Shigellosis, or bacillary dysentery, is a rectocolitis caused by the gram-negative, enteroinvasive bacteria of the genus Shigella. Shigellosis still remains a major public health burden with an estimated 80 million cases of bloody diarrhoea and 700.000 deaths per year, primarily in children under the age of 5. Shigella disrupts, invades, and causes inflammatory destruction of the colonic epithelium in humans through virulence effectors secreted by the type III secretion apparatus (TTSA). In contrast to the Shigella-induced manipulation of the host innate immune response, the impact of Shigella on the adaptive immunity has been poorly studied thus far. In order to understand why the naturally induced protective humoral response requires several infections to be primed and is of short duration, the work presented here investigates if Shigella is able to directly interact with T cells. Indeed, it has been shown that Shigella was able to invade and proliferate inside T cells. Furthermore, Shigella was able to inhibit T cell migration through a TTSA effector. Moreover, the Shigella effector IpgD, a phosphoinositide 4-phosphatase that specifically dephosphorylates phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2) into phosphatidylinositol-(5)-monophosphate (PI(5)P), was identified as the effector responsible for the observed inhibition. It could be demonstrated that IpgD was responsible for a reduction of intracellular PIP2 levels in T cells. Further experiments showed a reduced level of phosphorylated ezrin, radixin and moesin (ERM) proteins in infected, as well as with IpgD transfected, T cells. The ERM protein family plays an imported role in signal transduction and motility and their activity is closely related to the binding of PIP2. Therefore, the low level of PIP2 leads to a dephosphorylation of the ERM proteins which inhibits T cells response to chemokine stimulation. Indeed, IpgD transfected T cells show a reduced ability to re-localise the ERM proteins upon chemokine stimulation. Targeting T cell motility, via TTSA effectors, could explain the low level of specific T cell priming during Shigella infection. This is the first report of Shigella induced manipulation of T cell function and on the inhibition of T cell migration by a bacterial effector. / Shigellose oder Bakterieruhr ist eine von Bakterien der Gattung Shigella ausgelöste Dysenterie Erkrankung des Dickdarms. Mit jährlich über 80 Millionen Fällen von blutigen Durchfällen und 700000 Todesfällen, hauptsächlich bei Kindern unter 5 Jahren, stellt Shigella immer noch ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Shigella destabilisiert das menschliche Dickdarmgewebe und dringt in dieses ein, wo es eine akute Entzündung auslöst, die das Gewebe weiterhin zerstört. Verursacht wird dies durch bakterielle Effektoren, die durch ein Type III Sekretionssytem (TTSA) sekretiert werden. Verglichen mit der Anzahl an Studien über die Manipulation der angeborenen Immunabwehr gibt es nur wenige Studien über die Interaktionen von Shigella mit dem adaptiven Immunsystem. Um zu verstehen, warum für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort mehrere Infektionen erforderlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob Shigella in der Lage ist, direkt mit TZellen zu interagieren. Es konnte gezeigt werden, dass Shigella in T-Zellen eindringen und sich vermehren kann. Darüber hinaus zeigt sich, dass Shigella in der Lage ist, durch TTSA-Effektoren die T-Zell-Migration zu hemmen. Der Shigella Effektor IpgD konnte als der für die Hemmung verantwortliche Effektor identifiziert werden. Bei IpgD handelt es sich um eine 4-Phosphoinositid-Phosphatase, die Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidyl-inositol-(5)- monophosphat (PI(5)P) dephosphoryliert. Es wurde deutlich, dass der Effektor IpgD, neben der Menge an PIP2, auch die Menge an phosphorylierten Ezrin, Radixin und Moesin (ERM) Proteinen in T-Zellen reduziert. Die ERM-Protein-Familie spielt in der Signaltransduktion und bei der Motilität von T-Zellen eine wichtige Rolle und ihre Phosphorylierung ist eng an die Bindung von PIP2 gekoppelt. Daher führt eine geringe Menge an PIP2 zu einer Dephosphorylierung der ERM-Proteine, was eine Stimulierung der T-Zellen durch Chemokine hemmt. In der Tat zeigten IpgDtransfizierte T-Zellen eine verminderte Fähigkeit zur Relokalisierung der ERM-Proteine nach einer Chemokine-Stimulation. In dieser Arbeit konnte erstmals die Manipulation von T-Zell-Funktionen durch Shigella und die Hemmung der T-Zell-Migration, ausgelöst durch einen bakteriellen TTSA-Effektor, gezeigt werden.

