The aim of this thesis was to find optimal anticancer regimen of therapy, based on a naturally occuring polysaccharide laminarin. It was studied on the Mus musculus skin melanoma B16-F10. There were explored an ajuvant effect of LTA. Mixture of laminarin with LPS was applied with various anchorings and was tryed out the possible replacement of LPS. Using the flow cytometry there were determined progress of immune cells during application. This therapy resulted in reduction of tumor volume and the prolongation of overall survival.

These days, treatment of melanoma patients relies on targeted therapy with BRAF/MEK inhibitors and on immunotherapy. About half of all patients initially respond to existing therapies. Nevertheless, the identification of alternative therapies for melanoma patients with intrinsic or acquired resistance is of great importance. In melanoma, antioxidants play an essential role in the maintenance of the redox homeostasis. Therefore, disruption of the redox homeostasis is regarded as highly therapeutically relevant and is the focus of the present work. An adequate supply of cysteine is essential for the production of the most important intracellular antioxidants, such as glutathione. In the present work, it was investigated whether the depletion of cysteine and glutathione is therapeutically useful. Depletion of glutathione in melanoma cells could be achieved by blocking cysteine supply, glutathione synthesis, and NADPH regeneration. As expected, this led to an increased level of reactive oxygen species (ROS). Surprisingly, however, these changes did not impair the proliferation and survival of the melanoma cells. In contrast, glutathione depletion led to cellular reprogramming which was characterized by the induction of mesenchymal genes and the repression of differentiation markers (phenotypic switch). This was accompanied by an increased migration and invasion potential which was favored by the induction of the transcription factor FOSL1. To study in vivo reprogramming, Gclc, the first and rate-limiting enzyme in glutathione synthesis, was knocked out by CRISPR/Cas9 in murine melanoma cells. The cells were devoid of glutathione, but were fully viable and showed a phenotypic switch, the latter only in MITF-expressing B16F1 cells and not in MITF-deficient D4M3A.781 cells. Following subcutaneous injection into immunocompetent C57BL/6 mice, Gclc knockout B16F1 cells grew more aggressively and resulted in an earlier tumor onset than B16F1 control cells. In summary, this work demonstrates that inhibition of cysteine supply and thus, glutathione synthesis leads to cellular reprogramming in melanoma. In this context, melanoma cells show metastatic capabilities, promoting a more aggressive form of the disease. / Die Behandlung von Melanompatienten beruht heutzutage auf der gerichteten Therapie mit BRAF/MEK Inhibitoren und auf der Immuntherapie. Circa die Hälfte aller Patienten spricht zunächst auf die vorhandenen Therapien an. Dennoch ist die Identifizierung alternativer Therapieansätze für Melanompatienten mit intrinsischer oder erworbener Resistenz von großer Wichtigkeit. Im Melanom spielen Antioxidanzien eine essenzielle Rolle zur Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase. Eine Störung der Redox-Homöostase wird daher als therapeutisch hochrelevant betrachtet und steht im Fokus der vorliegenden Arbeit. Eine ausreichende Versorgung mit Cystein ist essenziell zur Produktion der wichtigsten intrazellulären Antioxidanzien wie dem Glutathion. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Depletion von Cystein und Glutathion therapeutisch nützlich ist. Eine Depletion von Glutathion in Melanomzellen konnte durch eine Blockierung der Cysteinversorgung, der Glutathionsynthese und der NADPH-Regeneration erreicht werden. Dies führte wie erwartet zu einem erhöhten Level von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Überraschenderweise beeinträchtigten diese Veränderungen jedoch nicht die Proliferation und das Überleben der Melanomzellen. Im Gegenteil führte die Glutathion-Depletion zu einer zellulären Reprogrammierung, die durch die Induktion mesenchymaler Gene und der Repression von Differenzierungsmarkern gekennzeichnet war (phenotypic switch). Dies ging mit einem erhöhten Migrations- und Invasionspotential einher, welches durch die Induktion des Transkriptionsfaktors FOSL1 begünstigt wurde. Für die Untersuchung der Reprogrammierung in vivo wurde Gclc, das erste und geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Glutathionsynthese, mittels CRISPR/Cas9 in murinen Melanomzellen ausgeknockt. Die Zellen waren voll lebensfähig und zeigten erwartungsgemäß reduzierte Glutathionlevel und einen phenotypic switch. Letzterer zeigte sich jedoch nur in MITF-exprimierenden B16F1 Zellen und nicht in MITF-defizienten D4M3A.781 Zellen. Nach subkutaner Injektion in immunkompetente C57BL/6 Mäuse wuchsen die Gclc-knockout B16F1 Zellen aggressiver und führten zu einer früheren Tumorentstehung als B16F1 Kontrollzellen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Hemmung der Cysteinversorgung und somit der Glutathionmenge im Melanom zu einer Reprogrammierung führt, bei der Melanomzellen metastasierende Fähigkeiten aufweisen und somit zu einer aggressiveren Form der Erkrankung führen.

