Aquest treball està centrat en l'estudi i caracterització del gen SA de ratolí. Inicialment, en el nostre laboratori, es va identificar com un gen regulat per andrògens d'expressió exclusivament renal. Analitzant la distribució tissular del gen SA s'ha observat que s'expressa en altres teixits com el fetge, l'estómac o el testicle. S'ha aprofundit en l'estudi de la regulació del gen SA per part de les hormones sexuals, andrògens i estrògens, en el ronyó i el fetge de ratolí, òrgans a on s'expressa de forma abundant, especialment al ronyó.S'ha clonat el gen SA de ratolí complert, determinant l'organització genòmica i els límits exò/intrò; s'han obtingut diferents transcrits resultat de la transcripció del gen, la diferència entre ells es troba en la regió 5' gràcies a les diverses combinacions que es donen entre els tres primers exons no codificants del gen. S'han clonat 2 Kb del promotor pròxim del gen SA. Diferents fragments d'aquesta regió s'han fusionat al gen reportador luciferasa i les construccions obtingudes s'han utilitzat per determinar l'activitat promotora, en assajos de transfecció transitòria. Aquests assajos han permés definir i posteriorment analitzar possibles elements reguladors presents en el promotor SA, implicats tant en l'expressió basal com en la resposta andrògenica del gen, en vaires línies cel.lulars renals i una línia cel.lular hepàtica. S'han produït anticossos policlonals contra pèptids sintètics específics de la proteïna SA que han permés idenficar-la en extractes proteics de ronyó de ratolí. S'ha comprovat que la seva regulació androgènica és paral.lela a la del corresponent mRNA. La SA s'ha identificat com una medium-chain acyl-CoA synthetase mitocondrial, en aquest treball hem demostrat la seva localització mitocondrial en una línia cel.lular renal, així com, la seva activitat enzimàtica en front a un substracte hidrocarbonat com l'àcid octanoic. L'elevada homologia a nivell de seqüència aminoacídica que presenta la SA amb altres enzims acil-CoA sintetasa ens ha permés identificar un domini d'unió a l'àcid gras en la proteïna molt conservat en tots aquests enzims. Mitjançant tècniques de mutagènesi hem observat que algun dels aminoàcids que formen aquest domini podrien ésser essencials en l'activitat enzimàtica de la SA.Donat que la proteïna SA participa en el metabolisme dels àcids grassos, en aquest treball hem estudiat la possible implicació dels receptor nuclears PPAR sobre l'expressió del gen SA, realitzant estudis in vitro a nivell d'activitat promotora en assajos de transfecció transitòria i, realitzant estudis in vivo amb ratolins mascle que s'han sotmés al tractament farmacològic d'agonistes específics per aquests receptors. / This work is based in the study and characterization of the mouse SA gene. We had first identified the mouse SA gene on the basis of its strong androgenic regulation in mouse kidney. Analyzing the tissue distribution of the gene it has been observed that is expressed in other tissues like the liver, the stomach or the testicle. It has been study the regulation of the gene by sexual hormones, androgens and estrogens, in the kidney and the liver of mouse, organs where it are expressed of abundant form, specially in the kidney. The complete mouse gene has been cloned, determining the genomic organization and the exon/intron boundaries; they have been obtained different transcripts result from the transcription of the gene, the difference among them is in the region 5' thanks to the diverse combinations that occur between the three first untranslated exons of the gene. We have cloned 2 Kb of the SA gene promoter. Different fragments from this region have cloned to the reporter gene luciferasa vector and the obtained constructions have been used to determine the transcriptional activity, by transitory transfection. These tests have allowed to define and later to analyze some regulating elements in SA promoter, implied so much in the basal expression as in the androgenic regulation of the gene, in several kidney and liver cellular lines. Polyclonal antibodies raised against SA-specific peptides revealed it in mouse kidney extracts. The protein androgenic regulation is parallel that of the mRNA. The SA protein has been identified like a medium-chain acyl-CoA synthetase located in the mitochondria, in this work we have demonstrated its mitochondrial location in a renal cellular line, as well as, its enzymatic activity forehead to a hydrocarbon substratum like octanoic acid. The SA present elevated homology with other enzymes acyl-CoA synthetase has allowed us to identify a binding domain to fatty acid in the protein very conserved in all these enzymes. By means of mutagenic techniques we have observed that some of the amino acids that form this binding domain be able essential in the SA enzymatic activity. Since SA protein participates in the metabolism of fatty acids, in this work we have analised the possible implication of the PPAR's on the SA expression gene, having made studies in vitro of transcriptional activity by transitory transfection and, doing studies in vivo with mice male that have been put under the farmacologycal treatment of specific agonists for these PPAR's.

