Dentre as células ganglionares da retina existe uma pequena população de células que contem melanopsina e respondem diretamente à luz. Estas são as células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs), cujas funções são principalmente não visuais. Dentre as funções não visuais das ipRGCs sua influência na resposta pupilar dependente da luz foi o objeto central desta tese. Tanto a retina interna, através das ipRGCs, quanto a retina externa, através dos bastonetes e cones, fornecem uma informação neural que regula a resposta pupilar à luz (RPL). Este estudo avaliou a integridade das ipRGCs através do RPL em pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), leve, moderado e avançado, e em pacientes com síndrome da apnéia obstrutiva do sono (SAOS), moderada e grave. Também foi avaliada a discriminação cromática e a sensibilidade ao contraste espacial de luminância (SC), a perimetria visual e a espessura da retina avaliada por tomografia de coerência óptica (OCT). Foram avaliados 98 participantes: 45 pacientes com GPAA ( 27, 18; idade média = 65,84 + 10,20), 28 pacientes com SAOS ( 14, 14; idade média = 52,93 + 7,13), e 25 controles ( 17, 8; idade média = 54,27 + 8,88). Após o exame oftalmológico foram avaliadas a SC de grades e a discriminação de cores através do Cambridge Colour Test (CCT). A avaliação do RPL foi feita apresentando-se flashes de 470 e 640 nm, de 1s de duração, em 7 luminâncias desde -3 até 2.4 log cd/m2 em um Ganzfeld Q450 SC (Roland Consult). O RPL foi registrado pelo sistema de eye tracker View Point System (Arrington Research Inc.). Os testes foram realizados em ambos os olhos, de forma monocular e no escuro. Para a comparação dos dados entre os grupos, utilizou-se um modelo de equações de estimação generalizada (GEE), para correção da dependência entre os dois olhos. O RPL dos pacientes com GPAA moderado e avançado apresentou redução significativa na amplitude do pico, dependente da severidade do glaucoma, nas diferentes luminâncias tanto para 470 nm quanto para 640 nm, evidenciando redução das contribuições dos cones e bastonetes ao RPL. As contribuições das ipRGCs ao RPL (avaliadas pela amplitude da resposta sustentada entre 6-8 s) foram também significativamente menores em GPAA moderado e avançado. No estado inicial do GPAA as contribuições das ipRGCs para o RPL encontram-se preservadas. No entanto, o GPAA parece afetar o processamento espacial desde o inicio da doença. Nos pacientes com GPAA leve foi observada uma perda acentuada nas faixas baixas de frequência espacial, compatível com prejuízo seletivo das células ganglionares do tipo M. A SC de pacientes com GPAA moderado e avançado mostrou perdas nas faixas baixas e altas de frequência espacial, apontando um prejuízo nas vias parvo- e margnocelulares. Uma perda significativa da discriminação de cores no eixo azul-amarelo foi observada em todos os estágios do GPAA. O RPL nos pacientes com SAOS está parcialmente preservado, não obstante, as respostas da amplitude do pico para o flash de 470 nm diminuem conforme aumenta a severidade da SAOS. As contribuições dos fotorreceptores da retina externa ao RPL, foram significativamente menores em algumas das luminâncias. Não foram observadas diferenças significativas de SC ou discriminação de cores nos pacientes com SAOS. Em conclusão, no estágio moderado e avançado do glaucoma tanto as contribuições das ipRGCs ao RPL quanto as vias M e P, se encontram mais afetadas do que no inicio do GPAA, quando a via parvocelular e as contribuições das ipRGCs ao RPL parecem estar mais preservadas / Among the retina ganglion cells there are a small population of cells containing melanopsin and which respond directly to light. They are the intrinsically photosensitive ganglion cells (ipRGCs), whose functions are mainly non-visual. Among these non-visual functions of the ipRGCs, their influence on the pupillary response as a function of light was the central subject of this thesis. Both the inner retina through the ipRGCs and the outer retina through the rods and cones, provide neural information that regulates the pupillary light response (PLR) to light. This study evaluated the integrity of ipRGCs through PLR in patients with Primary Open Angle Glaucoma (POAG), mild, moderate and advanced, and in patients with Obstructive Sleep Apnea Syndrome (OSAS), moderate and severe. We evaluated also the color discrimination and achromatic spatial contrast sensitivity (CS), visual perimetry and retinal thickness evaluated by Optical Coherence Tomography (OCT). 