Submitted by GABRIELLI BRIANEZI null (gabrielli.brianezi@hotmail.com) on 2016-02-26T15:36:13Z No. of bitstreams: 1 20160224 Tese Gabrielli Brianezi.pdf: 3073309 bytes, checksum: 8fd0793265926aa1a58aea12aad689a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-26T20:04:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brianezi_g_dr_bot.pdf: 3073309 bytes, checksum: 8fd0793265926aa1a58aea12aad689a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T20:04:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brianezi_g_dr_bot.pdf: 3073309 bytes, checksum: 8fd0793265926aa1a58aea12aad689a6 (MD5) Previous issue date: 2016-01-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A patogênese do melasma, especialmente o papel dos queratinócitos e fibroblastos no desenvolvimento e manutenção da doença não é bem compreendida. Alterações dérmicas como dano estrutural à zona de membrana basal, melanócitos em pêndulo, elastose solar, celularidade, proliferação vascular, além da expressão de mediadores inflamatórios, fatores de crescimento, expressão epitelial de melanocortina e receptores dos hormônios sexuais; sugerem interação entre a unidade epidermo-melânica e a derme na fisiopatologia do melasma. A pigmentação melânica da pele pode ser estimulada por diferentes vias de sinalização, sendo a radiação ultravioleta, citocinas dérmicas e inflamação epidérmica, os modelos mais usuais. Neste estudo, objetivamos comparar a morfologia nuclear e a textura da cromatina entre queratinócitos basais no melasma facial e pele adjacente, investigar a ativação das diferentes vias de estímulo à pigmentação, além do envolvimento da derme, com foco na zona de membrana basal e colágeno, no melasma facial. Para a sua execução, foram coletados pares de biópsias faciais (2mm) de mulheres adultas com melasma e de pele adjacente (<2 cm). Processaram-se para coloração de PAS e picrosirius red; imunofluorescência para p53, p38, IL- 1α, αMSH, MC1R e COX2; imunoistoquímica para Melan-Acontracorada com PAS; Microscopia Eletrônica de Transmissão, além de cultura primária de fibroblastos para real-timePCR array e marcação para SA-β-gal. Foram avaliados: núcleos de queratinócitos da camada basal quanto à morfometria nuclear e textura da cromatina; quantificada a intensidade de fluorescência nos compartimentos da epiderme e derme; avaliadas organelas citoplasmáticas e zona de membrana basal; além do colágeno dérmico e densidade de melanócitos: totais e em pêndulo. Em relação à pele adjacente sem melasma: núcleos de queratinócitos basais da epiderme com melasma facial apresentaram índices morfométricos e textura da cromatina alterados; houve aumento da expressão epitelial de αMSH e MC1R, sem diferença quanto ao p53, p38, IL1α e COX2; houve maior número de organelas citoplasmáticas e melanossomas em estágios de maturação maiores nos queratinócitos e melanócitos; áreas danificadas na zona de membrana basal com presença de microvesículas adjacentes à membrana basal; maior número de melanócitos em pêndulo; colágeno dérmico desestruturado. Entre os fibroblastos, houve maior marcação para SA-β-gal e expressão alterada dos genes COL4A1, IL6, ESR2, DKK3, CCL2, WIF1, WNT3A, HGF, IL1B, MMPs 1-7-9 no melasma. As alterações encontradas nos queratinócitos, na derme e zona de membrana basal, sugerem que o fenótipo do melasma pode resultar de alterações em toda unidade epidermo-melânica, não somente de uma hipertrofia dos melanócitos, as vias inflamatórias da epiderme e dependentes de p53 não se mostraram proeminentes, além de ser identificado um possível papel do processo de reparo/dano da derme e da senescência de fibroblastos na patogênese da doença. / The melasma pathogenesis, specially the role of keratinocytes and fibroblast in the disease development and maintenance are not completely understood. Dermal alterations such as basal membrane structural damage, pendulous melanocytes, solar elastosis, cellularity, vascular proliferation, in addition to the expression of inflammatory mediators, grow factors, epithelial melanocortin and sexual hormones receptors, suggest there is an interaction between the epidermal melanin unit and dermis in melasma physiopathology. The melanin skin pigmentation can be stimulated by different signaling pathways. UVR, dermal cytokines and epidermal inflammation