In dieser Dissertation wird der MEK5/ERK5- Signalweg als möglicher Angriffspunkt in der zielgerichteten Melanomtherapie identifiziert. Die Adressierung von ERK5 bietet eine Alternative, um einer Resistenzentwicklung gegenüber Inhibitoren des MAPK- Signalwegs entgegenzuwirken. Das maligne Melanom ist ein hochaggressiver Tumor mit steigender Inzidenz. Zunehmende Sonnenstunden im Rahmen des Klimawandels mit erhöhter Belastung der Haut durch UV-Strahlung werden die Problematik des malignen Melanoms für den Menschen in den nächsten Jahren weiter zunehmen lassen. Die Aktivierung des MEK5/ERK5- Signalwegs scheint eine Reaktion von Tumorzellen auf Therapiestress zu sein. Diese Aktivierung liefert den Melanomzellen einen Überlebensvorteil und verhindert ein langfristiges Therapieansprechen. ERK5 beeinflusst den Zellzyklus von Melanomzellen und ist somit möglicherweise von wichtiger Bedeutung in der Tumorgenese des malignen Melanoms. Patienten mit NRAS- Mutation profitieren auffallend weniger von einer gezielten MEKi-Therapie als solche mit BRAF Mutation. Für ersteres Patientenkollektiv steht aktuell lediglich die Immuntherapie zur Verfügung, wodurch oft nur ein kurzes, progressionsfreies Intervall erreicht werden kann und die Patienten häufig unter schweren Nebenwirkungen leiden. Grund für die problematische Behandlung könnte das häufige Auftreten einer basalen ERK5- Aktivierung in NRAS- mutierten Melanomen sein. Diese Arbeit liefert eine positive Prognose über den Nutzen einer ERK5- Inhibition als Erweiterung des Therapieschemas. Diese These gilt auch für Melanompatienten mit einer BRAF- Mutation. Patienten, die an einem malignen Melanom erkrankt sind, weisen zu 80% eine Mutation in einem dieser beschriebenen Onkogene auf. Die Arbeit lässt darauf schließen, dass eine ERK5- Inhibition in der Therapie von beiden Gruppen erfolgreich sein könnte und somit das Leben nahezu aller Melanompatienten betrifft. / In this thesis, targeting the MEK5/ERK5- pathway is identified as a possible treatment option for maligant melanoma in order to prevent the development of resistances against inhibitors of the MAPK- pathway. The malignant melanoma is a highly aggressive tumor with an increasing incidence. A rising amount of sun exposure due to climate change will lead to increasing skin damage among the population and thus the malignant melanoma may emerge as an important medical problem throughout the following decade. The activation of the MEK5/ERK5 pathway seems to be a cellular response to therapeutic stress. It therefore results in sustained proliferation and survival in melanoma cells and prevents an efficiant therapy in the longterm. ERK5 has influence on the cell cycle progression of melanoma cells and could be of utmost importance for the tumorigenesis in malignant melanoma. Patients suffering from NRAS- mutant melanoma benefit remarkably less from MAPK-pathway targeting regimens than those with BRAF- mutation. In these cases immunotharpy remains as the only valuable treatment option yet barely achieving a short progression free survival with severe side effects. The obstacle of effective therapy could be the frequently found occurrence of a basal ERK5- activity especially observed in NRAS- mutant melanoma cells. Our data imply that MEKi/ERK5i co-treatment could provide a new therapeutic approach as an adjunct to targeted therapy of malignant melanoma improving its overall effectiveness. This discovery does not only apply for NRAS- mutant melanoma but also for patients with BRAF- mutation. In 80% of malignant melanoma the driver mutation can be found in one of these two oncogenes suggesting the majoryty of melanoma patients might benefit from MEK5/ERK5- Inhibition.

Das maligne Melanom nimmt als Tumorerkrankung mit hoher Metastasierungsrate und steigenden Inzidenzraten bei höchster Mortalität aller Hauttumoren eine zunehmende Bedeutung in der modernen Onkologie ein. Frühzeitige Diagnosemöglichkeiten und moderne Behandlungen konnten das Überleben der Patienten bereits erheblich verbessern. Jedoch besteht nach wie vor Bedarf an geeigneten Modellen, um die Melanomprogression vollständig zu verstehen und neue wirksame Therapien zu entwickeln. Hierfür werden häufig Tiermodelle verwendet, diese spiegeln jedoch nicht die menschliche Mikroumgebung wider. Zweidimensionalen Zellkulturen fehlen dagegen entscheidende Elemente der Tumormikroumgebung. Daher wurde in dieser Arbeit ein dreidimensionales epidermales Tumormodell des malignen Melanoms, welches aus primären humanen Keratinozyten und verschiedenen Melanomzelllinien besteht, entwickelt. Die eingesetzten Melanomzelllinien variieren in ihren Treibermutationen, wodurch das Modell in der Lage ist, Wirkstoffe zu untersuchen, die spezifisch auf diese Mutationen wirken. Mit Techniken des Tissue Engineerings konnte ein dreidimensionales Hautmodell aufgebaut werden, das alle charakteristischen Schichten der Epidermis aufweist und im Bereich des stratum basale Melanomcluster ausbildet. Diese reichen je nach Größe und Ausdehnung bis in suprabasale Epidermisschichten hinein. Die Tumor-Histopathologie, der Tumorstoffwechsel sowie tumorassoziierte Proteinsekretionen ließen sich im in vitro Modell nachweisen. Darüber hinaus konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem einzelne Zellen aus den Modellen reisoliert werden können. Dies ermöglichte es, den Proliferationszustand innerhalb des jeweiligen Modells zu charakterisieren und die Wirkung von Antitumortherapien gezielt zu bewerten. Die Anwendbarkeit als Testsystem im Bereich der Tumortherapeutika wurde mit dem in der Klinik häufig verwendeten v-raf-Maus-Sarkom-Virus-Onkogen-Homolog B (BRAF)-Inhibitor Vemurafenib demonstriert. Der selektive BRAF-Inhibitor reduzierte erfolgreich das Tumorwachstum in den Modellen mit BRAF-mutierten Melanomzellen, was durch eine Verringerung der metabolischen Aktivität, der