98 participants were evaluated, 45 patients with POAG ( 27 18; mean age = 65.84 + 10.20), 28 with OSAS ( 14 14; mean age = 52.93 + 7.13) and 25 controls ( 17 8; mean age = 54.27 + 8.88). After the ophthalmological exam it was evaluated the contrast sensitivity and color discrimination measures using the Cambridge Colour Test (CCT). Pupil responses were elicited by Ganzfeld (Q450 SC, Roland Consult) presentation of 1-sec flashes of 470- and 640-nm at 7 luminance from -3 to 2.4 log cd/m2. PLR was measured with the eye tracker system View Point (Arrington Research Inc.). The tests were performed monocularly, on both eyes, in a darkened room. In order to compare data across groups, we used a General Estimating Equations (GEE) to adjust for within subject inter-eye correlations. Patients with moderate and advanced POAG had a significantly decreased PLR that depends on the severity of the glaucoma, for both the 470- and 640-nm stimuli, making evident the reduction of the contributions of the cones and rods to the PLR. The contributions of ipRGCs to PLR (assessed by the amplitude of the sustained response between 6 8 sec) were also significantly lower in patients with moderate and advanced POAG. In the initial and mild stages of POAG the contribution of ipRGCs to the PLR is preserved. However, POAG appears to affect spatial processing from the early stages of the disease. Mild-POAG patients showed a marked loss in the low spatial frequency bands, compatible with selective loss of magnocellular ganglion cells. The CS of patients with moderate and advanced POAG showed losses at both low and high spatial frequencies, suggesting a loss in both parvo- and margnocellular channels. A significant loss of color discrimination along the blue-yellow axis was observed in all stages of POAG. The PLR in patients with OSAS is partially preserved, however the peak amplitude responses for the 470-nm flash decreased with increased severity of OSAS. The contributions of the photoreceptors of the outer retina to the PLR were significantly lower at some of the luminance. Significant differences in CS or color discrimination were not observed in patients with OSAS. In conclusion, in moderate and advanced stages of glaucoma, both the contributions of ipRGCs to PLR as well as the M- and P channels, were found more affected than at the beginning of POAG, in contrast the parvocellular channel and the contributions of ipRGCs on the PLR would be more preserved

Dentre as células ganglionares da retina existe uma pequena população de células que contem melanopsina e respondem diretamente à luz. Estas são as células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (ipRGCs), cujas funções são principalmente não visuais. Dentre as funções não visuais das ipRGCs sua influência na resposta pupilar dependente da luz foi o objeto central desta tese. Tanto a retina interna, através das ipRGCs, quanto a retina externa, através dos bastonetes e cones, fornecem uma informação neural que regula a resposta pupilar à luz (RPL). Este estudo avaliou a integridade das ipRGCs através do RPL em pacientes com glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), leve, moderado e avançado, e em pacientes com síndrome da apnéia obstrutiva do sono (SAOS), moderada e grave. Também foi avaliada a discriminação cromática e a sensibilidade ao contraste espacial de luminância (SC), a perimetria visual e a espessura da retina avaliada por tomografia de coerência óptica (OCT). Foram avaliados 98 participantes: 45 pacientes com GPAA ( 27, 18; idade média = 65,84 + 10,20), 28 pacientes com SAOS ( 14, 14; idade média = 52,93 + 7,13), e 25 controles ( 17, 8; idade média = 54,27 + 8,88). Após o exame oftalmológico foram avaliadas a SC de grades e a discriminação de cores através do Cambridge Colour Test (CCT). A avaliação do RPL foi feita apresentando-se flashes de 470 e 640 nm, de 1s de duração, em 7 luminâncias desde -3 até 2.4 log cd/m2 em um Ganzfeld Q450 SC (Roland Consult). O RPL foi registrado pelo sistema de eye tracker View Point System (Arrington Research Inc.). Os testes foram realizados em ambos os olhos, de forma monocular e no escuro. Para a comparação dos dados entre os grupos, utilizou-se um modelo de equações de estimação generalizada (GEE), para correção da dependência entre os dois olhos. O RPL dos pacientes com GPAA moderado e avançado apresentou redução significativa na amplitude do pico, dependente da