Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin bei Wachstum und Differenzierung der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur 17 Tage alter Mäuseembryonen zu untersuchen. Besonderes Interesse galt dabei dem Fortsatzwachstum und der Synaptogenese. Durch Beobachtung von Zellmorphologie und Zellwachstum wurde gezeigt, daß die Ausbildung charakteristischer Zelltypen ein intrinsischer Prozeß der hippocampalen Neurone ist. Die Synaptogenese wurde durch die Darstellung der entwicklungsabhängigen Verteilung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin mittels Immunfluoreszenzmarkierung dokumentiert. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde die Differenzierung subzellulärer Strukturen der hippocampalen Zellkultur charakterisiert und die Verteilung von Synaptophysin und Synaptobrevin entwicklungsabhängig dargestellt. Synaptophysin fand sich nicht nur in axonalen Präsynapsen, sondern auch in Dendriten. Synaptobrevin war im Gegensatz zu Synaptophysin nicht in allen synaptischen Vesikeln der Axonterminalen darstellbar. Um die Wirkungen von Synaptophysin und Synaptobrevin auf hippocampale Neurone in der Kultur genauer zu untersuchen, standen zwei Versuchsmodelle zur Verfügung: 1. die Synaptophysin-defiziente Maus und 2. das clostridiale Neurotoxin Tetanustoxin (TeNT), das Synaptobrevin spezifisch spaltet. Anhand der Depletion von Synaptophysin wurde untersucht, ob in vitro das Fehlen des Proteins Konsequenzen in Bezug auf Synapsenbildung und morphologisches Erscheinungsbild der Neurone hat. Es konnten lichtmikroskopisch und auch im elektronenmikroskopischen Bild keine Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Durch morphometrische Messungen zeigte sich, daß in der Kultur der Synaptophysin-depletierten Maus nach 2 DIV mit hoher Signifikanz die Dendriten länger als in Kontrollkulturen waren. Dies spricht für regulatorische Funktionen des Proteins bei Exo- und Endozytosevorgängen während des dendritischen Wachstums. Nach Zugabe von Tetanustoxin zur pränatalen Zellkultur konnte gezeigt werden, daß die Inaktivierung von Synaptobrevin durch TeNT in vitro keine Konsequenzen in Bezug auf das morphologische Erscheinungsbild der Neurone, die Synapsenbildung und das Wachstumsverhalten hat. Mit morphometrischen Messungen konnten für TeTx-behandelte Neurone keine hochsignifikanten Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Synaptobrevin scheint also sowohl beim Axon- als auch beim Dendritenwachstum keine essentielle Rolle zu spielen. / Goal of this work was to investigate the role of the synaptic vesicle proteins synaptophysin and synaptobrevin during development and differentiation of mouse fetal hippocampal neurons in primary culture. The outgrowth of dendritic and axonal fibers and the mechanisms of synaptogenesis were of special interest. Observation of morphology and development showed that generation of characteristic cell types is an intrinsic process of hippocampal neurons. Differentiation of cellular and subcellular structures in hippocampal cell culture, characteristics of synaptogenesis and the stage-dependent distribution of synaptophysin and synaptobrevin were demonstrated by immunofluorescence and electron microscopy. Synaptophysin was localized in presynaptic axon terminals but also in dendrites. In contrast with synaptophysin immunoreaction for synaptobrevin could not be found in all synaptic vesicles of the presynaptic axon terminal. To investigate the influence of synaptophysin and synaptobrevin on hippocampal neurons in culture two experimental models were used, first a synaptophysin-knock-out-mouse and second the clostridial neurotoxin tetanustoxin (TeNT) which selectively cleaves synaptobrevin. With the depletion of synaptophysin we investigated if there are consequences in development of synapses and morphological features of the neurons in vitro. In both, light and electron microscopy, there was no difference to control cultures. In morphometric measurements there was a significant difference in the lenght of developing dendrites after 2 DIV with longer dendrites in the synaptophysin-knock-out-mouse. Therefore synaptophysin may have a regulatory function for exo-/ endocytosis during dendritic growth. Specific inactivation of synaptobrevin by tetanustoxin had no consequences in morphological features, synaptogenesis and growing of the hippoacampal neurons in vitro. Morphometric measurements showed no significant differences between TeNT and control. Therefore we conclude that synaptobrevin has no essential function during axon growth or dendrite elongation.