proliferierenden Zellen und des Glukoseverbrauchs gezeigt wurde. Für die Implementierung des Modells in die präklinische Therapieentwicklung wurde B-B-Dimethylacrylshikonin, ein vielversprechender Wirkstoffkandidat, welcher einen Zellzyklusarrest mit anschließender Apoptose bewirkt, im Modell getestet. Bei einer Anwendung der Modelle im Bereich der Testung topischer Behandlungen ist eine Barrierefunktion der Modelle notwendig, die der in vivo Situation nahe kommt. Die Barriereeigenschaften der Hautäquivalente wurden durch die Melanomzellen nachweislich nicht beeinflusst, sind aber im Vergleich zur in vivo Situation noch unzureichend. Eine signifikante Steigerung der Hautbarriere konnte durch die Bereitstellung von Lipiden und die Anregung hauteigener Regenerationsprozesse erreicht werden. Über den Nachweis des transepidermalen Wasserverlusts konnte eine Messmethode zur nicht-invasiven Bestimmung der Hautbarriere etabliert und über den Vergleich zur Impedanzspektroskopie validiert werden. Hierbei gelang es, erstmals die Korrelation der Hautmodelle zur in vivo Situation über ein solches Verfahren zu zeigen. Das entwickelte epidermale Modell konnte durch die Integration eines dermalen Anteils und einer Endothelzellschicht noch weiter an die komplexe Struktur und Physiologie der Haut angepasst werden um Untersuchungen, die mit der Metastierung und Invasion zusammenhängen, zu ermöglichen. Die artifizielle Dermis basiert auf einem Kollagen-Hydrogel mit primären Fibroblasten. Eine dezellularisierte Schweinedarmmatrix ließ sich zur Erweiterung des Modells um eine Endothelzellschicht nutzen. Dabei wanderten die primären Fibroblasten apikal in die natürliche Schweindarmmatrix ein, während die Endothelzellen basolateral eine geschlossene Schicht bildeten. Die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle sind in der Lage, die Vorhersagekraft der in vitro Modelle und die in vitro - in vivo Korrelation zu verbessern. Durch die Kombination des Melanommodells mit einer darauf abgestimmten Analytik wurde ein neuartiges Werkzeug für die präklinische Forschung zur Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen geschaffen. / Malignant melanoma, as a tumor disease with a high metastasis rate and rising incidence rates with the highest mortality of all skin tumors, is assuming increasing importance in modern oncology. Early diagnosis and modern treatments significantly improved patient survival. There is still an unmet need for appropriate models to fully understand melanoma progression and to develop new effective therapies. Animal models are widely used but do not reflect the human microenvironment, while two-dimensional cell cultures lack crucial elements of this tumor microenvironment. Therefore, a three-dimensional epidermal tumor model of malignant melanoma consisting of primary human keratinocytes and various melanoma cell lines was developed in this work. The melanoma cell lines vary in their driver mutations, enabling the model to investigate compounds specifically designed to target one mutation. Tissue engineering techniques were used to generate a three-dimensional skin model that shows all characteristic layers of the epidermis and forms melanoma clusters in the stratum basale. Depending on size and extension, these extend into suprabasal epidermal layers. Tumor histopathology, tumor metabolism, and tumor-associated protein secretions could be demonstrated in the in vitro model. In addition, a protocol could be developed to reisolate single cells from the models. This made it possible to characterize the proliferation state within the respective model and to specifically evaluate the effect of antitumor therapies. Applicability as a test system in the field of tumor therapeutics was demonstrated with the v-raf mouse sarcoma virus oncogene homolog B (BRAF) inhibitor commonly used in the clinic. This selective BRAF inhibitor successfully reduced tumor growth in models with BRAF-mutated melanoma cells, indicated by a reduction in metabolic activity, proliferating cells, and glucose consumption. For the implementation of the model in preclinical development, B-B-dimethylacrylshikonin, a promising drug candidate, which induces cell cycle arrest followed by apoptosis, was tested in the model. An application of the models in the field of testing topical treatments requires a barrier function of the models close to the in vivo situation. The barrier properties of the skin equivalents were demonstrably not influenced by the melanoma cells, but are still insufficient compared to the in vivo situation. A significant increase in the skin barrier could be achieved by providing lipids and stimulating the skin's own regeneration processes. A measurement method for the non-invasive determination of the skin barrier was established by detection of transepidermal water loss and validated by comparison with impedance spectroscopy. For the first time, the correlation of the skin models to the in vivo situation was demonstrated by such a method. The developed epidermal model could be further adapted to the complex structure and physiology of the skin by integrating a dermal portion and an endothelial cell layer to allow studies related to metastasis and invasion. The artificial dermis is based on a collagen hydrogel with primary fibroblasts. A decellularized porcine intestinal matrix could be used to extend the model with an endothelial cell layer. Here, the primary fibroblasts migrated apically into the natural porcine intestinal matrix, while the endothelial cells formed a closed layer basolaterally. The tissue models developed in this work are able to improve the predictive power of the in vitro models and the in vitro - in vivo correlation. By combining the melanoma model with matched analytics, a novel tool for preclinical research for testing of pharmaceutical agents was established.

