Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 novembre 2005). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 91-106. Publié aussi en version électronique.

La membrane basilaire est très importante dans la peau humaine. Elle permet la diffusion des nutriments des vaisseaux sanguins jusqu'à l'épiderme et elle assure une bonne jonction entre le derme et l'épiderme. Durant la guérison, les kératinocytes de l'épiderme migrent sur le derme et synthétisent les différents composants nécessaires à la formation d'une membrane basilaire fonctionnelle. L'objectif de cette étude est d'analyser la régénération de la membrane basilaire lors de la guérison de plaies cutanées. L'emphase est aussi mis sur l'expression de la laminine 5 puisqu'elle joue un rôle particulier dans la migration des kératinocytes selon qu'elle est sous sa forme longue ou courte. Les résultats obtenus montrent la reconstruction progressive d'une membrane basilaire dans une peau en cours de régénération. Ces analyses permettent de mieux comprendre les mécanismes reliés à la guérison des plaies cutanées. La compréhension de ces notions constitue la base pour une recherche plus approfondie.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le mélanome est le cancer cutané le plus invasif. Au cours de l’invasion tumorale et de la dissémination métastatique, les cellules tumorales sont capables de dégrader la matrice extracellulaire par la sécrétion de protéases telles que les MMPs. Lors de cette protéolyse matricielle, différents fragments de la matrice extracellulaire exerçant des activités anti-tumorale et/ou anti-angiogénique, nommés matrikines, sont libérés et modulent la croissance tumorale. De nombreuses matrikines dérivées des collagènes de membrane basale sont capables de limiter la progression tumorale. Nous avons étudié les propriétés anti-tumorales du domaine NC1 α4(IV), nommé tétrastatine, à la fois in vitro et in vivo dans un modèle de mélanome humain. La tétrastatine induit une inhibition de la prolifération et de l’invasion des cellules de mélanome in vitro. L’inhibition de prolifération est corrélée à un retard en phase G1/S du cycle cellulaire en présence de tétrastatine. L’inhibtion de l’invasion peut notamment s’expliquer par une inhibition de l’activation de la MMP-14 et une modification de sa répartition cellulaire, avec perte du phénotype migratoire en présence de tétrastatine. In vivo, la surexpression de la tétrastatine induit une forte inhibition de la croissance tumorale, dans un modèle de xénogreffe de mélanome humain chez la souris nude. Nous avons également pu identifier l’intégrine αvβ3 comme un récepteur potentiel de la tétrastatine. Enfin, l’étude des capacités anti-prolifératives et anti-invasives des cellules UACC 903 en présence de différents peptides permet aujourd’hui de mieux préciser la séquence responsable de l’activité anti-tumorale de ce domaine. En conclusion, la tétrastatine est une nouvelle matrikine à fort potentiel anti-tumoral capable de limiter la progression du mélanome. / Melanoma is the most invasive cutaneous cancer. During tumor invasion and metastatic dissemination, tumor cells degrade the extracellular matrix by secretion of proteases such as MMPs. During matrix proteolysis, fragments of the extracellular matrix with anti-tumor and/or anti-angiogenic activities, called matrikines, are released and modulate tumor growth. Many matrikines derived from basement membrane collagens are able to inhibit tumor progression. We studied the anti-tumor properties of the domain NC1 α4 (IV), named tetrastatin, both in vitro and in vivo in a human melanoma model. Tetrastatin induces inhibition of proliferation and invasion of melanoma cells in vitro. This inhibition of proliferation is correlated to a cell cycle delay in G1/S phase when cells are incubated with tetrastatin. The inhibition of invasion could be due, at least partly, to the inhibition of MMP-14 active form and modification of its cellular distribution, with a loss of the migratory phenotype in the presence of tetrastatin. In vivo, tetrastatin overexpression induces a strong inhibition of tumor growth, in a human melanoma xenograft model in nude mice. We also identified integrin αvβ3 as a potential receptor of tetrastatin. Finally, the study of the anti-proliferative and anti-invasive properties of the UACC 903 cells in the presence of different peptides allows us to better identify the sequence responsible of the anti-tumor activity. In conclusion, tetrastatin is a new potent anti-tumor matrikine capable of limiting melanoma progression.

