synaptobrevin interacts with synaptophysin in membranes of adult small synaptic vesicles and forms the synaptophysin/synaptobrevin complex. In contrast to the SNARE complex the synaptophysin/synaptobrevin complex only occurs in adult rat brain but is absent in embryonic brain. Changes in the binding properties of synaptophysin are probably induced by a factor of low molecular weight and correlate with posttranslational modifications of the protein. The synaptophysin/synaptobrevin complex plays an important role within the presynaptic terminal promoting synaptobrevin to bind its SNARE partners at the plasma membrane. In times of increased synaptic activity at the synapse the synaptophysin/synaptobrevin complex accelerates the recruitment of synaptobrevin to form new SNARE complexes and allows for fast exocytotic/endocytotic cycles. The synaptophysin/synaptobrevin complex and the SNARE complex are mutually exclusive. Major constituents of synaptic membranes are lipids and proteins which are subjected to continuous interactions. Within the membrane form specialized environments known as lipid rafts that are stabilized through tightly packed lipids and proteins that associate preferentially with these domains. The characteristic organisation of membrane structures is crucial for regulating the process of endocytosis and exocytosis. Synaptic vesicles are among the smallest cell organelles and are especially enriched in cholesterol. The integral membrane protein synaptophysin in addition was identified as a major specifically cholesterol-binding protein. Lateral association with cholesterol enriched subunits of the synaptic vesicle membrane may contribute to mediate the functions of synaptophysin in stabilising membrane structures and may in part regulate synaptophysin/synaptobrevin complex formation. Here we show that depletion of the cholesterol content of CHOp38 cell and PC12 cell membranes by Filipin and Methyl-ß-cyclodextrin significantly changes the solubility of synaptophysin in non-ionic detergents like Triton X-100. After cholesterol depletion of adult rat brain and primary cultures of mouse hippocampus by Methyl-ß-cyclodextrin and the HMGCoA-reductase inhibitor Lovastatin the synaptophysin/synaptobrevin complex was seen to be downregulated. Thus, the synaptophysin/synaptobrevin interaction critically depends on high cholesterol content of the synaptic vesicle membrane. Thereby, synaptophysin likely contributes to stabilise the high membrane curvature of synaptic vesicles. The effects of cholesterol depletion on functional properties of synaptophysin and the synaptophysin/synaptobrevin complex could also be shown on homozygous littermates of the mouse model of Niemann-Pick type C disease. Our investigation indicates that the cholesterol content of synaptic vesicles appears to be important for the fusion of the synaptophysin/synaptobrevin complex and directly affects synaptic efficiency.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin bei Wachstum und Differenzierung der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur 17 Tage alter Mäuseembryonen zu untersuchen. Besonderes Interesse galt dabei dem Fortsatzwachstum und der Synaptogenese. Durch Beobachtung von Zellmorphologie und Zellwachstum wurde gezeigt, daß die Ausbildung charakteristischer Zelltypen ein intrinsischer Prozeß der hippocampalen Neurone ist. Die Synaptogenese wurde durch die Darstellung der entwicklungsabhängigen Verteilung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin mittels Immunfluoreszenzmarkierung dokumentiert. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde die Differenzierung subzellulärer Strukturen der hippocampalen Zellkultur charakterisiert und die Verteilung von Synaptophysin und Synaptobrevin entwicklungsabhängig dargestellt. Synaptophysin fand sich nicht nur in axonalen Präsynapsen, sondern auch in Dendriten. Synaptobrevin war im Gegensatz zu Synaptophysin nicht in allen synaptischen Vesikeln der Axonterminalen darstellbar. Um die Wirkungen von Synaptophysin und Synaptobrevin auf hippocampale Neurone in der Kultur genauer zu untersuchen, standen zwei Versuchsmodelle zur Verfügung: 1. die Synaptophysin-defiziente Maus und 2. das clostridiale Neurotoxin Tetanustoxin (TeNT), das Synaptobrevin spezifisch spaltet. Anhand der Depletion von Synaptophysin wurde