Up to date, only four cases of primary intradural extramedullary spinal cord melanoma (PIEM) have been reported. No previous reports have described a case of PIEM located in the lower thoracic spine with long-termfollow-up. Purpose. Demonstrating an unusual, extremely rare case of melanoma manifestation. Study Design. Case report. Methods. We report a case of a 57-year-old female suffering from increasing lower extremity pain, left-sided paresis, and paraesthesia due to spinal cord compression caused by PIEM in the lower thoracic spine. Results. Extensive investigation excluded other possible primary melanoma sites and metastases. For spinal cord decompression, the tumor at level T12 was resected, yet incompletely. Adjuvant radiotherapy was administered two weeks after surgery. The patient was recurrence-free at 104 weeks after radiotherapy but presents with unchanged neurological symptoms. Conclusion. Primary intradural extramedullary melanoma (PIEM) is extremely rare and its clinical course is unpredictable.

Bc.Veronika Hrabcová BRAF mutations in metastatic malignant melanoma. Diploma thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Healthcare bioanalytics - Specialist in Laboratory Methods Backround: Melanoma is malignant disease with increasing incidency. Treatment of advanced stage of melanoma is still limited. With a progress of knowledge in genetics and tumorigenesis, the incidence of mutated BRAF protein was observed at 50 % of melanomas. In 80-90 % mutated melanomas contain BRAF V600E mutation. The aim of study was to establish a suitable molecular biological method for the diagnosis of mutations in codon V600 BRAF. Methods: Cobas 4800 BRAF V600 mutation test and BRAF StripAssay test were used to analyze DNA. Cobas 4800 BRAF V600 mutation test is based on PCR using TaqMan probes designed for the wild-type and mutant BRAF V600E sequence. BRAF StripAssay test is based on PCR amplification with biotinylated primers and subsequent hybridization of the stripped with allele-specific oligonucleotide probes. Examined DNA samples were derived from 35 patients with advanced malignant melanoma or from archive of laboratory. Results: BRAF V600 mutation was detected in approximately half of the tumors, consistent with the results of other studies. In comparison methods Cobas test...

Fish of the genus Xiphophorus belong to the oldest animal models in cancer research. The oncogene responsible for the generation of spontaneous aggressive melanoma encodes for a mutated epidermal growth factor receptor (Egfr) and is called xmrk for Xiphophorus melanoma receptor kinase. Xmrk constitutive activation mechanisms and subsequent signaling pathways have already been investigated and charaterized but it is still unknown if Egfr ligands may also play a role in Xmrk-driven melanoma formation. To investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I firstly analyzed the evolution of teleost and tetrapod Egfr/Egfr ligand systems. I especially focused on the analysis on the medaka fish, a closely related species to Xiphophorus, for which the whole genome has been sequenced. I could identify all seven Egfr ligands in medaka and could show that the two teleost-specific Egfr copies of medaka display dissimilar expression patterns in adult tissues together with differential expression of Egfr ligand subsets, arguing for subfunctionalization of receptor functions in this fish. Our phylogenetic and synteny analyses supported the hypothesis that only one gene in the chordate ancestor gave rise to the diversity of Egfr ligands found in vertebrate genomes today. I also could show that the Egfr extracellular subdomains implicated in ligand binding are not evolutionary conserved between tetrapods and teleosts, making the use of heterologous ligands in experiments with fish cells debatable. Despite its well understood and straight-forward process, Xmrk-driven melanomagenesis in Xiphophorus is problematic to further investigate in vivo. Our laboratory recently established a new melanoma animal model by generating transgenic mitf::xmrk medaka fishes, a Xiphophorus closely related species offering many more advantages. These fishes express xmrk under the control of the pigment-cell specific Mitf promoter. During my PhD thesis, I participated in the molecular analysis of the stably transgenic medaka and could show that the Xmrk-induced signaling pathways are similar when comparing Xiphophorus with transgenic mitf::xmrk medaka. These data together with additional RNA expression, protein, and histology analyses showed that Xmrk expression under the control of a pigment cell-specific promoter is sufficient to induce melanoma in the transgenic medaka, which develop very stereotyped tumors, including uveal and extracutaneous melanoma, with early onset during larval stages. To further investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I made use of two model systems. One of them was the above mentioned mitf::xmrk medaka, the other was an in-vitro cell culture system, where the EGF-inducible Xmrk chimera HERmrk is stably expressed in murine melanocytes. Here I could show that HERmrk activation strongly induced expression of amphiregulin (Areg) and heparin-binding EGF-like growth factor (Hbegf) in melanocytes. This regulation was dependent on the MAPK and SRC signaling pathways. Moreover, upregulation of Adam10 and Adam17, the two major sheddases of Egfr ligands, was observed. I also could demonstrate the functionality of the growth factors by invitro analyses. Using the mitf::xmrk medaka model I could also show the upregulation of a subset of ligand genes, namely egf, areg, betacellulin (btc) and epigen (epgn) as well as upregulation of medaka egfrb in tumors from fish with metastatic