Die Neurone der Hirnrinde sind in Mikroschaltkreisen, Modulen und Arealen organisiert. In dieser Doktorarbeit habe ich die Neurobiologie und Hirnrindenstruktur der Etruskerspitzmaus - ein neues Modelltier für neurobiologische Forschung - und die modulare Struktur des entorhinalen Kortex der Ratte untersucht. Die geringe Größe des Gehirns der Etruskerspitzmaus bietet besondere Vorteile für das Verständnis kortikaler Aktivität von Zellgruppen. Die entorhinale Kortex enthält sowohl gut definierte funktionelle als auch anatomische Module und bietet daher eine einzigartige Gelegenheit für das Studium ihrer Wechselbeziehungen. Die Organisation der Hirnrinde der Etruskerspitzmaus reflektiert die Spezialisierung als schnelle, auf taktile Reize spezialisierte Jäger. Mehrere kortikale Regionen, die ein Drittel des kortikalen Volumens ausmachen, reagieren auf taktile Reize. Eine kortikale Hemisphäre enthält nur etwa eine Million Neuronen. Basierend auf der Zellarchitektur und histochemischen Färbungen haben wir 13 kortikale Regionen definiert - eine große Zahl angesichts der geringen Größe des Spitzmausgehirns. Pyramidenzellnester in Schicht 2 des medialen entorhinalen Kortex sind einfach zu identifizieren und eignen sich als Bezugssystem für die verschiedenen modulären Strukturen dieser Hirnregion. Diese Pyramidenzellen bündeln ihre Dendriten hin zu einem Punkt, der sich mit erhöhten Konzentrationen von präsynaptischen cholinergen Markern überschneidet. Cholinerge Transmission ist ein wichtiger Bestandteil des Theta-Rhythmus und unsere Ergebnisse zeigen, daß Pyramidenzellen im Vergleich zu Sternzellen doppelt so stark Theta-moduliert sind. Da fast alle Gitterzellen stark Theta-moduliert sind, ist anzunehmen dass Pyramidenzellen eine wichtige Rolle für die räumliche Navigation spielen. In dieser Arbeit wurden an der Hirnrinde der Etruskerspitzmaus sowie der entorhinalen Hirnrinde der Ratte modellhaft Struktur-Funktions-Beziehungen in der Großhirnrinde aufgeklärt. / Neurons of the cerebral cortex are collectively organized into microcircuits, modules and cortical areas. Here, I study the neurobiology and cortical structure of the Etruscan shrew - a new model animal for neurobiological research - and the modular structure of the entorhinal cortex of the rat. The small size of the Etruscan shrew''s brain offers particular advantages for understanding cortical activity at the multi-cell level, due to its small number of cortical neurons and its intrinsic advantages for optical imaging approaches. The entorhinal cortex contains well-defined functional and anatomical modules and provides a unique opportunity for studying their interrelation. The organization of the cerebral cortex of the Etruscan shrew reflects their behavioral specialization as fast touch-and-kill hunters. Several cortical areas comprising a third of the cortical volume respond to vibrissal touch. One cortical hemisphere contains only about 1 million neurons. Cytoarchitecture and histochemical staining revealed 13 cortical regions - a large number considering the small size of the shrew''s brain. Pyramidal cell clusters in layer 2 of medial entorhinal are reliably identifiable and thus provide common anatomical framework for entorhinal cortex modularity. These cells form geometrically arranged clusters and bundle their dendrites towards a common point overlapping with presynaptic markers of cholinergic inputs. Cholinergic drive is an important component of theta-rhythmicity which we found to be two-fold stronger in pyramidal than in stellate neurons. Since nearly all grid cells are strongly theta modulated, we suggest that pyramidal cells may play an important role in microcircuits for spatial navigation. In this work, we studied the areal architecture of the Etruscan shrew cortex and the modular architecture of the rat medial entorhinal cortex as contributions towards understanding structure-function relations in the cerebral cortex.