untersucht, ob in vitro das Fehlen des Proteins Konsequenzen in Bezug auf Synapsenbildung und morphologisches Erscheinungsbild der Neurone hat. Es konnten lichtmikroskopisch und auch im elektronenmikroskopischen Bild keine Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Durch morphometrische Messungen zeigte sich, daß in der Kultur der Synaptophysin-depletierten Maus nach 2 DIV mit hoher Signifikanz die Dendriten länger als in Kontrollkulturen waren. Dies spricht für regulatorische Funktionen des Proteins bei Exo- und Endozytosevorgängen während des dendritischen Wachstums. Nach Zugabe von Tetanustoxin zur pränatalen Zellkultur konnte gezeigt werden, daß die Inaktivierung von Synaptobrevin durch TeNT in vitro keine Konsequenzen in Bezug auf das morphologische Erscheinungsbild der Neurone, die Synapsenbildung und das Wachstumsverhalten hat. Mit morphometrischen Messungen konnten für TeTx-behandelte Neurone keine hochsignifikanten Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Synaptobrevin scheint also sowohl beim Axon- als auch beim Dendritenwachstum keine essentielle Rolle zu spielen. / Goal of this work was to investigate the role of the synaptic vesicle proteins synaptophysin and synaptobrevin during development and differentiation of mouse fetal hippocampal neurons in primary culture. The outgrowth of dendritic and axonal fibers and the mechanisms of synaptogenesis were of special interest. Observation of morphology and development showed that generation of characteristic cell types is an intrinsic process of hippocampal neurons. Differentiation of cellular and subcellular structures in hippocampal cell culture, characteristics of synaptogenesis and the stage-dependent distribution of synaptophysin and synaptobrevin were demonstrated by immunofluorescence and electron microscopy. Synaptophysin was localized in presynaptic axon terminals but also in dendrites. In contrast with synaptophysin immunoreaction for synaptobrevin could not be found in all synaptic vesicles of the presynaptic axon terminal. To investigate the influence of synaptophysin and synaptobrevin on hippocampal neurons in culture two experimental models were used, first a synaptophysin-knock-out-mouse and second the clostridial neurotoxin tetanustoxin (TeNT) which selectively cleaves synaptobrevin. With the depletion of synaptophysin we investigated if there are consequences in development of synapses and morphological features of the neurons in vitro. In both, light and electron microscopy, there was no difference to control cultures. In morphometric measurements there was a significant difference in the lenght of developing dendrites after 2 DIV with longer dendrites in the synaptophysin-knock-out-mouse. Therefore synaptophysin may have a regulatory function for exo-/ endocytosis during dendritic growth. Specific inactivation of synaptobrevin by tetanustoxin had no consequences in morphological features, synaptogenesis and growing of the hippoacampal neurons in vitro. Morphometric measurements showed no significant differences between TeNT and control. Therefore we conclude that synaptobrevin has no essential function during axon growth or dendrite elongation.

För att diagnostisera malignt melanom och dess undergrupper används immunhistokemi för att färga in celler som uttrycker specifika protein. Särskilt desmoplastiska melanom kan initialt felbedömas baserat på utseendet som ärr, och det är därför viktigt att ha sensitiva antikroppar för att diagnostisera dem. Elva arkiverade patientprover (varav tre epiteloida melanom, fyra spolcelliga, tre desmoplastiska och ett akralt lentiginöst) färgades in med antikroppar mot CK18, HMB-45, Melan-A, S100, SOX10 och synaptophysin. Alla prover var negativa för CK18, nio var positiva för HMB-45 och Melan-A (de negativa var båda desmoplastiska melanom) och alla var positiva för S100 och SOX10. Synaptophysin var positiv i alla epiteloida melanom och det akralt lentiginösa melanomet, två av de fyra spolcelliga melanomen och negativ i alla desmoplastiska melanom. Fördelarna med SOX10, som tidigare studier i ämnet har påvisat, observerades inte i denna studie, troligen på grund av begränsningen i patientmaterial. Trots det verkar SOX10 vara ett användbart tillägg i melanompanelen, eller kanske till och med kan ersätta S100, baserat på tidigare studier.