La lipoproteïna lipasa (LPL) és un enzim amb un paper central en el metabolisme lipídic que, sotmès a una regulació específica de teixit, modula la distribució dels triacilglicerols circulants entre els diferents teixits de l'organisme. En el nostre grup s'han estudiat els canvis d'activitat LPL associats a una situació d'estrès. En aquest treball descrivim inicialment que l'estrès agut per immobilització en rata provoca un ràpid descens (5 minuts) de l'activitat LPL del teixit adipós blanc retroperitoneal concomitant amb un augment de l'activitat LPL a plasma. Aquesta resposta suggereix que l'alliberament de l'enzim a la sang podria constituir un mecanisme de regulació de l'activitat LPL a teixits, no descrit anteriorment. A més a més, l'augment paral·lel dels nivells de nitrat a plasma durant la immobilització i resultats previs del nostre grup suggereixen que l'òxid nítric podria participar en aquest procés d'alliberament.En aquest context, vàrem recórrer a l'ús d'eines proteòmiques amb l'objectiu d'estudiar una possible modificació post-traduccional de l'LPL produïda per l'òxid nítric o per espècies reactives del nitrogen. L'aplicació d'aquestes eines ens ha portat a demostrar: (i) la inespecificitat de l'anticòs P66, un anticòs policlonal anti-LPL emprat en estudis anteriors, (ii) l'existència d'isoformes de punt isoelèctric (pI) de l'LPL de rata i (iii) la nitració in vivo en tres residus de tirosina de l'LPL de rata en resposta a l'administració de lipopolisacàrid, que podria constituir un nou mecanisme de regulació de l'activitat LPL tissular.El descobriment de l'existència d'isoformes de pI de l'LPL, obre les portes a estudis més exhaustius dirigits a la identificació de les diferències moleculars entre les isoformes i a explorar les seves possibles implicacions funcionals. / Lipoprotein lipase (LPL) is an enzyme that plays a key role in lipid metabolism. LPL is under tissue-specific regulation and modulates the distribution of circulating triacylglycerols between the tissues of the organism. Our research group has studied the changes in LPL activity associated with stress. The present work reports that acute stress by immobilization induces a fast (5 minutes) down-regulation of retroperitoneal white adipose tissue LPL activity and a simultaneous increase in plasma LPL activity. This response suggests that the release of this enzyme from the endothelium to the bloodstream may constitute a fast mechanism of tissue LPL activity regulation that has not previously been studied.In this context, we used proteomic tools to study a potential post-translational modification in LPL induced by nitric oxide or by reactive nitrogen species. The use of such tools has allowed us to demonstrate: (i) the non-specificity of P66 antibody, a polyclonal antibody used in previous studies; (ii) the existence of isoelectric point (pI) isoforms of rat LPL; and (iii) the in vivo nitration of three tyrosine residues in rat LPL in response to lipopolysaccharide administration, which could be a new mechanism of tissue LPL activity regulation.The discovery of LPL pI isoforms opens the door to further studies aimed at identifying the molecular differences between the isoforms and at exploring their potential functional implications.

El síndrome metabólico, la hiperlipemia familiar combinada (HLFC), la diabetes mellitus tipo 2 y la dislipemia secundaria al tratamiento del VIH son síndromes que conllevan un elevado riesgo cardiovascular. Comparten alteraciones en el metabolismo de las lipoproteínas y de los hidratos de carbono y en la función endotelial. Los genes implicados en estos procesos están regulados a nivel transcripcional por la vía de señalización de la vitamina A. Asimismo, diferentes estudios de ligamiento para estas patologías identificaron un locus común en la región cromosómica 1q21-23. Estas evidencias nos llevaron a plantear la siguiente hipótesis: alteraciones de la regulación génica modulada por la vitamina A, ya sea de origen genético o inducidas por determinados fármacos, como son el ácido retinoico y sus derivados, causan tanto la hiperlipemia como la disfunción endotelial y por lo tanto, un aumento del riesgo cardiovascular.En la región 1q21-23 se localiza el gen CRABP2 (transportador intracelular del ácido retinoico). En pacientes con HLFC identificamos dos nuevos polimorfismos: rs2236795 y rs74118740, y realizamos un estudio de asociación en tres poblaciones independientes. El gen CRABP2 está asociado con niveles más altos de colesterol LDL. Por otro lado, estudiamos el efecto del ácido retinoico 13-cis sobre la expresión génica en células vasculares endoteliales humanas (HUVEC). A concentraciones farmacológicas se identificaron cambios en los niveles de expresión que pueden suponer un aumento de la adhesión celular y de la eliminación de los remanentes de las lipoproteínas y una modificación del metabolismo de la HDL. Finalmente, en el estudio más detallado de uno de los genes, la prostaciclina sintasa (PGIS), se observó un aumento en la liberación de la prostaglandina I2 (inhibidor de la agregación plaquetar y vasodilatador) debido a la inducción de PGIS. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan evidencias de que los procesos regulados por el ácido retinoico participan en estas patologías. / Metabolic syndrome, familial combined hyperlipidemia (FCHL), type 2 diabetes mellitus and dyslipidemia secondary to HIV treatment are syndromes linked to high cardiovascular risk, and alterations in lipoprotein and carbohydrate metabolism, as well as with endothelial function. The genes involved in these processes are regulated at the transcriptional level through the vitamin A signaling pathway. Also, several linkage studies have identified a common locus in 1q21-23. This evidence led us to the following hypothesis: vitamin A modulates gene regulation involved in these alterations either genetic or drug induced (such as retinoic acid and its derivatives); these alterations cause hyperlipidemia and endothelial dysfunction and therefore increase cardiovascular risk. Cellular retinoic acid binding protein II gene (CRABP2) is located in 1q21-23. We identified in FCHL patients two new polymorphisms (rs2236795 and rs74118740), and studied its association with dyslipidemia in three independent populations. CRABP2 gene is associated with higher levels of LDL cholesterol. Furthermore, we studied the effect of 13-cis retinoic acid on gene expression in human vascular endothelial cells (HUVEC). We identified changes in expression levels at pharmacological concentrations that caused an increase in either cell adhesion and lipoprotein remnants removal, and a modification of HDL metabolism. Finally, studying prostacyclin synthase gene in detail (PGIS), we observed an increase in the release of prostaglandin I2 (platelet aggregation inhibitor and vasodilator) due to the induction of PGIS. The results in this thesis provide evidence that the processes regulated by retinoic acid are involved in these pathologies.