melanoma. All these results converge to support an Xmrk-induced autocrine Egfr ligand loop. Interestingly, my in-vitro experiments with conditioned supernatant from medaka Egf- and Hbegf-producing cells revealed that not only Xiphophorus Egfrb, but also the pre-activated Xmrk could be further stimulated by the ligands. Altogether, I could show with in-vitro and in-vivo experiments that Xmrk is capable of inducing a functional autocrine Egfr ligand loop. These data confirm the importance of autocrine loops in receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent cancer development and show the possibility for a constitutively active RTK to strengthen its oncogenic signaling by ligand binding. / Fische der Gattung Xiphophorus gehören zu den ältesten Tiermodellen für die Krebsforschung. Das im Xiphophorus-System für die Melanomentstehung verantwortliche Onkogen codiert für eine mutierte Version des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (Egfr) und wird xmrk (für “Xiphophorus melanoma receptor kinase”) genannt. Die konstitutiven Aktivierungsmechanismen dieses Rezeptors und die daraus resultierenden aktivierten Signalwege sind bereits gut untersucht und charakterisiert. Dennoch war bisher unbekannt, ob Egfr-Liganden auch eine Rolle bei der Xmrk-vermittelten Melanomentstehung spielen. Um eine potenzielle Rolle dieser Egfr-Liganden im Xmrk-induzierten Melanom zu erforschen, habe ich zunächst die Evolution des Egfr/Egfr-Liganden-Systems in Teleostiern und Tetrapoden untersucht. Hierfür fokussierte ich mich im besonderen auf den Medaka- Fisch, der zum einen eine nahe evolutionäre Verwandtschaft zu Xiphophorus aufweist und zum anderen – im Gegensatz zu Xiphophorus - ein komplett sequenziertes und gut annotiertes Genom besitzt. Ich konnte alle sieben Egfr-Liganden in Medaka identifizieren und konnte weiterhin zeigen, dass die zwei Teleost-spezifischen Egfr-Kopien dieses Fisches ein unterschiedliches Expressionsmuster in adulten Geweben aufweisen, welches außerdem mit unterschiedlicher Egfr-Liganden-Expression einherging. Diese Daten sprechen für eine Subfunktionalisierung der Egfr-Funktionen in Medaka. Unsere phylogenetischen und Syntenie-Analysen unterstützen die Hypothese, dass nur ein einziges Egfr-Liganden-Gen des Chordaten-Vorfahren der genetische Ursprung für die zahlreichen Egfr-Liganden-Gene, die in heutigen Vertrebraten zu finden sind, darstellt. Ich konnte weiterhin zeigen, dass die an der Ligandenbindung beteiligten Domänen des Egfr nicht zwischen Tetrapoden und Teleostiern konserviert sind. Diese Daten sprechen somit gegen die Verwendung heterologer Liganden in Zellkulturexperimenten mit Fischzellen. Trotz der gut verstandenen Konsequenzen einer Xmrk-Expression auf die Pigmentzelle lässt sich die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung in Xiphophorus relativ schwer in vivo untersuchen. In unserem Labor wurde daher kürzlich ein neues Tiermodell für Melanome entwickelt. Dabei handelt es sich um einen mitf::xmrk-transgenen Medaka. Diese Fische exprimieren xmrk unter der Kontrolle des Pigmentzell-spezifischen Mitf-Promoters. Während meiner Doktorarbeit trug ich zur molekularen Analyse der stabil transgenen Tiere bei und konnte zeigen, dass die Xmrk-vermittelte Signalgebung in mitf::xmrk-Medakas der von Xmrk-exprimierenden Xiphophorus-Fischen gleicht. Diese Daten, zusammen mit weiteren RNA-Expressions-, Protein- und histologischen Analysen, zeigten, dass die Expression von xmrk unter der Kontrolle eines Pigmentzellspezifischen Promoters ausreichend für die Melanomentstehung in Medaka ist. Eine Besonderheit dieses Melanommodelles ist die auffallend stereotype Tumorentstehung. Der Beginn der Hyperpigmentierung wird bereits in frühen Larvenstadien sichtbar und führt – je nach Fischlinie – anschließend zuverlässig zu extrakutanen Pigmentzelltumoren oder invasiven bzw. uvealen Melanomen. Um eine potenzielle Funktion der Egfr-Liganden für Xmrk-induzierte Melanome zu untersuchen, machte ich mir zwei Modellsysteme zunutze. Eines der beiden Modelle war der bereits oben erwähnte mitf::xmrk-transgene Medaka, das andere war ein in-vitro- Zellkultursystem, bei dem die EGF-induzierbare Xmrk-Chimäre HERmrk stabil in murinen Melanozyten exprimiert wird. Hier konnte ich zeigen, dass HERmrk-Aktivierung zu einer starken Genexpression der EGFR-Liganden Amphiregulin (Areg) und Heparin-binding EGFlike growth factor (Hbegf) in Melanozyten führte. Diese Regulierung war abhängig von den MAPK- und SRC-Signalwegen. Weiterhin wurde eine Induktion von Adam10 und Adam17, den zwei bedeutsamsten Proteasen zur Freisetzung von EGFR-Liganden (“Sheddasen”), festgestellt. Ich konnte die Funktionalität der so sezernierten Liganden durch in-vitro- Experimente nachweisen. Anhand des mitf::xmrk Medaka-Modelles konnte ich ebenfalls zeigen, dass sowohl mehrere Egfr-Ligandengene, nämlich egf, areg, betacellulin (btc) und epigen (epgn), als auch egfrb in Tumoren von Medaka-Fischen mit metastatischen Melanomen heraufreguliert wurden. All diese Daten lassen auf einen durch Xmrk induzierten autokrinen EGFR-Liganden-Loop schließen. Interessanterweise zeigte sich durch in-vitro- Experimente mit konditioniertem Überstand von Medaka Egf- und Hbegf-produzierenden Zellen, dass nicht nur Xiphophorus Egfrb, sondern auch das bereits aktivierte Xmrk durch beide Liganden weiter stimuliert werden konnte. Zusammengefasst zeigen meine in-vitro- und in-vivo-Daten, dass Xmrk in der Lage ist, einen funktionalen autokrinen Egfr-Liganden-Loop zu induzieren. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung autokriner Loops in Rezeptortyrosinkinasen (RTK)-abhängiger Tumorentstehung und zeigt auf, dass selbst die onkogene Signalgebung prädimerisierter RTKs durch Ligandenbindung verstärkt werden kann.

