Thesis (PhD (Microbiology))--University of Stellenbosch, 2010. / Dissertation presented for the degree of Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Stellenbosch. / ENGLISH ABSTRACT: The interaction between a soil yeast, Cryptococcus laurentii and a medicinal plant, Agathosma betulina (Berg.) Pillans (Rutaceae), was studied. Cryptococcus laurentii CAB 578 was isolated from the rhizosphere of wild A. betulina and liquid chromatographytandem mass spectrometry analysis revealed that the yeast was capable of producing polyamines such as cadaverine and spermine. Since the exogenous application of polyamines are known to impact on root growth, these findings supported the results obtained when A. betulina seedlings grown under axenic and low nutrient conditions were inoculated with C. laurentii CAB 578 and cultivated for five months under glasshouse conditions. The presence of the yeast increased root growth by 51%. Using soil dilution plates, it was demonstrated that yeast numbers were greater in the vicinity of the roots than in the bulk soil. Furthermore, fluoromicroscopy, in combination with the fluorescent probes Calcofluor White and Fungolight revealed the presence of metabolic active yeast colonies on the rhizoplane. The first part of the study thus provided evidence for a symbiosis between A. betulina and C. laurentii CAB 578. During the second part of the investigation, the effect of this symbiosis on quantitative elemental distribution in A. betulina roots grown under axenic, nutrient-poor conditions was assessed using micro-particle-induced x-ray emission spectrometry. To aid in the interpretation of heterogeneous elemental distribution patterns, apoplastic barriers and endophytic C. laurentii CAB 578 in root tissues were located using fluorescence microscopy and transmission electron microscopy, respectively. The results showed that the average concentrations of iron, manganese and phosphorus were significantly (P < 0.05) higher within roots of yeast-inoculated plants, compared to control plants. It was shown that the yeast was not a root endophyte and that elemental enrichment in the epi/exodermal-outer cortical tissues correlated with the presence of Casparian bands in the exodermal cells of both treatments. This was the first report describing the role of a soil yeast as a plant nutrient-scavenging microsymbiont. In the final part of the investigation, the effect of C. laurentii CAB 578 on the photosynthetic nitrogen, phosphorus and water-use efficiencies, as well as the carbon economy of A. betulina was studied. Agathosma betulina plants inoculated with C. laurentii CAB 578, as well as controls, were grown under axenic conditions and the following parameters measured: Apparent photon yield, foliar nitrogen and phosphorus concentrations, leaf dark respiration, maximum photosynthetic rate, photosynthetic nitrogen-use efficiency, photosynthetic phosphorus-use efficiency, photosynthetic wateruse efficiency, root construction cost, stomatal conductance, substomatal CO2 and transpiration rate. The data showed that the higher photosynthetic resource-use efficiencies in yeast-inoculated plants were a consequence of higher maximum rates of CO2 assimilation, which was not related to foliar nitrogen and phosphorus content. We hypothesize that photosynthetic stimulation in yeast-inoculated plants was a result of the increased demand for photosynthates of the yeast-root symbiosis. In summary, the study revealed that a symbiosis exists between A. betulina and the soil yeast C. laurentii CAB 578. This interaction has a significant effect on the size of the yeast population as well as on the physiology of the plant. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die interaksie tussen ‘n grondgis, Cryptococcus laurentii, en ‘n medisinale plant, Agathosma betulina (Berg.) Pillans, is ondersoek. Cryptococcus laurentii CAB 578 is vanuit die risosfeer van A. betulina in sy natuurlike omgewing geisoleer en vloeistof chromatografie tandem massa spektrofotometriese analise het bewys dat die gis poliamiene insluitend kadaverien en spermien produseer. Dit is bevind dat die eksogene aanwending van poli-amiene wortelgroei bevorder. Hierdie bevinding staaf die waargenome 51% verhoging in wortelgroei van mikroob-vrye A. betulina saailinge geinokuleer met C. laurentii CAB 578 en gekweek vir vyf maande onder lae nutriënt kondisies in ‘n glashuis. Met gebruik van die grond verdunningsplaat-metode, is dit verder bewys dat gisgetalle hoër was in die teenwoordigheid van wortels as in die omliggende grond. Dit is ook bewys met die gebruik van die fluoressente peilers Calcofluor White en Fungolight, in kombinasie met fluoressensie-mikroskopie, dat metabolies aktiewe giste die wortels se oppervlak gekoloniseer het. Die eerste deel van die studie het dus bewys dat ‘n simbiose tussen A. betulina en C. laurentii CAB 578 bestaan. Tydens die tweede deel van die ondersoek is die effek van C. laurentii CAB 578 op die konsentrasie en verspreiding van elemente binne A. betulina wortels, gekweek onder lae-nutriënt, mikroob-vrye kondisies, bepaal met behulp van mikro-partikel geinduseerde X-straal emissie spektrofotometrie. Om die interpretasie van heterogene verspreidingspatrone van die onderskeie elemente te ondersteun, is daar met behulp van fluoressensie en transmissie-elektron-mikroskopie vir apoplastiese versperrings en endofitiese C. laurentii CAB 578 in die wortelweefsel getoets. Dit is bevind dat die gemiddelde konsentrasie van fosfaat, mangaan en yster beduidend (P < 0.05) hoër was in gis-geinokuleerde plante, as in kontrole plante. Die gis was nie ‘n wortel endofiet nie en elementale verryking in die epi/eksodermale-buitenste korteks weefsels het gekorreleer met Casparian bande in die eksodermale selle van beide behandelings. Hierdie was die eerste verslag wat die rol van ‘n grondgis as ‘n nutriënt-bekommende mikrosimbiont vir plante beskryf het. In die laaste gedeelte van hierdie ondersoek is die effek van C. laurentii CAB 578 op die fotosintetiese fosfaat, stikstof en water-verbruiksdoeltreffendheid, asook die koolstof ekonomie in mikroob-vrye Agathosma betulina plante geinokuleer met C. laurentii CAB 578 asook kontrole plante bestudeer. Die volgende parameters is getoets: Blaar donker respirasie, blaar fosfaat en stikstof konsentrasies, fotosintetiese fosfaatverbruiksdoeltreffendheid, fotosintetiese stikstof-verbruiksdoeltreffendheid, fotosintetiese water-verbruiksdoeltreffendheid, huidmond konduktansie, huidmond CO2 konsentrasie, klaarblyklike foton opbrengs, maksimum fotosintetiese spoed, wortel konstruksie-koste, en transpirasie spoed. Die resultate het getoon dat die hoër maksimum fotosintestiese spoed in gis-geinokuleerde plante gelei het tot ‘n hoër fotosintetiese verbruiksdoeltreffendheid van fosfaat, stikstof en water en dat dit nie verband gehou het met blaar fosfaat en stikstof konsentrasies nie. Dit word voorgestel dat die stimulasie van fotosintese in gisgeinokuleerde plante ‘n gevolg is van die verhoogde aanvraag na fotosintaat deur die giswortel simbiose. Om op te som, die bevindings van hierdie studie het bewys dat ‘n simbiose tussen A. betulina en C. laurentii CAB 578 bestaan. Hierdie simbiose het ‘n beduidende effek op die populasie grootte van die gis sowel as die fisiologie van die plant.