Durante a sepse ocorre liberação de mediadores inflamatórios, que contribui para o comprometimento do sistema nervoso central e alterações na secreção dos hormônios hipofisários. Contudo, não está elucidado se essas alterações persistem em animais sobreviventes à sepse. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as alterações neuroimunoendócrinas em animais sobreviventes à sepse polimicrobiana experimental. A sepse foi induzida pelo método de ligadura e perfuração cecal (CLP) (uma perfuração com agulha 14G) e os animais foram observados durante cinco ou dez dias. Os animais naive ou sobreviventes foram submetidos ao desafio osmótico intraperitoneal com salina hipertônica (2M), ou desafio imune intravenoso com LPS (1.5 mg/kg), ou ao estresse por imobiliza- ção. Após 30 minutos do desafio osmótico ou 60 minutos para os demais estímulos, os animais foram decapitados para coleta de sangue e do hipotálamo. O sangue foi coletado para dosagem de nitrato, citocinas e hormônios (vasopressina, ocitocina, ACTH e corticosterona); e o hipotálamo para a quantificação dos níveis de citocinas e dos conteúdos de sinaptofisina e beta-amilóide. No presente estudo, nós observamos um aumento periférico dos mediadores inflamatórios: nitrato e IL-1?, e centralmente da citocina IL-6 no hipotálamo de animais sobreviventes à sepse. Além disso, dependendo do estímulo, observou-se uma atenuada (desafio osmótico) ou exacerbada (desafio imune) secreção da vasopressina e/ou ocitocina em animais sobreviventes à sepse. Adicionalmente, também encontramos uma diminuição no conteúdo hipotalâmico de sinaptofisina, e nenhum sinal de acúmulo de beta-amilóide. Concluímos que as alterações na secreção de vasopressina e ocitocina observadas podem estar associadas à neuroinflamação sustentada e disfunção sináptica com evidências de processo neurodegenerativo. Este modelo de sepse pode fornecer informações importantes para a compreensão das alterações fisiopatológicas à longo prazo. / Inflammatory mediators released during sepsis contribute to central nervous system impairment and alterations in the secretion of pituitary hormones. However, it is unclear whether these changes persist in sepsis survivor animals. In this context, the objective of this work was to study the neuroimunoendocrine alterations in sepsis survivor animals. Sepsis was induced by the cecal ligation and perforation (CLP) method and the animals (perforated once with a 14G needle) were observed for five or ten days. Naive or sepsis survivors were submitted to intraperitoneal osmotic challenge with hypertonic saline (2M), or intravenous immune challenge with LPS (1.5 mg/kg), or immobilization stress. After 30 minutes of the osmotic challenge or 60 minutes for the other stimuli, the animals were decapitated for collection of blood and the hypothalamus. Blood was collected for the determination of nitrate, cytokines and hormones (vasopressin, oxytocin, ACTH and corticosterone); and the hypothalamus for quantification of cytokine levels, and synaptophysin and beta-amyloid contents. In the present study, we observed a peripheral increase of inflammatory mediators: nitrate and IL-1?, and centrally of the IL-6 cytokine in the hypothalamus of sepsis survivor animals. In addition, depending on the stimulus, an attenuated (osmotic challenge) or exacerbated (immune challenge) secretion of vasopressin and/or oxytocin was observed in sepsis survivor animals. In addition, we also found a decrease in the hypothalamic content of synaptophysin, and no signal of beta amyloide accumulation. We conclude that alterations in vasopressin and oxytocin secretion may be associated with sustained neuroinflammation and synaptic dysfunction with evidence of neurodegenerative process. This model of sepsis may provide important informations for understanding long-term pathophysiological alterations.

