Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TicianaMLA.pdf: 543419 bytes, checksum: 8d1c551389143e2634c1d0451175ecef (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Plodia interpunctella (Indian meal moth) is a cosmopolitan pest that attacks not only a wide range of stored grain as well other food products. Due to its economic importance several researches have focused in a method with ability to control this pest with few or no damage to the environment. The study of digestive enzymes inhibitors, lectins and chitin-binding proteins, has often been proposed as an alternative to reduce insect damage. In this study we report the major classes of digestive enzymes during larval growth in P. Interpunctella, being those proteinases actives at pH 9.5 and optimum temperature of 50 oC to both larvae of the 3rd instar and pre-pupal stage of development. In vitro and zymogram assays presented the effects of several inhibitors, such as SBTI, TLCK and PMSF to intestinal homogenate of 3rd instar larvae of 62%, 92% and 87% of inhibition and In pre-pupal stage of 87%, 62 % and 55% of inhibition, respectively. Zymograms showed inhibition of two low molecular masses protein bands by TLCK and that in presence of SBTI were retarded. These results are indicative of predominance of digestive serine proteinases in gut homogenate from Plodia interpunctella larvae. This serine proteinase was then used as a target to evaluate the effect of SBTI on larvae in in vivo assay. Effect of SBTI on mortality and larval mass was not observed at until 4% of concentration (w/w) in diets. Chitin, another target to insecticidal proteins, was observed by chemical method. Moreover, optic microscopy confirmed the presence of a peritrophic membrane. Established this target, in vivo effect of EvV, a chitin binding vicilin, evaluated during the larval development of P. interpunctella and was obtained a LD50 of 0,23% and WD50 of 0,27% to this protein. Mechanism of action was proposed through of the in vivo digestibility of EvV methodology. During the passage through the larval digestive tract was observed that EvV was susceptible to digestive enzymes and a reactive fragment, visualized by Western blotting, produced by digestion was recovered after dissociation of the peritrophic membrane. The bound of EvV to peritrophic membrane was confirmed by immunohystochemical assays that showed strong immunofluorescent signal of EvV-FITC binding and peritrophic membrane. These results are a indicative that vicilins could be utilized as potential insecticide to Plodia interpunctella and a control methods using EvV as bioinsecticide should be studied to reduce lost caused by storage insect pests / Plodia interpunctella (tra?a-indiana-da-farinha) ? uma praga cosmopolita que ataca n?o somente uma ampla gama de produtos armazenados, mas tamb?m outros produtos aliment?cios. Devido a sua import?ncia econ?mica v?rias pesquisas t?m sido realizadas com o intuito de identificar um m?todo capaz de controlar esta praga sem danos ao ambiente. O estudo de inibidores de enzimas digestivas, lectinas e prote?nas que se ligam ? quitina tem sido proposto como uma alternativa para controlar o dano causado por estes insetos. Neste estudo alvos espec?ficos para inibidores de enzimas e prote?nas ligantes ? quitina foram identificados nas larvas desta praga. Para isso, durante o desenvolvimento de larvas de P. interpunctella as classes de enzimas digestivas alvos foram identificadas por ensaios de atividade in vitro e SDS-PAGE, pH e temperatura ?timos avaliados para a indica??o de poss?veis prote?nas inibidoras para a principal classe de proteinase detectadas no intestino das larvas. Outro alvo para prote?nas delet?rias foi indicado pela identifica??o da membrana peritr?fica por ensaios qu?micos de detec??o de quitina e por microscopia de luz. Durante o per?odo de desenvolvimento as larvas de P. interpunctella, alimentadas com uma dieta baseada em baga?o de cana, passaram por 5 ?nstares e pelo est?gio pr?-pupal. A maior atividade proteol?tica (UA/intestino) foi detectada no est?gio pr?-pupal, enquanto que a maior atividade proteol?tica espec?fica (UA/mg prote?na) foi observada no terceiro ?nstar, utilizando azocase?na como substrato a pH 9,5 e a 50?C. A inibi??o das proteinases presentes no homogenato intestinal de larvas de terceiro ?nstar foi mais evidente quando inibidores de proteinases ser?nicas (SBTI, TLCK e PMSF, com 96%, 89% e 20% de inibi??o, respectivamente) foram utilizados nos ensaios. No est?gio pr?-pupal, a maior inibi??o observada foi com SBTI (96%), TLCK (81 %) e TPCK (20%), indicando a predomin?ncia de atividade enzim?tica de proteinases ser?nicas a pH 9,5 no intestino de Plodia interpunctella. Por zimograma foi observada inibi??o de bandas de menor massa molecular por TLCK e um atraso na corrida eletrofor?tica dessas bandas causado por SBTI. Quando avaliado o efeito in vivo de SBTI no desenvolvimento larval, n?o foi observada mortalidade e nem efeito na massa das larvas sobreviventes. Estabelecido o segundo alvo de atua??o, baseado na liga??o ? quitina, bioensaios usando a vicilina EvV foram realizados, onde um LD50 de 0,23% e um WD50 de 0,27% foram estabelecidos para esta prote?na delet?ria. O mecanismo de a??o foi verificado por ensaios de digestibilidade de EvV durante a passagem pelo trato intestinal larval, sendo observado o envolvimento de um fragmento reativo, observado por imunodetec??o, no efeito delet?rio da vicilina. A liga??o de EvV ? membrana peritr?fica foi comprovada atrav?s de ensaios de imunohistoqu?mica. Estes resultados apontam para uma vicilina ligante ? quitina que pode vir a ser utilizada como bioinseticida para Plodia interpunctella