Le vieillissement cutané s'accompagne d'altérations des composants de la matrice extracellulaire. Des études ont montré que le contenu en collagène IV diminuait dans la peau à partir de 35 ans. Le collagène IV, constituant majeur des membranes basales, est formé de l'association, en triple hélice, de 3 chaînes alpha parmi 6 possibles: alpha1(IV) à alpha6(IV). Au niveau de la membrane basale cutanée, encore appelée jonction dermo-épidermique, seulement deux isoformes de collagène IV ont été mises en évidence : [alpha1(IV)2; alpha2(IV)], isoforme majoritaire, et [alpha5(IV)2; alpha6(IV)], isoforme minoritaire, synthétisées par les fibroblastes et les kératinocytes. Nous avons vérifié, par western-blot sur des extraits de peaux, cette diminution de collagène IV. Nous avons ensuite analysé la répartition du collagène IV au niveau de la JDE sur des coupes transversales de peau et n'avons pu mettre en évidence de discontinuité dans le réseau de collagène IV avec l'âge, du fait des fortes variations inter-individuelles. Parallèlement, sur coupe de peau, nous avons tenté de mettre en évidence des différences spectrales du collagène IV avec l'âge par spectroscopie Raman mais la résolution s'est avérée insuffisante. Nous avons isolé des fibroblastes de patients d'âges différents et montré une diminution de l'expression génique de la chaîne alpha1(IV) malgré de fortes variations inter-individuelles. Afin de s'affranchir de ces variations inter-individuelles pour étudier les mécanismes impliqués dans la diminution d'expression du collagène IV, nous avons mis au point un modèle de vieillissement accéléré de fibroblastes traités à l'H2O2 et vérifié le phénotype sénescent des cellules (morphologie modifiée, augmentation de l'activité SA-beta-galactosidase, augmentation de p21WAF-1…). Nous nous sommes intéressé à la voie du TGF-beta1. Nous avons montré que l'expression du récepteur au TGF-beta1, TbetaRII, diminuait dans le modèle de vieillissement accéléré. Nous avons également montré qu'un anticorps bloquant anti-TGF-beta1 reproduisait la diminution d'expression de collagène IV observée au cours de la sénescence. La détermination du mécanisme impliqué pourrait permettre, à terme, de proposer de nouvelles stratégies pour maintenir l'intégrité de la membrane basale lors du vieillissement cutané. / During aging skin there are extracellular matrix alterations. Preliminary studies showed that type IV collagen content decreased in skin with age after 35 years. Type IV collagen is a major component of basement membranes. It's constituted by the association of 3 alpha chains among 6 possible (alpha1 to alpha6). In the cutaneous basement membrane also called dermo-epidermal junction, only two isoform of type IV collagen were found: [alpha1(IV)2; alpha2(IV)], which is majoritary isoform, and [alpha5(IV)2; alpha6(IV)], which is minoritary, both synthesized by fibroblasts and keratinocytes. We checked the decrease in type IV collagen by western-blot on skin extracts. We then analyzed the distribution of this collagen in the DEJ on skin sections but we were not able to highlight a discontinuity in the network of type IV collagen during aging. At the same time, we tried to highlight spectral differences of the collagen IV with aging by Raman spectroscopy on skin sections but the resolution was insufficient. 35 years. We showed a decrease of type IV collagen expression by dermal fibroblasts in spite of strong variation between patients. In order to study the mechanism involved in type IV collagen variation during aging in dermal fibroblasts avoiding inter-individual variations, we develop an accelerated aging model of fibroblasts by treatment with H2O2. We checked the senescent phenotype of the cells (modified morphology, increase of SA-beta-galactosidase activity, increase of p21WAF-1…). We were interested on the TGF-1 pathway and we showed that TGF-beta1 receptor, called TbetaRII, was decreased in our accelerated aging model. We also showed that a blocking antibody against TGF-beta1 reproduced the decrease of type IV collagen expression observed during the senescence. The determination of the involved mechanism could lead to propose new strategies to maintain the integrity of the basal membrane during skin aging.

A côté de leur rôle structural au sein des tissus, les protéines de la matrice extracellulaire sont impliquées dans un grand nombre de processus cellulaires au cours de divers évènements biologiques. En revanche, leur rôle au cours de la régénération reste étonnamment peu étudié à ce jour. Pourtant, mieux comprendre le rôle de la MEC dans la régénération a de nombreuses applications en médecine régénérative et reconstructrice. Mon projet de thèse vise précisément à répondre à cette question. Pour cela, nous avons utilisé le modèle bien établi de la régénération de la nageoire caudale du poisson zèbre qui présente de nombreux avantages tels qu’une structure simple, facile d’accès et un régénération rapide, en seulement quelques jours. Une approche globale de transcriptomique sans a priori a permis d’établir l’importance de la matrice extracellulaire au cours de la régénération. Une première étape a consisté à établir la liste des gènes de la matrice extracellulaire du poisson zèbre par orthologie, appelé matrisome. Notre étude a fait émerger le rôle inattendu d’un collagène dans la reconstruction de la membrane basale de l’épiderme, une structure importante pour l’attachement de l’épiderme au derme dans la peau. Cette protéine, exprimée uniquement chez l’embryon, est ré-exprimée dans l’épiderme en régénération et déposée au niveau de la membrane basale. Par stratégie anti-sens in vivo, j’ai montré par microscopie à force atomique et microscopie électronique que l’absence de ce collagène impacte la structure et les propriétés biomécaniques de cette membrane basale en reconstruction. Ces résultats ont été confirmés sur une lignée de poisson, invalidée pour ce gène que nous avons créée par la technologie CRISPR/Cas9. Cette lignée a permis d’établir que ce collagène agit transitoirement comme un « spacer » moléculaire nécessaire à l’organisation tridimensionnelle des autres composants de la membrane basale pendant la régénération. / In addition to their role within tissues, extracellular matrix proteins are implicated in a large number of cellular processes. However, their role in regeneration is not well studied at the moment. A better understanding of the extracellular matrix proteins involvement in regeneration can have several future applications for regenerative and reconstructive medicine. The aim of my PhD project is to answer this question.To do this, we used the well-established zebrafish caudal fin model which have many advantages such as a simple structure, easily accessible and a quick regeneration in only few days. A global transcriptomic approach without a priori showed us that extracellular matrix proteins are playing a key role in regeneration. A first step of my work was to use an orthology-based approach to create the first list of extracellular matrix genes in zebrafish, called the matrisome. Our study revealed the unexpected role of a collagen during epidermal basement membrane reconstruction, an importance structure for the dermo-epidermal cohesion in skin. This protein which is expressed only during embryogenesis, is re-expressed in the regenerating epidermis and deposited in the basement membrane. Using an anti-sense strategy in vivo, I have demonstrated by atomic force microscopy and electron microscopy that the absence of this collagen impacts the biomechanics of this reconstructing basement membrane. These results were confirmed on a zebrafish line invalidated for this collagen that I have generated using the genome editing CRISPR/Cas9 technic. We showed that this collagen acts as a molecular spacer needed for the correct tridimensional organization of the other basement membrane components during regeneration.