severidade do glaucoma, nas diferentes luminâncias tanto para 470 nm quanto para 640 nm, evidenciando redução das contribuições dos cones e bastonetes ao RPL. As contribuições das ipRGCs ao RPL (avaliadas pela amplitude da resposta sustentada entre 6-8 s) foram também significativamente menores em GPAA moderado e avançado. No estado inicial do GPAA as contribuições das ipRGCs para o RPL encontram-se preservadas. No entanto, o GPAA parece afetar o processamento espacial desde o inicio da doença. Nos pacientes com GPAA leve foi observada uma perda acentuada nas faixas baixas de frequência espacial, compatível com prejuízo seletivo das células ganglionares do tipo M. A SC de pacientes com GPAA moderado e avançado mostrou perdas nas faixas baixas e altas de frequência espacial, apontando um prejuízo nas vias parvo- e margnocelulares. Uma perda significativa da discriminação de cores no eixo azul-amarelo foi observada em todos os estágios do GPAA. O RPL nos pacientes com SAOS está parcialmente preservado, não obstante, as respostas da amplitude do pico para o flash de 470 nm diminuem conforme aumenta a severidade da SAOS. As contribuições dos fotorreceptores da retina externa ao RPL, foram significativamente menores em algumas das luminâncias. Não foram observadas diferenças significativas de SC ou discriminação de cores nos pacientes com SAOS. Em conclusão, no estágio moderado e avançado do glaucoma tanto as contribuições das ipRGCs ao RPL quanto as vias M e P, se encontram mais afetadas do que no inicio do GPAA, quando a via parvocelular e as contribuições das ipRGCs ao RPL parecem estar mais preservadas / Among the retina ganglion cells there are a small population of cells containing melanopsin and which respond directly to light. They are the intrinsically photosensitive ganglion cells (ipRGCs), whose functions are mainly non-visual. Among these non-visual functions of the ipRGCs, their influence on the pupillary response as a function of light was the central subject of this thesis. Both the inner retina through the ipRGCs and the outer retina through the rods and cones, provide neural information that regulates the pupillary light response (PLR) to light. This study evaluated the integrity of ipRGCs through PLR in patients with Primary Open Angle Glaucoma (POAG), mild, moderate and advanced, and in patients with Obstructive Sleep Apnea Syndrome (OSAS), moderate and severe. We evaluated also the color discrimination and achromatic spatial contrast sensitivity (CS), visual perimetry and retinal thickness evaluated by Optical Coherence Tomography (OCT). 98 participants were evaluated, 45 patients with POAG ( 27 18; mean age = 65.84 + 10.20), 28 with OSAS ( 14 14; mean age = 52.93 + 7.13) and 25 controls ( 17 8; mean age = 54.27 + 8.88). After the ophthalmological exam it was evaluated the contrast sensitivity and color discrimination measures using the Cambridge Colour Test (CCT). Pupil responses were elicited by Ganzfeld (Q450 SC, Roland Consult) presentation of 1-sec flashes of 470- and 640-nm at 7 luminance from -3 to 2.4 log cd/m2. PLR was measured with the eye tracker system View Point (Arrington Research Inc.). The tests were performed monocularly, on both eyes, in a darkened room. In order to compare data across groups, we used a General Estimating Equations (GEE) to adjust for within subject inter-eye correlations. Patients with moderate and advanced POAG had a significantly decreased PLR that depends on the severity of the glaucoma, for both the 470- and 640-nm stimuli, making evident the reduction of the contributions of the cones and rods to the PLR. The contributions of ipRGCs to PLR (assessed by the amplitude of the sustained response between 6 8 sec) were also significantly lower in patients with moderate and advanced POAG. In the initial and mild stages of POAG the contribution of ipRGCs to the PLR is preserved. However, POAG appears to affect spatial processing from the early stages of the disease. Mild-POAG patients showed a marked loss in the low spatial frequency bands, compatible with selective loss of magnocellular ganglion cells. The CS of patients with moderate and advanced POAG showed losses at both low and high spatial frequencies, suggesting a loss in both parvo- and margnocellular channels. A significant loss of color discrimination along the blue-yellow axis was observed in all stages of POAG. The PLR in patients with OSAS is partially preserved, however the peak amplitude responses for the 470-nm flash decreased with increased severity of OSAS. The contributions of the photoreceptors of the outer retina to the PLR were significantly lower at some of the luminance. Significant differences in CS or color discrimination were not observed in patients with OSAS. In conclusion, in moderate and advanced stages of glaucoma, both the contributions of ipRGCs to PLR as well as the M- and P channels, were found more affected than at the beginning of POAG, in contrast the parvocellular channel and the contributions of ipRGCs on the PLR would be more preserved