Diss. phil. I Zürich, 2007 (Austausch beschränkt). / Im Buchh.: Göttingen : Wallstein. Register. Literaturverz.

Das two-partner secretion-system (TPS-System) ist ein unter Gram-negativen Bakterien weit verbreiteter Weg der Proteinsekretion. Die als TpsA bezeichneten Exoproteine des TPS Systems benötigen ein spezifisches Partnerprotein (genannt TpsB) in Form eines kanalbildenden Transporters. Im sequenzierten Genom des Meningokokkenstammes MC58 finden sich fünf putative tpsA Gene, die als hemagglutinin/hemolysin-related protein (hrps) bezeichnete werden. Neben MC58 finden sich auch in den anderen sequenzierten Meningokokkenstämmen (FAM18, Z2491, alpha14) hrps. Diese weisen N-terminal Homologien zum filamentösen Hämagglutinin (FHA) von B. pertussis auf, das als TpsA-Protein des two-partner-secretion-system (TPS) aus der Zelle transportiert wird. In dieser Arbeit werden die hrps als hrpA Gene bzw. HrpA-Proteine bezeichnet. Alle sequenzierten Meningokokkenstämme verfügen über tpsB homologe Gene (hrpB), die jeweils in enger Nachbarschaft zu den hrpA Genen zu finden sind. Das Vorhandensein von hrpA und hrpB Genen deutet darauf hin, dass auch Meningokokken über ein funktionales TPS-System verfügen. Bei einer Dot-Blot-Analyse von 830 Meningokokkenstämmen aus einer bayerischen Trägerstudie mit Sonden spezifisch für die C-terminalen Bereiche der im Stamm MC58 gefundenen hrpA Gene hybridisierten 80% der ausgewerteten Stämme mit mindestens einer der Sonden. Stämme der hypervirulenten klonalen Komplexen (ST-8, ST-11, ST32, ST-44) zeigten sogar in über 99% eine positive Reaktion. Dagegen wiesen die nicht-hypervirulenten klonalen Komplexe zu 29% im Dot Blot kein hrpA auf, das homolog zu den hrpA Genen von Stamm MC58 ist, wobei es sich hierbei mehrheitlich (82%) um cnl Stämme handelte, so dass sich nur in 10% der untersuchten Kapsel-null-locus-Stämme (cnl) ein zu den hrpA Genen von MC58 homologes Gen nachweisen ließ. Mit der Hypothese, dass auch diese Stämme ein hrpA besitzen, welches sich im C-terimalen Anteil von denen des MC58 unterscheidet wurden in dieser Arbeit Dot Blots durchgeführt, deren Sonde spezifisch für das hrpB NMC0443 war. 97,6% der mit dieser Sonde untersuchten Stämme zeigten die Anwesenheit eines hrpB Homologs. Um die Vermutung zu bestätigen, dass allen hrpB Genen ein zugehöriges hrpA Gen benachbart liegt, wurden repräsentativ PCRs von häufigen klonalen Komplexen durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein TPS-System sowohl in den hypervirulenten als auch den nicht-hypervirulenten klonalen Komplexen der Meningokokken vorkommt. Die vielfältigen Funktionen von bereits untersuchten TpsA Proteinen sind zumeist mit der Pathogenität der Bakterien assoziiert. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Einfluss der HrpA Proteine auf die Adhäsion der Bakterien an humane Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine kapsellose, als auch eine kapsellose, LPS-trunkierte hrpA Deletionsmutante signifikant schlechter an Epithelzellen adhäriert als die parentalen Vergleichsstämme. Ebenso zeigten die analog durchgeführten Infektionsversuche mit der hrpB Deletionsmutante einen Adhärenzverlust, der jedoch nur für die unbekapselte und LPS trunkierte hrpB Deletionsmutante signifikant war. In dieser Arbeit ist es gelungen das HrpB Protein des Stammes 2120 in E. coli zu exprimieren und aufzureinigen, sodass die Entwicklung eines gegen HrpB gerichteten Antikörpers in Auftrag gegeben werden konnte. Mit Hilfe dieses Antikörpers sollen noch offene Fragen zur Synthese und dem Transport