La membrane basale (BM) constitue une barrière physiologique entre les tissus et leur microenvironnement. Dans le cas des cancers épithéliaux, au stade de carcinome invasif, la membrane basale est compromise et les cellules cancéreuses envahissent le stroma. Dans cette thèse de doctorat, j’ai proposé d’étudier l’invasion de la membrane basale par les cellules cancéreuses et comment une population de cellules stromales, les fibroblastes, affectent cette invasion. Dans le cadre de cette étude, nous avons utilisé le modèle du cancer colorectal. En collaboration avec l’hôpital Curie, nous avons isolé des fibroblastes à partir de tumeurs de patients opérés. On a nommé les fibroblastes isolés de la partie tumorale « CAF » et ceux venant de la partie du tissu normal, à proximité de la tumeur, « NAF ». Comme modèle de BM nous avons utilisé le mésentère de souris. Afin étudier l’invasion des cellules cancéreuses à travers le mésentère et l’effet des fibroblastes, nous avons mis en place une construction en 3D in vitro. Nous avons montré que les CAFs, et rarement les NAFs, induisent l’invasion des cellules cancéreuse et que cet effet est prononcé quand les CAFs sont physiquement présents sur la membrane. En faisant une étude protéomique comparative entre CAFs et NAFs, on a montré que les CAF expriment plus de protéines composantes de la membrane basale, des protéines impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire, et des protéines impliquées dans la contraction des cellules. Nous avons ensuite voulu comprendre par quel mécanisme les CAFs induisent l’invasion. Nous avons montré qu’en présence des CAFs, l’invasion ce fait de façon indépendante des métaloprotéinases mais que l’effet contractif des CAFs est nécessaire. En conclusion, l’ensemble de ces résultats mets en évidence l’effet promoteur des CAFs sur l’invasion des cellules cancéreuses et souligne l’importance de leur contractilité dans ce mécanisme. / Basement membrane represents a physiological barrier between epithelial tissues and their microenvironment. In invasive carcinomas, the membrane is breached and cancer cells disseminate in the stroma. In this PhD thesis, I investigated how cancer cells breach the BM and whether a stromal cell population, fibroblasts, assist them in that process. I used colorectal cancer as a model. In collaboration with the Institut Curie Hospital, we isolated human primary fibroblasts from human colorectal cancers, called CAFs and the adjacent normal tissue, NAFs. To study BM invasion, I developed a 3D in vitro assay based on the mouse mesentery. We showed that CAFs, and rarely NAFs, induce cancer cell invasion. This pro-invasive effect is mainly mediated when CAFs are physically present on the membrane, rather than through paracrine ways. To understand how CAFs facilitate invasion, we performed a proteomic comparison between cancer cell-stimulated CAFs and NAFs. Results showed that CAFs produced more proteins-components of the ECM, matrix remodelers and they were more contractile compared to NAFs. Further, we wished to understand the mechanism by which CAFs mediate their effect. We showed that CAFs can induce invasion in a MMP independent way. However, Inhibition of contractility abolished CAFs capacity to induce invasion. Dynamic analysis of cancer cells-fibroblasts co-cultures showed that CAFs could pull on the BM fibers. To directly test this possibility, we created holes in the BM using laser ablations. While in the presence of cancer cells alone, holes remained the same size, in the presence of CAFs, holes widen over time. We further showed that this mechanism is MMP independent but depends on contractility. Altogether, these results demonstrate that CAFs stimulate cancer cell invasion through BM by acting directly on the BM, possibly by depositing ECM components and proteins that remodel ECM and by exerting physical forces on the membrane by contraction.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 105-110. Publié aussi en version électronique.