are the most common models. These study aims to compare the nuclear morphology and chromatin texture in basal keratinocytes between melasma and adjacent skin, to investigate the activation of different pigmentation signaling pathways, and the dermal involvement, focusing on basal membrane zone and collagen. Therefore, facial skin biopsies (2 mm) from women were taken from melasma and normal skin (<2 cm apart) and processed for PAS and picrosirius red; immunofluorescence for p53, p38, IL-1α, αMSH, MC1R and COX2, immunohistochemistry for Melan-A counterstaining with PAS, and transmission electronic microscopy. Furthermore, primary fibroblast culture for real-timePCRarray and SA-β-gal staining. The nuclei of basal keratinocytes were evaluated as nuclear morphometry and chromatin texture; the fluorescence intensity was quantified in the epidermis and dermis; cytoplasm organelles and basal membrane zone were evaluated; in addition to dermal collagen and melanocytes density: total and pendulous. Regarding adjacent healthy skin, the melasma skin showed alterations in morphometric index and chromatin texture; there was greater epithelial expression of αMSH and MC1R, but without difference for p53, p38, IL1α and COX2; cytoplasm organelles and melanossomas in higher maturity were in greater number in keratinocytes and melanocytes; there were commoner damaged areas in basal membrane zone, presence of microvesicules adjacent to basal membrane; and higher number of pendulous melanocyte; dermal collagen was less structured. There were greater SA-β-gal staining and altered expression of COL4A1, IL6, ESR2, DKK3, CCL2, WIF1, WNT3A, HGF, IL1B, MMPs 1-7-9 genes in melasma fibroblasts.The alterations presented in keratinocytes, dermis and basal membrane zone suggest the melasma phenotype can result from alteration in entire epidermal melanin unit, not just hypertrophic melanocytes, the epidermal inflammatory pathways and p53 dependents do not show prominence, in addition to the possible role of the repair/ damage process identified at dermis and fibroblast senescence in the melasma pathogenesis. / FAPESP: 12/09233-5 / FAPESP: 12/05004-1

Submitted by Ana Cláudia Cavalcante Espósito null (anaclaudiaesposito@gmail.com) on 2017-07-27T20:34:29Z No. of bitstreams: 1 Ana Cláudia mestrado para depositar.pdf: 2933638 bytes, checksum: 3c192abd021482675fa186f4c4bba9e4 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-31T19:29:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lemos_acce_me_bot.pdf: 2933638 bytes, checksum: 3c192abd021482675fa186f4c4bba9e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T19:29:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lemos_acce_me_bot.pdf: 2933638 bytes, checksum: 3c192abd021482675fa186f4c4bba9e4 (MD5) Previous issue date: 2017-07-20 / Fundo de Apoio à Dermatologia de São Paulo (FUNADERSP) / O melasma é hipermelanose crônica e adquirida decorrente de um complexo processo que envolve hipertrofia melanocítica e disfunção melanogênica. Acomete preferencialmente o sexo feminino e as lesões ocorrem nas áreas fotoexpostas, especialmente a face. Sua patogênese não é bem compreendida e os estudos clássicos avaliam apenas pele acometida e perilesional, mas pouco se sabe do comportamento da pele fotoprotegida, submetida aos mesmos fatores sistêmicos e genéticos. Neste estudo, objetivamos avaliar características histológicas, vias epidérmicas que influem na melanogênese (Wnt e ASIP) e características ultraestruturais da pele com melasma em comparação com a pele sã adjacente e retroauricular. Para a execução deste estudo transversal com controle intra-sujeito, foram coletadas três biópsias cutâneas (punch 3 mm) de onze mulheres com melasma facial. As áreas de coleta foram a pele com melasma, pele sã adjacente (distando no máximo 2 cm do limite da lesão) e pele retroauricular ipsilateral. Os fragmentos provenientes de dez participantes foram corados por hematoxilina-eosina, ácido periódico de Schiff, Fontana-Masson, picrosirius red, azul de toluidina e Verhöff; imunomarcados para CD34 e submetidos à imunofluorescência direta (IFD) de dupla marcação para proteínas Wnt1, WIF-1 e ASIP. Já os três fragmentos de uma das participantes foram processados para Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). Os dados obtidos foram