Der entorhinale Cortex (EC) nimmt eine zentrale Stellung im limbischem System ein und ist darüber hinaus eine Verbindungsstelle zwischen Hippocampus und Cortex. Um die Eigenschaften der Projektionszellen im EC genauer zu charakterisieren, führten wir intrazelluläre Ableitungen an den Neuronen der oberflächlichen (Schicht II und III) und der tiefen (Schicht IV-VI) Schichten durch, von denen etwa ein Viertel während der Ableitung mit dem Farbstoff Biozytin gefärbt werden konnten. In Schicht III des medialen EC fanden wir vier unterschiedliche Zelltypen, von denen zwei als Projektionsneurone (Typ 1 und Typ 2) charakterisiert wurden. Die Projektionszellen der Schicht III besitzen eine niedrige Schwelle zur Auslösung synaptisch evozierter Aktionspotentiale. Daneben konnten wir zwei weitere Typen von Zellen (Typ 3 und Typ 4) bestimmen, deren Somata in der Schicht III lagen, die aber nicht in den Hippocampus projizierten, sondern lokal im EC verschaltet waren. In den tiefen Schichten des EC fanden sich zur Area Dentata (AD) projezierende bipolare und multipolare Neurone, die trotz der morphologischen Ähnlichkeit mit GABAergen Interneuronen die typischen elektrophysiologischen und neurochemischen Eigenschaften von Prinzipalzellen des EC besitzen. Diese Neurone können vermutlich Funktionen von sowohl Lokal- als auch Projektionszellen übernehmen und dementsprechend die schnelle Informationsübertragung zwischen den tiefen und oberflächlichen Schichten einerseits und zwischen EC und AD andererseits ausüben. Um der Frage nachzugehen, unter welchen Bedingungen die Schicht II- und III-Projektionszellen aktiviert werden, führten wir repetitive synaptische Reizungen im EC durch. Hochfrequente repetitive synaptische Reizung (> 10 Hz) führt zu einer bevorzugten Aktivierung der Schicht II-Zellen. Hingegen werden die Schicht III-Zellen bei niedrigeren Reizfrequenzen (< 6 Hz) bevorzugt aktiviert und Schicht II-Zellen gleichzeitig gehemmt. Dies läßt vermuten, daß der Informationstransfer zwischen EC und Hippocampus frequenzabhängig gesteuert wird. / The entorhinal cortex (EC) occupies a key position in the limbic system because it functions as a relay station between the hippocampus and cortex. To analyze the properties of the projection cells of the EC we used intracellular recordings from superficial (layers II and III) and deep layers (layers IV-VI). Intracellular electrodes contained the marker biocytin and the labeled neurons were processed for posthoc anatomical identification. We can classify medial EC layer III cells into four different types. Type 1 and 2 cells were projection cells. These cells exhibited a low threshold of action potential generation upon synaptic stimulation. We identified the two other, presumed local circuit type 3 and type 4 cells, whose axons remained within the EC. In deep EC layers we described bipolar and multipolar neurons which form projections from the deep layers of the EC to the dentate gyrus (DG). Despite the morphological similarity of these cells to those of GABAergic interneurons in the EC, their electrophysiological characteristics were similar to those of principal neurons. We conclude that neurons of the deep layers of the EC that project to the DG may function both as local circuit and projection neurons thereby providing a rapid transfer of information from deep layers of the EC to the DG and superficial layers of the EC. We next studied how the separate pathways from layers II and III of the EC to the hippocampus are preferentially effective as a function of stimulation frequency. High frequency (>10 Hz) synaptic activation of the EC was more effective at eliciting action potentials from layer II EC neurons. In contrast, during low frequency (