Die integralen Vesikelmembranproteine Synaptophysin und Synaptobrevin interagieren in adulten Neuronen. Zusätzlich bildet Synaptobrevin mit den Plasmamembranproteinen Syntaxin und synaptosome-associated protein 25kDa (SNAP25) den SNAP-Rezeptor (SNARE)-Proteinkomplex, der Voraussetzung für die Fusion zwischen synaptischen Vesikeln und präsynaptischer Membran ist. Mit Synaptophysin interagierendes Synaptobrevin bindet jedoch nicht an den SNARE-Proteinen. Es wird daher vermutet, dass der Synaptophysin/Synaptobrevin-Komplex eine Art Reservepool für Synaptobrevin bei erhöhter neuronaler Aktivität darstellt und die Verfügbarkeit von Synaptobrevin während der Exozytose reguliert. Mit verschiedenen Ansätzen wurde versucht, den auf dem Vesikel befindlichen Komplex genauer zu charakterisieren und in seiner Funktion näher zu beschreiben. Nach Stimulation mit exozytosevermittelnden Substanzen dissoziierte der Synaptophysin/ Synaptobrevin-Komplex, sowohl unter nativen Bedingungen als auch bei Blockierung des finalen Fusionsereignisses. Dieser Prozess war calciumabhängig, konnte jedoch nicht durch die direkte Wirkung von Calcium ausgelöst werden. Die Untersuchung des Komplexes mit Hilfe von clostridialen Neurotoxinen zeigte, dass Synaptobrevin bevorzugt in Bindung an Synaptophysin und als Dimer gespalten wurde. Die Spaltung des SNARE-Proteins SNAP25 hatte keinen Einfluss auf die Komplexbildung. Die Verringerung des Cholesterolgehaltes der Membran führte zur Abnahme der Interaktion von Synaptophysin und Synaptobrevin, umgekehrt zeigte sich ein Anstieg bei zusätzlicher Cholesterolapplikation. In weiteren Experimenten konnte der C-terminale Teil des Synaptobrevins als für die Bindung zu Synaptophysin entscheidende Abschnitt identifiziert werden. Weiterhin konnte die erfolgreiche Translokation von rekombinanten Konstrukten aus Botulinumtoxin D und einem angekoppelten funktionstüchtigen Protein ins Zytosol gezeigt werden. / The vesicle associated membrane proteins synaptophysin and synaptobrevin interact in ma-ture neurones. Additionally synaptobrevin forms a complex with the plasma membrane pro-teins syntaxin and synaptosome-associated protein 25kDa (SNAP25), better known as the SNAP-Receptor (SNARE) complex, which is a prerequisite for fusion of the presynaptic and vesicle membranes. These two protein complexes however are mutually exclusive. It is as-sumed that the synaptophysin/synaptobrevin complex resembles a reserve pool for synapto-brevin and regulates the availability of synaptobrevin for the fusion process in case of in-creased synaptic activity. Different approaches where chosen to characterize this protein complex and to examine its function in more detail. After excessive stimulation the synaptophysin/synaptobrevin complex dissociates, even when the final fusion process is blocked. This step was dependent on the presence of cal-cium, though it could not be triggered directly by calcium administration. When using clos-tridial neurotoxins, synaptobrevin was preferentially cleaved in its homodimeric form and in the complex with synaptophysin. Cleavage of SNAP25 had no effect on the complex forma-tion. Depletion of cholesterol content decreases the interaction of synaptophysin with synap-tobrevin, while cholesterol treatment increases interaction. Further experiments indicated that synaptophysin binds to the the carboxy-terminal transmembrane part of synaptobrevin. Fur-thermore it could be shown that proteins attached to botulinum toxin can be delivered to the cytosol of neuronal cells, being fully active.