comparados entre as topografias por modelo linear generalizado de efeitos mistos. As participantes eram fototipo III ou IV de Fitzpatrick, com idade média (desvio-padrão) de 42,9 (8,9) anos e apresentavam lesões há 16,7 (7,9) anos. Houve adelgaçamento da camada córnea na pele com melasma e na pele adjacente. Na pele com melasma houve maior compactação da córnea, maior pigmentação melânica epidérmica, maior heterogeneidade do colágeno, elastose solar, maior número de mastócitos, falhas da integridade da zona da membrana basal, melanócitos em pêndulo, bem como maior celularidade e vasos na derme superficial. IFD evidenciou maior intensidade de marcação de Wnt1 na pele com melasma em relação à pele adjacente e maior intensidade na pele retroauricular em relação à pele sã adjacente. Não houve diferença estatística significativa na intensidade de marcação de WIF-1 e ASIP entre as topografias. À MET, houve maior dano estrutural na lâmina lúcida no melasma, bem como maior número de melanossomas maduros e organelas citoplasmáticas nos melanócitos e queratinócitos basais. Tais resultados evidenciam que a pele com melasma apresenta, além da hipertrofia melanocítica, alterações na barreira epidérmica, na derme superior, zona de membrana basal e maior ativação da via Wnt, que diferem da pele fotoexposta adjacente e da retroauricular, configurando um fenótipo individualizado e não somente uma extensão do fotoenvelhecimento ou do envelhecimento intrínseco. / Melasma is a chronic and acquired hypermelanosis resulting from a complex process which involves melanocytic hypertrophy and melanogenic dysfunction. Melasma mainly affects females and lesions occur in the photoexposed areas, especially the face. Its pathogenesis is not well understood, and classical studies evaluate only the affected and perilesional skin, but little is known about the behavior of the non-sun-exposed skin, subjected to the same systemic and genetic factors. In this study, we aimed to evaluate histological features, epidermal pathways that influence melanogenesis (Wnt and ASIP) and ultrastructural characteristics of the skin with melasma in comparison to healthy adjacent and retroauricular skin. For the execution of this cross-sectional study with intrasubject control, three skin biopsies (punch 3 mm) were collected from eleven women with facial melasma. The areas of collection were the skin with melasma, adjacent healthy skin and retroauricular skin. Fragments from ten participants were stained with hematoxylin-eosin, periodic acid from Schiff, Fontana-Masson, picrosirius red, toluidine blue and Verhöff; immunomarked for CD34 and subjected to double-labeled direct immunofluorescence (DIF) for Wnt1, WIF-1 and ASIP proteins. The three fragments of one of the participants were processed for Transmission Electron Microscopy (TEM). The data obtained were compared between topographies by generalized linear model of mixed effects. Participants were Fitzpatrick's phototype III or IV; the mean age (standard deviation) was 42.9 (8.9) years and they had lesions for 16.7 (7.9) years. There was thinning of the corneal layer on the skin with melasma and adjacent skin. In the skin with melasma, there was more corneal compaction, greater epidermal melanic pigmentation, greater collagen heterogeneity, solar elastosis, more mast cells, defects of the basement membrane area, pendulum melanocytes, as well as greater cellularity and vessels in the superficial dermis. DIF showed a greater intensity of Wnt1 marking in the skin with melasma in relation to the adjacent skin, and greater intensity in the retroauricular skin in relation to the adjacent healthy skin. There was no significant statistical difference in the intensity of WIF-1 and ASIP marking between topographies. At TEM, there was more structural damage to the lamina lucida in melasma, as well as more mature melanosomes and cytoplasmic organelles in melanocytes and basal keratinocytes. These results show that melasma skin presents, in addition to melanocytic hypertrophy, alterations in the epidermal barrier, upper dermis, basement membrane zone and greater activation of the Wnt pathway, which differ from adjacent and retroauricular photoexposed skin, forming an individualized phenotype and not only an extension of photoaging or intrinsic aging.