Im Subikulum der Ratte finden sich zwei unterschiedliche Typen von Pyramidalzellen, die sich auf Grund ihres intrinsischen Entladungsverhaltens unterscheiden. Die Funktion dieser beiden Zelltypen hinsichtlich der synaptischer Neurotransmission ist unklar. Bursterzellen und regulär feuernde Zellen zeigten nach tetanischer Reizung ein unterschiedliches Ausmaß der LTP. Neben der zellspezifischen Ausprägung der LTP fanden sich mehrere Hinweise auf eine zielspezifische Projektion der Efferenzen der vorgeschalteten Area CA1. Die durchgeführten Experimente legen den Schluss nahe, dass Axone von Pyramidalzellen der Area CA1 selektiv auf subikuläre Pyramidenzellen projizieren und so den hippokampalen Informationsfluss steuern und regulieren können. NMDA-Rezeptoren auf beiden Seiten des synaptischen Spaltes spielen hier eine besondere Rolle. Präsynaptische NMDAR der Untereinheit NR2B scheinen an der LTP in Bursterzellen beteiligt zu sein und über einen vermehrten Kalziumeinstrom in die Präsynapse eine langanhaltende Erhöhung der Transmitterausschüttung herbeizuführen. Ebenso zeigten sich abhängig von der Zielzelle Hinweise auf eine unterschiedliche Aktivierung der präsynaptischen Adenylylcyclase-cAMP Kaskade. In Pilokarpin-behandelten Tieren ließ sich nach hochfrequenter Reizung keine langanhaltende Potenzierung der synaptischen Antworten nachweisen. Stattdessen scheinen polysynaptisch latente Verbindungen mittels tetanischer Stimulation aktivierbar zu sein. In einigen Fällen waren diese polysynaptisch latenten Verbindungen per se, in anderen Fällen nach Blockade der GABAergen Neurotransmission aktiv. In Hirnschnittpräparaten von Patienten mit pharmakoresistenter Temporallappenepilepsie konnte im Subikulum spontane rhythmische Aktivität mit einer Frequenz von 0,75 bis 3 Hz aufgezeichnet werden. Diese Aktivität, bestehend aus EPSP/IPSP Sequenzen, wurde sowohl in sklerotischem als auch in nicht sklerotischem Gewebe gefunden. In beiden Gruppen korrelierte die in vitro Aktivität sehr gut mit dem präoperativen Auftreten elektroenzephalografisch detektierter interiktaler Aktivität. Die Blockade GABAerger oder glutamaterger Neurotransmission hob die inhibitorische bzw. exzitatorische Aktivität auf. Dies legt den Schluss nahe, dass sowohl Interneurone wie Pyramidalzellen an der spontanen rhythmischen Aktivität beteiligt sind. / The subiculum plays a key role in processing memory information from the hippocampus to different cortical and subcortical brain regions. Subicular pyramidal cells are classified as regular firing or bursting cells according to their responses to supra-threshold depolarizing current pulses. Synaptic terminals arising from CA1 pyramidal cells do not function as a single compartment but show a specialized synaptic plasticity onto subicular pyramidal cells depending on the discharge properties of the synaptic target. Tetanic stimulation of CA1 axons caused a significantly stronger long-term potentiation (LTP) in bursting cells than in regular firing cells. Postsynaptic bursting was not necessary for the enhanced synaptic potentiation in bursting cells. The LTP in bursting neurons was independent of postsynaptic calcium, induced by presynaptic NR2B-containing autoreceptors and mediated via a adenylyl cylcase-cAMP-dependent signaling cascade. In pilocarpine-treated animals subicular LTP was impaired. A long-lasting increase in synaptic transmission could not be observed after titanic stimulation neither in regular firing cells nor in bursting cells. In human brain slices resected from patients from with drug-resistant temporal lobe epilepsy the subiculum displayed spontaneous rhythmic activity. In sclerotic but also in non-sclerotic hippocampal tissue the subiculum showed cellular and synaptic changes which suffice to generate spontaneous rhythmic activity that is correlated with the occurrence and frequency of interictal discharges recorded in the electroencephalograms of the corresponding patients.

