Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / The ovary cancer is the main reason for gynecological malicious disease, since its diagnostic is usually late. The study of biomarkers is an alternative for its early diagnostic. Among the biomarkers on study, comes up the mesothelin, that is a protein which is found in the serum and urine. To obtain more evidences about this matter and other medicine subjects, the Systematic Review takes place. Systematic Reviews associated to metanalysis are scientifc methods that present higher evidence over some clinical question. However, to make inferences one should take into account the existing heterogeneity among studies. The heterogeneity statistics in a metanalysis should be evaluated to avoid the production of false evidences about Health matters. The objective of the current study was to investigate the metanalysis about risk or treatments, published with high heterogeneity, just as much to evaluate the accuracy of mesothelin as a biomarker for the ovary cancer. A exaustive search was performed of scientific papers published in the year of 2012 which had significant effects and high heterogeneity, just like a search of scientific papers published between January of 1990 and June of 2015 about the mesothelin as a biomarker for the ovary cancer. To perform the quantitative systematic review, the studies should had measured the levels of mesothelin in the serum in at least two histological diagnostics: ovary cancer (ovary cancer or neighboring ones) versus beneficial or normal ovary. The quality of the studies was evaluated accordingly the QUADAS-2 analysis. The statistical analysis was performed using the statistical programs Stata 11.0, Meta-Disc® 1.4 and RevMan 5.2. It was found just one study with high heterogeneity and statistical significance. The heterogeneity's cause was the reunion of distinct methodological studies. After the reanalysis of the data from the main paper, the initial results lost statistical significance and the heterogeneity was reduced to not so important levels. In what refers to the mesothelin, twelve studies were analysed, which included 1.561 women. The pooled sensibility was 0.62 (CI 95 % 0.58-0.66) and the specificity was 0.94 (CI 95 % 0.92-0.95). The Diagnostic Odds Ratio was 38.92 (CI 95 % 17.82-84.99). Thenceforth, our systematic review showed that the mesothelin cannot suit as an isolated biomaker for the ovary cancer, and that the heterogeneity statistcs should be carefully evaluated by researchers that disclose metanalysis. / O câncer de ovário é a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas, uma vez que seu diagnóstico é geralmente tardio. O estudo de biomarcadores é uma alternativa para o seu diagnóstico precoce. Dentre os biomarcadores em estudo, apresenta-se a mesotelina, que é uma proteína encontrada no soro sanguíneo e na urina. Para se obter maiores evidências sobre este e outros temas da área da saúde, procede-se a realização de Revisões Sistemáticas. Revisões sistemáticas associadas à meta-análise são métodos de pesquisa que apresentam maior evidência sobre alguma questão clínica. No entanto, para a realização de inferências deve-se levar em conta a heterogeneidade existente entre os estudos. As estatísticas de heterogeneidade em uma meta-análise devem ser avaliadas para que não sejam produzidas falsas evidências sobre temáticas em saúde. O objetivo do presente estudo foi investigar meta-análises de risco ou tratamento publicadas com alta heterogeneidade e avaliar a acurácia da mesotelina como um biomarcador para o câncer de ovário. Foi realizada uma busca exaustiva de artigos científicos publicados no ano de 2012 que tiveram efeitos significativos e alta heterogeneidade, bem como uma busca de artigos científicos publicados entre janeiro de 1990 e junho de 2015 sobre a mesotelina como biomarcador para câncer de ovário. Para a realização da revisão sistemática quantitativa, os estudos deveriam ter medido os níveis de mesotelina no plasma sanguíneo em pelo menos dois diagnósticos histológicos: câncer de ovário (câncer de ovário ou limítrofe) versus ovário benigno ou normal. A qualidade dos estudos foi avaliada de acordo com a análise QUADAS-2. A análise estatística foi realizada usando-se os programas estatísticos Stata 11.0, Meta-Disc® 1.4 e RevMan 5.2. Foi encontrado apenas um estudo com alta heterogeneidade e significância estatística. A hipótese da causa da heterogeneidade foi a reunião de estudos metodologicamente distintos. Após a reanálise dos dados do artigo original, os resultados iniciais perderam a significância estatística e a heterogeneidade foi reduzida para níveis não importantes. Quanto à mesotelina, doze estudos foram analisados, que incluíram 1.561 mulheres. A sensibilidade agrupada foi de 0,62 (IC 95 % 0,58-0,66) e a especificidade foi de 0,94 (IC 95 % 0,92-0,95). A razão de chances diagnóstica foi 38,92 (IC 95 % 17,82-84,99). Portanto, nossa revisão sistemática mostrou que a mesotelina não pode servir como um biomarcador isolado para o câncer de ovário e que as estatísticas de heterogeneidade devem ser cuidadosamente avaliadas por pesquisadores que publicam meta-análises.