des HrpB Transportproteins beantwortet werden. Außerdem können weitere Untersuchungen zur Lage und Verteilung der HrpBs in der Meningokokkenmembran dazu beitragen, weiteren Aufschluss über die Komplexität von Pathogenität und Virulenz von N. meningitidis zu geben. / The two-partner secretion system (TPS sytem) is a widely distributed pathway for protein secretion in Gram-negative bacteria. The transport of the exoproteins, named TpsA requires a specific channel-forming transporter protein termed TpsB. The sequenced genome of the Neisseria meningitidis strain MC 58 harbors five putative tpsAs, annotated as hemagglutinin/hemolysin-related protein (hrps). In addition, there are hrps present in the sequenced strains FAM18, Z2491 and alpha14. These hrpAs show N-terminal sequence similarities to filamentous hemagglutinin (FHA) of B. pertussis, which represents the TpsA of the Bordetella TPS. According to their homology with FHA, the hrps are referred to as hrpA genes/ HrpA proteins (TpsA homologue), respectively. All sequenced strains of meningococci possess tpsB homologues genes (hrpB), closed to the hrpA genes, suggesting the presence of a functional TPS in N. meningitidis. A panel of 830 N. meningitidis isolated from healthy individuals was analyzed by dot blotting with specific probes for the C-terminal domain of strain MC58 hrpA genes. 80 % of the isolates were found to be positive for at least one of the probes. A positive signal could be demonstrated in over 99 % of the strains belonging to one of the known hypervirulent lineages (ST-8, ST-11, ST32, ST-44). Interestingly, the presence of a hrpA gene homologous to one of the MC58 hrpA genes could not be detected in 29 % of the non-hypervirulent lineages. Among those strains that did not hybridize with the probes, 82 % belonged to the clonal complex harboring the capsule null locus (cnl). We hypothesized that strains which were negative with the MC58 hrpA probes harbor undetected hrpA genes with C-terminal nucleotide sequences different from those present in strain MC58. Therefore, additional dot blots were performed with a probe specific for the highly conserved meningococcal hrpB gene NMC0443. Almost all strains (97,6%) hybridized with the probe specific for the hrpB gene. As genes for cognate HrpA protein and transporter protein are closely associated in known TPS systems, this hypothesis was tested by PCR of a selection of strains representing common clonal complexes. We showed that the TPS system is ubiquitously present in meningococci both in hypervirulent and non-hypervirulent lineages. Several TpsA proteins have been shown to contribute to virulence of bacteria. In this study we investigated the effect of HrpA proteins to adhesion of bacteria at epithelial cells. A hrpA deletion mutant displayed significantly reduced adherence to epithelial cells. This effect was observed in an unencapsulated background as well as unencapsulated background with truncated LPS. Similary designed studies with a hrpB deletion mutant resulted in reduced adherence, however only in the unencapsulated and LPS truncated background. In this study the HrpB protein was expressed and purified in E. coli and used for generation of an antiserum. This antiserum is available for further investigations concerning synthesis, transport, position and distribution of HrpB.

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Univ., Habil.-Schr. u.d.T.: Gradmann, Christoph: Medizin und Mikrobiologie in Deutschland 1870 - 1910--Heidelberg, 2001. / Literaturverz. S. 347 - [370].