Zielsetzung: Der Nachweis eines Apallischen Syndroms (APS) ist trotz der diagnostischen Kriterien der Multi Society Task Force on persistent vegetative state (MSTF) selbst für erfahrene Kliniker eine diagnostische Herausforderung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist, inwieweit etablierte neurologische Untersuchungstechniken die Anwendung der MSTF-Kriterien vereinfachen und so zur Diagnose des APS beitragen. Design: Prospektive diagnostische Studie Patienten: Von initial 24 Patienten mit der Differentialdiagnose eines APS wurden 16 Patienten endgültig in die Studie eingeschlossen und einer prospektiven klinischen Untersuchung unterzogen. Das Studienprotokoll umfasste die Untersuchung der spontanen Motorik sowie Reiz korrelierter motorischen Reaktionen, der Primitivreflexe, Habituation und der Okulomotorik. Ergebnisse: Die Diagnosekriterien der MSTF waren bei allen Patienten nachweisbar, die in die Studie eingeschlossenen wurden. Darüber hinaus wurde durch die Studie weitere, ebenfalls häufig auftretende klinischen Symptome identifiziert, die als Markersymptom für eine APS bewertet wurden: spontane Automatismen (N=12), periodisch-alternierende Augenbewegungen (N=12), startle Reaktion nach externer Reizung (N=10) und Spastik (N=9). Klinische Symptome, die erhaltene Bewusstseinsleistung voraussetzen wie reflektorische Sakkaden, Habituation, der optokinetische Nystagmus und Augenfolgebewegungen oder Symptome, die auf eine schwere Hirnstammschädigung hinweisen wie eine Dezerebrationshaltung, wurden als Ausschlusskriterien eines APS vorgeschlagen. Zusammenfassung: Die Erweiterung der MSTF-Diagnosekriterien um obligatorische und unterstützende Schlüsselsymptome sowie klar definierte Ausschlusskriterien erleichtert die klinische Differentialdiagnose des APS und führt zu einer größeren Diagnosesicherheit des Syndroms. / Objective: Although the Multi Society Task Force (MSTF) on persistent vegetative state (PVS) published diagnostic criteria ten years ago, differentiation of PVS from similar syndromes remains a diagnostic challenge. The aim of our study was the prospective identification of clinically assessable symptoms supplementary to the MSTF criteria which supports or rejects the diagnosis of a PVS and to reevaluate the parameters after 30 month. Design: Prospective diagnostic study Setting: The 90-bed department of Neurology of the University hospital of Berlin. Patients and participants: Out of 24 screened patients with the differential diagnosis PVS, 16 patients were finally included to the study and prospectively assessed by a clinical examination, comprising spontaneous and reflexive motor activities, primitive reflexes, habituation and eye movements. Measurements and results: Mandatory symptoms of the MSTF were found in all 16 patients. In addition, clinical features like spontaneous automatisms (n=12), periodic alternating gaze deviation (n=12), startle reaction to external stimuli (n=10), and spastic muscular tone (n=9) were found frequently and considered supportive for the diagnosis. In contrast to previous observations, periodic alternating eye movements and increased muscular tone were found more frequently in our patients. Symptoms linked to a preserved consciousness like reflexive visually guided saccades, habituation, an optokinetic nystagmus and eye tracking or symptoms indicating a severe functional impairment of the brainstem like a decerebrated posture were proposed as excluding PVS. Conclusion: The application of mandatory and supportive symptoms lead to a further improvement of diagnostic certainty in PVS, particular in patient presenting exceptional clinical phenomena. Clearly defined exclusive criteria prevent from misdiagnosis.