T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht. / Cellular immune responses are initiated by direct interaction of naïve T cells with professional antigen presenting cells, i.e., dendritic cells. In general, this interaction takes place in secondary lymphoid organs: immature dendritic cells capture antigen in the periphery, and while homing to the secondary lymphoid organs they mature and process the antigen. In these organs they present peptides derived from the antigen together with co-stimulatory molecules to the naïve T cells and thereby initiate an antigen-specific T cell response. In the present work we tested if situations can be created allowing priming outside secondary lymphoid organs. To this end, a murine model in which lymphotoxin-alpha was specifically accumulated at the tumor site and a human model where in vitro generated, matured and antigen pulsed dendritic cells were injected intradermal into the patients were investigated. In the murine model the accumulation of lymphotoxin-alpha at the tumor site led to the eradication of the tumor. This therapeutic success was mediated by T cells and associated with the induction of a tertiary lymphoid tissue characterized by compartmentalized T and B cell aggregates and the presence of high endothelial venules. Moreover, with dendritic cells and naïve T cells present in these tissues requirements for in loco priming were fulfilled. Indeed, targeted lymphotoxin-alpha enlarged the T cell-infiltrate within the tumor. In vitro assays demonstrated the tumor-specificity of the therapy-induced infiltrate. In the human model skin biopsies taken from melanoma patients receiving dendritic cell based vaccination and participating at a clinical I study were investigated. The patients provided informed consent to participate in this experimental procedure and to donate skin biopsies for immunological monitoring. Skin biopsies were taken from the injection sites in which autologous, in vitro generated, maturated and antigen-pulsed dendritic cells were injected. Several reports including one about patients from the present patient cohort demonstrated the induction and/or enhancement of tumor specific T cell responses subsequent to dendritic cells based vaccination therapy. Our analysis demonstrated that most of the injected dendritic cells were entrenched at the injection site. The mere presence of mature dendritic cells in the skin caused the induction of high endothelial venules. In case the dendritic cells were pulsed with antigen the T cell infiltrate was enlarged and consisted both of naïve and central memory T cells. These cells were presumably attracted by the overexpression of the T cell attractant chemokines DC-CK1 and SDF-1 leading to an oligoclonal T cell infiltrate composed partially of tumor specific T cells. As T cell clones detected within the injections sites were not present among the peripheral blood lymphocytes, these clones were at least expanded in the injection sites. Notably, one clone could be detested in metastases of one patient excised after the vaccination. In both models manipulation of the microenvironment, i.e. targeting lymphotoxin-alpa to the tumor or injecting mature dendritic cells into the skin, respectively, induced structures like high endothelial venules which should enable in loco priming. Accordingly, these changes induced a tumor antigen specific T cell infiltrate. Thus, these results imply that T cells can be primed outside of secondary lymphoid tissues. Generally, the contact between mature, antigen presenting dendritic cells and the respective antigen specific T cells should be the only necessity for priming. Notably, the possibility of in vitro priming sustains this thesis. In vivo secondary lymphoid organs enable this contact. The present work, however, demonstrates that this contact can also take place in different tissue caused by manipulation of the respective microenvironment.

Melanoma arises from the malignant transformation of melanocytes and is one of the most aggressive forms of human cancer. In fish of the genus Xiphophorus, melanoma development, although very rarely, happens spontaneously in nature and can be induced by interspecific crossing. The oncogenic receptor tyrosine kinase, Xmrk, is responsible for melanoma formation in these fishes. Since Xiphophorus are live-bearing fishes and therefore not compatible with embryonic manipulation and transgenesis, the Xmrk melanoma model was brought to the medaka (Oryzias latipes) system. Xmrk expression under the control of the pigment cell specific mitf promoter leads to melanoma formation with 100% penetrance in medaka. Xmrk is an orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) and activates several downstream signaling pathways. Examples of these pathways are the direct phosphorylation of BRAF and Stat5, as well as the enhanced transcription of C-myc. BRAF is a serine-threonine kinase which is found mutated at high frequencies in malignant melanomas. Stat5 is a transcription factor known to be constitutively activated in fish melanoma. C-myc is a transcription factor that is thought to regulate the expression of approximately 15% of all human genes and is involved in cancer progression of a large number of different tumors. To gain new in vivo information on candidate factors known to be involved in melanoma progression, I identified and analysed BRAF, Stat5 and C-myc in the laboratory fish model system medaka. BRAF protein motifs are highly conserved among vertebrates and the results of this work indicate that its function in the MAPK signaling is maintained in medaka. Transgenic medaka lines carrying a constitutive active version of BRAF (V614E) showed more pigmented skin when compared to wild type. Also, some transiently expressing BRAF V614E fishes showed a