MiRNR molekulės yra 21-24 nukleotidų ilgio dvigrandės RNR molekulės. Jos pačios nieko nekoduoja. Viena svarbiausių jų funkcijų yra genų raiškos valdymas potranskripciniame lygmenyje. Jas koduoja daugelis organizmų. miRNR brendimas skiriasi priklausomai nuo ląstelės tipo (gyvūninė ar augalinė). Augalų ląstelėse yra papildomas etapas, kuriu metu dvigrandė miRNR yra metilinama HEN1 baltymo. HEN1 metiltransferazė yra neseniai augaluose identifikuotas baltymas. HEN1 baltymas yra didelis (106,6 kDa), daugiadomeninis baltymas, kurio savybės mažai ištirtos. Jis vienintelis sugeba modifikuoti mažąsias RNR molekules pernešdama metilo grupę nuo kofaktoriaus S-adenozil-L-metionino ant 3′ galinio nt 2′ -OH grupės. HEN1 baltymas yra labai specifiškas savo substratui, kurį atpažįsta ne pagal nt seką, o pagal jo antrinę struktūrą ir ilgį. (Chen, 2005) Pagal homologiją su kitais baltymais HEN1 buvo nustatyti konservatyvūs motyvai. (Č. Venclovas) N-galinėje dalyje nustatyti du RNR prijungiantys (dvRNR-PD ir La- tipo) motyvai. Naudojant sutrumpintus baltymus ir išanalizavus juos elektroforetinio judrumo poslinkio PAA gelyje metodu buvo nustatyta, kad dvRNR-PD atlieka RNR prijungimo funkciją. dvRNR-PD buvo sumodeliuota erdvinė struktūra. Išanalizavus ją buvo nustatytos keturios aminorūgščių liekanos (12K, 22K, 69K ir 70K), kurios gali būti svarbios formuojantis baltymo ir RNR kompleksui. Ištyrus mutantinius baltymus, turinčius šių lizinų pakaitas buvo nustatyta, kad 12-as lizinas... [toliau žr. visą tekstą] / MiRNAs are 21-24 nt length double-stranded RNA molecules which do not encode anything. They play mayor role in post-transcriptional gene regulation level. These molecules are encoded by various organisms. miRNA maturation depends on the type of the cell (animal or plant). There is an additional step in plants when double stranded miRNA is methylated by HEN1 protein. HEN1 methyltransferase is a novel protein identified in plants. HEN1 protein has high molecular weight (106,6 kDa) and it is multistructural. Its features are not yet investigated. This is the only protein which modifies small RNA molecules by transferring methyl group from cofactor S-adenosil-L-methyonin to the 2′ -OH group of the last 3′ nt. HEN1 proteins is very specific to its substrate and recognizes it not by the nt sequence but by the molecule length and structure. After analysis of homologous proteins HEN1 conservative motives were identified. (Č. Venclovas) Two RNA binding motives (dsRNA-BM and La-type) were identified in the N-terminal region. By using shortened proteins and analyzing those by electrophoretic gel mobility in PAA gel shift it was find out that dsRNA-BM is responsible for binding miRNA. Theoretical structure model was made for dsRNA-BM. After analyzing it four amino acid residues (12K, 22K, 69K, and 70K) which can be important for the formation of protein and RNA complex were identified. After examination of mutant proteins with changed lysines it was determined that 12th... [to full text]

Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research. / Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą]

Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą] / Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research.