Les verres bioactifs sont des matériaux particulièrement intéressants en régénération osseuse du fait de leur capacité à stimuler les cellules responsables de la croissance osseuse par les espèces qu’ils relarguent lors de leur dissolution et pour leur capacité à se lier à l’os. Au-delà de leur rôle comme matériau de comblement de défauts osseux, ils pourraient servir de support à la croissance en laboratoire de véritables greffons osseux cultivés à l’aide de seulement quelques cellules d’un patient. Afin d’être efficace, ce support doit posséder une architecture macroporeuse interconnectée pour permettre l’invasion cellulaire ainsi que la vascularisation, nécessaire à la survie des cellules. Ce travail de thèse a pour objectif la réalisation d’un tel support par l’ajout d’une étape de moussage au procédé sol-gel. Ce procédé a été utilisé pour la synthèse de matériaux aux porosités différentes permettant de déterminer une porosité plus prometteuse pour des essais in vivo qui ont montré l’invasion possible de cette mousse par des cellules osseuses. Ce procédé a de plus été rendu plus sûr par la mise au point d’une voie de synthèse alternative dans laquelle l’acide nécessaire au procédé de moussage, mais toxique, a été remplacé avec succès. Cette voie alternative a de plus permis l’organisation de la mésoporosité de la mousse. L’incorporation d’un élément d’intérêt biologique, le strontium, a été réalisé et son influence sur les propriétés et la réactivité du verre a été étudiée. Enfin, une voie de synthèse de nouveaux matériaux composites a été proposée : la grande bioactivité des verres bioactifs est conservée tout en ayant des propriétés mécaniques supérieures grâce à l’utilisation de la gélatine comme phase organique. / Bioactive glasses are very interesting materials for bone regeneration because of their ability to stimulate cells responsible for bone growth with ionic products released during dissolution and for their bone bonding ability. Beyond their role as bone filling materials, they can be used as support for growth of laboratory-made bone grafts cultivated from just a few cells of a patient. This support, named scaffold, has to be an interconnected macroporous architecture in order to allow cell invasion and vascularization which is essential to cell survival. The aim of this thesis work is the realization of such a scaffold using the sol-gel foaming process. This process has been used for the synthesis of materials with different properties that were compared for determination of the most promising for in vivo implantation and was indeed able to allow cell invasion. Moreover, this process was improved to be safer by replacement of hazardous catalyst. This new process also allowed the structuration of the mesoporosity inside the foams. Incorporation of a biologically active element (strontium) was realized and its influence on the glass properties and reactivity was evaluated. Finally, the synthesis of new composite materials has been proposed: the high bioactivity of bioactive glasses is preserved while better mechanical properties are obtained thank to the use of gelatin as organic phase.

Les verres bioactifs sont des matériaux particulièrement intéressants en régénération osseuse du fait de leur capacité à stimuler les cellules responsables de la croissance osseuse par les espèces qu'ils relarguent lors de leur dissolution et pour leur capacité à se lier à l'os. Au-delà de leur rôle comme matériau de comblement de défauts osseux, ils pourraient servir de support à la croissance en laboratoire de véritables greffons osseux cultivés à l'aide de seulement quelques cellules d'un patient. Afin d'être efficace, ce support doit posséder une architecture macroporeuse interconnectée pour permettre l'invasion cellulaire ainsi que la vascularisation, nécessaire à la survie des cellules. Ce travail de thèse a pour objectif la réalisation d'un tel support par l'ajout d'une étape de moussage au procédé sol-gel. Ce procédé a été utilisé pour la synthèse de matériaux aux porosités différentes permettant de déterminer une porosité plus prometteuse pour des essais in vivo qui ont montré l'invasion possible de cette mousse par des cellules osseuses. Ce procédé a de plus été rendu plus sûr par la mise au point d'une voie de synthèse alternative dans laquelle l'acide nécessaire au procédé de moussage, mais toxique, a été remplacé avec succès. Cette voie alternative a de plus permis l'organisation de la mésoporosité de la mousse. L'incorporation d'un élément d'intérêt biologique, le strontium, a été réalisé et son influence sur les propriétés et la réactivité du verre a été étudiée. Enfin, une voie de synthèse de nouveaux matériaux composites a été proposée : la grande bioactivité des verres bioactifs est conservée tout en ayant des propriétés mécaniques supérieures grâce à l'utilisation de la gélatine comme phase organique.