disrupted eye phenotype. In addition, I was able to identify two Stat5 copies in medaka, named Stat5ab/a and Stat5ab/b. Sequence analysis revealed a higher similarity between both Stat5 sequences when compared to either human Stat5a or Stat5b. This suggests that the two Stat5 copies in medaka arose by an independent duplication processes. I cloned these two Stat5 present in medaka, produced constitutive active and dominant negative gene versions and successfully established transgenic lines carrying each version under the control of the MITF promoter. These lines will help to elucidate questions that are still remaining in Stat5 biology and its function in melanoma progression, like the role of Stat5 phosphorylation on tumor invasiveness. In a third project during my PhD work, I analysed medaka C-myc function and indentified two copies of this gene in medaka, named c-myc17 and c-myc20, according to the chromosome where they are located. I produced conditional transgenic medaka lines carrying the c-myc17 gene coupled to the hormone binding domain of the estrogen receptor to enable specific transgene activation at a given time point. Comparable to human C-myc, medaka C-myc17 is able to induce proliferation and apoptosis in vivo after induction. Besides that, C-myc17 long-term activation led to liver hyperplasia. In summary, the medaka models generated in this work will be important to bring new in vivo information on genes involved in cancer development. Also, the generated transgenic lines can be easily crossed to the melanoma developing Xmrk medaka lines, thereby opening up the possibility to investigate their function in melanoma progression. Besides that, the generated medaka fishes make it possible to follow the whole development of melanocytes, since the embryos are transparent and can be used for high throughput chemical screens. / Melanome entstehen durch die krankhafte Transformation von Melanozyten und sind eine der aggressivsten Krebsarten beim Menschen. In Fischen der Gattung Xiphophorus können, wenn auch sehr selten, spontan Melanome entstehen oder durch spezielle Artenkreuzungen induziert werden. Grundlage für das Entstehen der Melanome in diesen Fischen ist die Rezeptortyrosinkinase Xmrk. Da alle Xiphophorus-Arten lebendgebärend sind und keine Manipulationen an Embryonen vorgenommen werden können, wurde ein Xmrk Melanommodel für Medaka (Oryzias latipes) etabliert. Die Expression von Xmrk in Pigmentzellen dieser Fischart resultiert mit 100%iger Penetranz in Melanomen. Das Xmrk ist ein Ortholog des menschlichen „epidermal growth factor“ (EGFR) und aktiviert verschiedene nachgeschaltete Signalwege. Beispiele für diese Aktivierungen sind die Phosphorylierung von BRAF, Stat5 und die erhöhte Expression von c-myc. BRAF ist eine Serin-Threoninkinase, welche oft in malignen Melanomen mutiert ist. Stat5 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher dauerhaft in Fischtumoren aktiviert ist. C-myc ist ein Transkriptionsfaktor, welcher etwa 15% aller menschlichen Gene sowie die Entstehung vieler menschlicher Tumore reguliert. Um neue Einsichten in die Funktion der Kanidatengene im Prozess der Melanomentstehung in vivo zu erlangen, habe ich Orthologe von BRAF, Stat5 und C-myc bei Medaka identifiziert und analysiert. Die Domänen des BRAF Proteins sind hoch konserviert in allen Vertebraten. Weiterhin deuten die Ergebnisse meiner Arbeit auf eine Beibehaltung der Funktionen im MAPK Signalweg hin. Transgene Medakalinien, welche eine dauerhaft aktive Version des BRAF Gens (V614E) exprimieren, weisen einerseits eine stärkere Hautpigmentierung auf. Weiterhin treten in diesen Fischen Veränderungen der Augen auf. In einem weiteren Projekt meiner Arbeit gelang es mir, zwei Kopien des Stat5 Gens im Medaka zu identifizieren, Stat5ab/a und Stat5ab/b. Sequenzanalysen zeigten eine höhere Übereinstimmung zwischen den beiden Genkopien, als zwischen denen von Medaka und Menschen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die beiden Medaka Gene durch eine unabhängige Duplikation entstanden. In meiner Arbeit habe ich beide Gene des Medakas kloniert und jeweils eine konstitutiv aktive und eine dominant negative Version der Gene hergestellt. Weiterhin konnte ich erfolgreich für jede Genversion eine transgene Medakalinie etablieren, welche die verschiedenen Genvarianten unter der Kontrolle des pigmentzellspezifischen Promoters des mitf Gens exprimieren. Diese Linien werden in Zukunft helfen, den Einfluss von Stat5 Signalen auf den Prozess der Melanomverbreitung und dessen Invasivität zu erklären. In einem dritten Projekt meiner Doktorarbeit untersuchte ich das Vorkommen und die Funktion der C-myc Gene des Medakas. Ich konnte zwei Genkopien identifizieren, c-myc17 und c-myc20, welche auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Ich konnte induzierbare, stabil transgene Linien herstellen, welche ein Fusionsprotein aus C-myc17 und der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors von Maus exprimiert. Diese Linie ermöglichte eine induzierbare Aktivität des Transgens. Vergleichbar zum menschlichen MYC ist C-myc17 fähig, nach Aktivierung Proliferation und Apoptose in vivo auszulösen. Dauerhafte Aktivierung über einen längeren Zeitraum führt in diesen Linien zu Hyperplasie in Leber. Die verschiedenen Fischmodelle, die während dieser Arbeit generiert wurden, werden essentiell sein, um neue Einsichten in die Rolle diese Faktoren während der Krebsentwicklung in vivo zu erlangen. Weiterhin ermöglichen diese transgenen Linien durch einfaches Auskreuzen auf Xmrk Linien, deren Einfluss auf die Verbreitung von Melanomen zu untersuchen. Letztendlich sind mit diesen Linien auch Untersuchungen der Entwicklung von Pigmentzellen über Zeit möglich, da die Embryonen transparent sind und sich für chemisches Hochdurchsatz-Screening eignen.