Die intratracheale Applikation von Perfluorcarbonen (PFC) in ungeschädigte Lungen, z.B. als Röntgenkontrastmittel und zur PFC-induzierten cerebralen Kühlung, wird derzeit diskutiert. Ob es aufgrund der Dichte und Sauerstofflöslichkeit der PFC zu einer Beeinflussung der cerebralen Oxygenierung und Hämodynamik durch die pulmonale PFC Applikation kommt, ist bisher unbekannt. Änderungen der Konzentration von cerebralem oxygeniertem und totalem Hb koennen mittels Near-infrared Spectroscopy gemessen werden. I.) Effekt durch die PFC-Applikation in gesunde Lungen neugeborener Ferkel: Es wurden zwei verschiedene Applikationsgeschwindigkeiten (30 ml PFC pro kg Körpergewicht als Bolusgabe versus 1,5 ml/min pro kg) und zwei Füllvolumen (30 versus 10 ml/kg) verglichen. Die Bolusgabe bewirkt einen sofortigen Abfall des PaO2 und der cerebralen Oxygenierung, bei langsamer Gabe des gleichen Volumens ist dies weniger ausgeprägt. Mit 10 ml/kg PFC fand sich nahezu keine Beeinflussung der Parameter. II.) Effekte der Änderung der FiO2 in PFC-gefüllten Lungen: Hierfür wurden Änderungen der FiO2 unter konventioneller Druckbeatmung vor PFC-Applikation und unter PFC-Füllung (30 oder 10 ml/kg PFC) verglichen. Beide PFC-Volumen (mit FiO2 1,0) bedingten PaO2-Werte wie unter CMV mit FiO2 von 0,5. Mit 30 ml/kg PFC kam es unter FiO2 von 0,5 zur Abnahme des cerebralen oxygenierten Hb. Zusammenfassend ergibt sich, dass die Applikation von 10 ml PFC/kg bevorzugt werden sollte. Bei kompletter Füllung der Lungen werden durch langsame Applikation cerebrale Nebenwirkungen minimiert. In PFC-gefüllten gesunden Lungen ist zum Erhalt der systemischen und cerebralen Oxygenierung die FiO2 zu erhöhen. / Intratracheal administration of perfluorochemicals (PFC) has been suggested for reasons other than respiratory insufficiency, such as pulmonary imaging and PFC-associated brain cooling. Due to their high density and oxygen solubility, PFC application has been described to affect systemic hemodynamics and oxygenation during liquid ventilation. Whether the PFC application into healthy lungs or changes in inspired oxygen fraction (FiO2) in PFC-filled healthy lungs affects cerebral hemodynamics is not known. Changes in the concentration of cerebral oxygenated and total Hb can be measured by near-infrared spectroscopy (NIRS). I.) Initial effects of PFC application into healthy lungs of newborn piglets: Two different filling modes (rapid versus slow) and two different filling volumes (slow filling of 30 versus 10 ml PFC/kg body weight) were compared. Rapid filling caused an immediate drop of systemic and cerebrale oxygenation, which was less prominent by filling 30 ml/kg PFC slowly. Almost no changes for all parameters were found with 10 ml kg/PFC. II.) Effects of variations in FiO2 in the PFC filled lungs of healthy piglets: Changes in FiO2 during conventional mechanical ventilation (CMV) prior to PFC-application and in the PFC-filled lungs (30 ml/kg or 10 ml/kg PFC) were compared. Both PFC-volumes (at a FiO2 of 1.0) caused PaO2-values that were similar to CMV with FiO2 of 0.5. In the 30 ml/kg PFC group a reduction of cerebral oxygenated Hb was found at FiO2 of 0.5. According to the data application of 10 ml/kg PFC should be preferred. If complete filling of the lung is needed, the slow administration of PFC minimizes cerebral side effects. In PFC- filled healthy lungs an increase in FiO2 is necessary to maintain systemic and cerebral oxygenation.