The skin has a system that can detect light in a fashion similar to the retina. Although its presence was initially reported almost 20 years ago, only in 2011 functional studies started to be reported. The biological clock of the skin has also been reported in the beginning of the century, but its function and relevance still remain unexplored. Thus, this Ph.D. project was designed to explore the functionality of both systems in melanocytes, and whether the disruption of these systems is associated with the development of melanoma cancer. Using in vitro, in vivo, and bioinformatics approaches, we have shown that: 1) the biological clock of malignant melanocytes is more responsive to visible light, UVA radiation, estradiol, and temperature compared to normal cells; 2) UVA radiation is detected by melanopsin (OPN4) and rhodopsin (OPN2), which triggers a cGMP related cascade that leads to immediate pigment darkening (IPD) in normal and malignant melanocytes; 3) in addition to detecting UVA radiation, OPN4 also senses thermal energy, which activates the biological clock of both normal and malignant melanocytes; 4) regarding the biological clock, we have provided several layers of evidence that proves that in melanoma a chronodisruption scenario is established compared to healthy skin and/or normal pigment cells; 5) in vivo tumor samples display a low amplitude circadian rhythm of clock gene expression and an ultradian oscillatory profile in melanin content; 6) a non-metastatic melanoma leads to a systemic chronodisruption, which we suggest that could favor the metastatic process; 7) in human melanoma, we demonstrated the role of BMAL1 as a prognostic marker and a putative marker of immune therapy success. Taken altogether, these results significantly contributed to the literature as it brought to light new and interesting targets and processes, which will be explored in future projects / A pele possui um sistema que pode detectar luz de forma análoga à retina. Embora a presença deste sistema tenha sido inicialmente descrita quase há 20 anos, apenas no ano de 2011 estudos funcionais começaram a ser relatados. Sabe-se que o relógio biológico da pele também foi identificado no início do século, mas sua função e relevância ainda continuam pouco exploradas. Diante deste cenário, este projeto de doutorado foi desenhado para investigar a funcionalidade de ambos os sistemas em melanócitos e se perturbação dos mesmos estaria associada com o desenvolvimento de melanoma. Através do uso de abordagens in vitro, in vivo e de bioinformática, nós demonstramos que: 1) o relógio biológico de melanócitos malignos é mais responsivo à luz visível, radiação UVA, estradiol e temperatura comparado ao de células normais; 2) a radiação UVA é detectada por melanopsina (OPN4) e rodopsina (OPN2), que ativam uma via de sinalização dependente de GMPc, levando ao processo de pigmentação imediata (IPD) em melanócitos normais e malignos; 3) além de detecção de radiação UVA, a OPN4 também detecta energia térmica que, por sua vez, ativa o relógio biológico de melanócitos normais e malignos; 4) relativo ao relógio biológico, provamos por diferentes abordagens que, no melanoma, um cenário de cronoruputura está estabelecido em comparação a pele saudável e/ou melanócitos; 5) tumores in vivo apresentam um ritmo circadiano de baixa amplitude na expressão dos genes de relógio e um ritmo ultradiano oscilatório no conteúdo de melanina; 6) um melanoma não metastático leva a um quadro sistêmico de cronoruptura, o qual sugerimos favorecer o processo de metástase; 7) em melanoma humano, demonstramos o papel do gene BMAL11 como marcador de prognóstico e um possível indicador de sucesso de imunoterapias. Portanto, este projeto contribuiu de forma significante para a literatura científica uma vez que trouxe à luz novos e interessantes alvos terapêuticos e processos, os quais serão explorados em projetos futuros