Melanoma is the most aggressive skin cancer with very limited treatment options. Upon appearance of metastases chemotherapeutics are used to either kill or slow down the growth of cancer cells by inducing apoptosis or senescence, respectively. With melanomas originating from melanocytes, it is vital to elucidate the mechanisms that distinguish senescence induction from proliferation and tumourigenicity. Xmrk (Xiphophorus melanoma receptor kinase), the fish orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR), causes highly aggressive melanoma in fish. Using an inducible variant, HERmrk, I showed that high receptor levels result in melanocyte senescence, whereas low and medium expression allows for cell proliferation and tumourigenicity. Mechanistically, HERmrk leads to increased reactive oxygen species (ROS) levels, which trigger a DNA damage response. Consequently, multinucleated, senescent cells develop by both endomitosis and fusion. Furthermore, oncogenic N‐RAS (N-‐RAS61K) induces a similar multinucleated phenotype in melanocytes. In addition, I found that both overexpression of C‐MYC and the knockdown of miz­‐1 (Myc­‐interacting zinc finger protein 1) diminished HERmrk‐induced senescence entry. C‐MYC prevent ROS induction, DNA damage and senescence, while acting synergistically with HERmrk in conveying tumourigenic features to melanocytes. Further analyses identified cystathionase (CTH) as a novel target gene of Myc and Miz-­1 crucial for senescence prevention. CTH encodes an enzyme involved in the synthesis of cysteine from methionine, thereby allowing for increased ROS detoxification. Even though senescence was thought to be irreversible and hence tumour protective, I demonstrated that prolonged expression of the melanoma oncogene N­‐RAS61K in pigment cells overcomes initial OIS by triggering the emergence of tumour‐initiating, mononucleated stem‐like cells from multinucleated senescent cells. This progeny is dedifferentiated, highly proliferative, anoikis­‐resistant and induces fast­‐growing, metastatic tumours upon transplantation into nude mice. Our data demonstrate that induction of OIS is not only a cellular failsafe mechanism, but also carries the potential to provide a source for highly aggressive, tumour­‐initiating cells. / Das Melanom ist der aggressivste Hautkrebstyp mit aeußerst begrenzten Therapiemoeglichkeiten. Sobald Metastasen diagnostiziert werden, kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, deren Aufgabe darin besteht, die Krebszellen durch Apotoseinduktion zu toeten oder ihre Verbreitung mittels Seneszenz zu verlangsamen. Da Melanome aus Melanozyten hervorgehen, ist es essentiell, die Mechanismen zu analysieren, die entscheiden, ob Zellen seneszent oder tumorigen werden. Xmrk, die Xiphophorus­‐Melanom‐Rezeptor­‐Kinase und Fischortholog des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR), verursacht aggressive Melanome in Fischen. Durch den Einsatz von HERmrk, einer induzierbaren Variante des Rezeptors, konnte ich zeigen, dass hohe Expressionslevel Seneszenz in Melanozyten zur Folge haben, wohingegen niedrige oder mittlere Rezeptorlevel mit erhöhter Zellproliferation und Tumorigenitaet der Zellen einhergehen. Mechanistisch gesehen, führt die Aktivierung von HERmrk zu gesteigerten Level an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die wiederum DNA‐Schäden verursachen und dadurch bestimmte Signalwege auslösen. Durch Endomitose und Fusion entstehen letztendlich multinukleaere, seneszente Zellen. Interessanterweise, führte die Expression von onkogenem N‐RAS (N‐RAS61K) in Melanozyten zu einem sehr ähnlichen Phaenotyp. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass sowohl die Überexpression von C-­MYC als auch der Knockdown von miz‐1 (Myc­‐interagierendes Zinkfingerprotein 1) der HERmrk-­induzierten Seneszenz entgegenwirkten. C‐MYC verhindert einerseits die Entstehung von ROS, die dadurch verursachten DNA‐Schaeden und damit die Seneszenz und wirkt andererseits synergistisch mit HERmrk, indem es den Melanozyten tumorigene Eigenschaften verleiht. In weiteren Analysen wurde Cystathionase (CTH) als neues Zielgen von Myc und Miz-­1 identifiziert, dem eine zentrale Rolle in der Seneszenzverhinderung zukommt. CTH kodiert fuer ein Enzym, das die Synthese von Cystein aus Methionin und damit die Entsorgung von ROS ermöglicht. Obwohl man davon ausgeht, dass Seneszenz einen irreversiblen Mechanismus darstellt, der die Tumorentstehung verhindert, konnte ich zeigen, dass die langfristige Expression des Melanomonkogens N‐RAS61K die initiale Seneszenzinduktion durchbricht. Dabei gehen mononukleaere, tumorigene, stammzellaehnliche Zellen aus seneszenten Zellen hervor. Diese Tochterzellen sind dedifferenziert, hochproliferativ, Anoikis­‐resistent und induzieren schnellwachsende, metastasierende Tumoren in Nacktmaeusen. Damit machen meine Daten deutlich, dass Seneszenz nicht nur als zellulaerer Schadensbegrenzungsmechanismus fungiert, sondern auch das Potential hat, aeußerst aggressive Tumorzellen zu generieren.