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Das thermophile Bakterium Campylobacter jejuni gehört weltweit zu den häufigsten Erregern bakterieller Gastroenteritiden beim Menschen. Der Erreger wird hauptsächlich durch kreuzkontaminierte Lebensmittel, zumeist ausgehend von Geflügelprodukten, übertragen. Aufgrund seines weiten Wirtsspektrums weist C. jejuni eine hohe genetische Vielfalt unter seinen Isolaten auf. Mit dem Ziel herauszufinden, ob das Auftreten spezifischer Markergene mit bestimmten klonalen Komplexen korreliert, wurden im Rahmen dieser Arbeit 266 C. jejuni-Isolate unterschiedlicher Herkunft (Mensch, Rind, Huhn, Pute) molekularbiologisch auf das Vorhandensein von zehn Virulenz-assoziierten Faktoren: cj1321-1326 (ein sechs Gen umfassender Komplex zur Flagellin-O-Glykolisierung), ciaB (Campylobacter-Invasions-Antigen B), cdtB (cytolethales distendierendes Toxin, CDT) Untereinheit B, fucP (L-Fucose-Permease), cj0178/cj0755 (Eisentransportprotein), ceuE (Enterochelin bindendes Protein), pldA (Phospholipase A der äußeren Membran) und cstII/cstIII (Lipooligosaccharid-Sialyltransferase) untersucht. In einer vorrangegangen Studie von ZAUTNER et al. 2011 wurden bereits 266 C. jejuni-Isolate durch Kombination von MLST und den sechs genetischen Metabolismus-assoziierten Markern: ansB (periplasmatische Asparaginase), dmsA (Untereinheit A der Dimethyl-sulfoxid-Oxidoreduktase), ggt (γ-Glutamyl-Transpeptidase), cj1585c (Oxidoreduktase), cjj811-76-1367/71 (Serin-Protease) und tlp7m+c (transducer-like Protein 7 (Ameiseisäure-spezifische Chemotaxisrezeptor), Heterodimer aus Cj0951c und Cj0952c) in sechs Gruppen unterteilt. Zur Konkretisierung dieser bestehenden Gruppendefinitionen und zur Identifikation der Gruppen mit dem höchsten gesundheitsgefährdenden Potential wurden dieselben 266 Isolate nun weiter charakterisiert. Vor allem die genetischen Marker cj1321-1326; fucP; cj0178 und cj0755 sind weitestgehend miteinander assoziiert und splitten die Testpopulation in 2 Haupt- und 7 Untergruppen und bestätigen damit die alte Gruppendefinition. Abgesehen vom Virulenz-assoziierten Marker pldA zeigen alle ermittelten genetischen Marker signifikante Unterschiede unter den verschiedenen MLST-Sequenztypen. Basierend auf den Daten der Arbeit konnte ein Biotyp von C. jejuni-Isolaten, der durch die Präsenz von ansB, dmsA, ggt und die Absenz von cj1321-1326; fucP; cj0178, cj0755, cj1365c, cj1585c sowie cstII/cstIII charakterisiert ist, bestimmt werden. Isolate dieser Gruppe gehören hauptsächlich den MLST-CC 22, 42, 45, 283 an und sind eher an eine Persistenz in der Umwelt-adaptiert. Zum Wachstum nutzen die Stämme dieser Gruppe einen erweiterten Aminosäurestoffwechsel sowie einen alternativen anaeroben Stoffwechselweg (dmsA- positiv). Hingegen kann aufgrund des fehlenden fucP keine L-Fucose verstoffwechselt werden. Außerdem sind die Stämme dieser Gruppe toleranter gegen oxidativen Stress und besser frostbeständig. Die jahreszeitliche Prävalenz ist am stärksten im Frühsommer. Dieser Umwelt- aber schlechter Wirts-adaptierte Biotyp wird mit mehr Campylobacteriosen beim Menschen in Verbindung gebracht, ist häufiger mit blutigen Stühlen und Hospitalisierungen assoziiert und ist somit hochgradiger virulent für den Menschen. Im Gegensatz dazu ist die zweite Hauptgruppe stärker an tierische Wirte, insbesondere Säuger, adaptiert und in der Lage, L-Fucose aus Mucosa oder Milch zu metabolisieren. Isolate dieses Biotyps tolerieren für C. jejuni extreme Temperaturen besser und zeigen eine relativ gleichmäßige Prävalenz im Jahresverlauf. Alle fünf bekannten C. jejuni-Eisentransportsysteme sind detektierbar, ebenso die Marker cj1321-1326, cj1365c, cj1585c und cstII und/oder cstIII. Die vorherrschenden MLST-CC sind CC 21, 48, 61 und 20. Dieser besser Wirts-adaptierte Biotyp wird mit weniger schweren Campylobacteriosen in Zusammenhang gebracht. Alle anderen Gruppen stellen einen sukzessiven evolutionären Übergang an Markergen-Kombinationen zwischen diesen beiden Hauptgruppen dar.

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