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:40:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_CamilaRamosdos_D.pdf: 7751754 bytes, checksum: 779a2794a6dc213431c4264c43cc0af6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste trabalho realizamos estudos estruturais com duas proteínas, a Q4DV70 de Trypanosoma cruzi e a mesotelina de Homo sapiens. O objetivo foi contribuir para a compreensão da função dessas proteínas, as quais possivelmente são importantes para a doença de Chagas e o câncer, respectivamente. A proteína Q4DV70 estava anotada no genoma de T. cruzi como hipotética conservada. Em nosso estudo, a proteína foi pela primeira vez detectada em amostras do parasita. Essa expressão ocorre na fase epimastigota, mas não na fase tripomastigota metacíclica, indicando que a proteína pode ter uma função importante no ciclo de vida do T. cruzi. A estrutura cristalográfica da Q4DV70 foi resolvida por substituição molecular e refinada com dados até 1,5 Å de resolução. Ela apresenta enovelamento tiorredoxina, formado por uma folha ß de 5 fitas cercada por duas hélices a de cada lado. As proteínas que apresentam maior identidade seqüencial e superposição estrutural com Q4DV70 são as tiorredoxinas e PDIs, oxidorredutases de pontes dissulfeto. Porém, as duas cisteínas do sítio ativo dessas proteínas estão substituídas por serinas em Q4DV70, o que impossibilita a função de formação, redução ou isomerização de pontes dissulfeto. Diversas tiorredoxina-like apresentam atividade chaperona independente da função oxidorredutase. Essa função está relacionada a regiões hidrofóbicas na superfície e/ou depende da presença de outro domínio. Q4DV70 é monomérica, composta apenas pelo domínio tiorredoxinalike, e não apresenta regiões hidrofóbicas em sua superfície. Além disso, não demonstrou capacidade de aumentar o enovelamento da GAPDH de T. cruzi. Esses resultados indicam que Q4DV70 não apresenta atividade chaperona. Mesotelina é uma proteína expressa em mesotélio normal e em diversos tipos de câncer, como mesotelioma, câncer de ovário e de pâncreas e leucemia mielóide aguda. Ela é considerada um marcador diagnóstico para esses cânceres e tem sido alvo para o desenvolvimento de drogas anti-tumor. Além disso, ela interage com MUC16, uma proteína presente na superfície de células de câncer de ovário. Apesar da reconhecida importância e uso da mesotelina, pouco se sabe sobre sua estrutura e função. A proteína foi purificada em condições desnaturantes e submetida ao re-enovelamento por diálise. Experimentos de dicroísmo circular, fluorescência e proteólise limitada comprovaram que a mesotelina foi corretamente re-enovelada. Essa amostra foi submetida a ensaios de cristalização, os quais resultaram em cristais que difrataram a baixa resolução. A estrutura de baixa resolução da mesotelina foi calculada a partir de dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo e mostra que sua forma é alongada e curvada. O espectro de dicroísmo circular da mesotelina é típico de proteínas ricas em hélices a. Recentemente foi proposto que a estrutura da mesotelina é formada por uma estrutura em super-hélice, composta por repetições do tipo ARM, as quais apresentam 3 hélices a cada uma. Nossos resultados experimentais indicam que esse modelo teórico está correto. Proteólise limitada com quimotripsina resultou em um domínio estável de 20 kDa na região N-terminal da proteína. Esse domínio contém os 64 resíduos descritos como possível sítio de ligação a MUC16 e deve ser formado pelas 4 primeiras repetições do tipo ARM, de acordo com o modelo publicado. / Abstract: In this work we carried out studies with two proteins, Q4DV70 from Trypanosoma cruzi and mesothelin from Homo sapiens. The aim was to help the understanding of the function of these proteins which possibly are important to Chagas disease and cancer, respectively. Q4DV70 protein was annotated in T. cruzi genome as a conserved hypothetical protein. In our studies, the protein was detected for the first time in parasite samples. Its expression occurs in the epimastigote form but not in the metacyclic trypomastigote form indicating that Q4DV70 is important for the pathogen life cycle. Q4DV70 crystal structure was solved by molecular replacement and refined with data to 1.5 Å maximum resolution. It shows a thioredoxin fold, formed by a five stranded ß-sheet flanked by two a-helixes in each side. The proteins more sequentially identical and better structurally superposed to Q4DV70 are thioredoxins and protein disulfide isomerases, which are disulfide oxidoreductases. However, the cysteine residues from CXXC motif of the active site are replaced by serines in Q4DV70, what prevents the function of formation, reduction and isomerization of disulfide bonds. Different thioredoxin-like proteins show chaperone activity independent of oxidoreductase function. This function is related to hydrophobic regions on the surface and/or is dependent of another domain. Q4DV70 is monomeric, composed only by thioredoxin-like domain and does not show hydrophobic regions on its surface. Moreover the protein does not increase the refolding of GAPDH from T. cruzi. These results indicate that Q4DV70 does not present chaperone activity. Mesothelin is a protein expressed in normal mesothelium and in different types of cancer, such as mesothelioma, ovarian cancer, acute myeloid leukemia and cancer of pancreas. It is considered a diagnostic marker for these cancers and it has been used in the development of antitumor drugs. Besides that, it binds to MUC16, a protein present on the surface of ovarian cancer cells. In spite of its recognized significance and use in cancer, little is known about its structure and function. The protein was purified under denaturing conditions and submitted to refolding by dialysis. Circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis experiments confirmed that mesothelin was correctly refolded. This sample was submitted to crystallization trials that resulted in crystals which diffracted at low resolution. The low resolution structure of mesothelin was calculated from small angle X-ray scattering data and it shows an elongated and curved shape. The circular dichroism spectrum for mesothelin is typical of proteins that are rich in a-helixes. Recently it was proposed that mesothelin has a superhelix structure made by ARM repeats which are composed by 3 a-helixes each one. Our experimental results indicate that this theoretical model is correct. Limited proteolysis with chymotrypsin resulted in a stable domain of 20 kDa in the Nterminal region of the protein. This domain has the 64 residues described as the possible binding site for MUC16 and should be composed by the first four ARM repeats according to the model. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular