Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6342.pdf: 2523813 bytes, checksum: 92295d7cb18d3fbd0dcbfe0d0cbbcf45 (MD5) Previous issue date: 2014-09-05 / Universidade Federal de Minas Gerais / Schistosoma mansoni is the causative agent of Schistosomiasis, reaching 249 million people in 78 countries. It is believed that this infection is successful due to modulation of the host immune system through proteins secreted by the parasite. Recently a class of proteins derived from micro-exon genes (MEGs) was observed in proteomic analyses of schistosomula and egg secretions of S. mansoni, and also associated with glands of several stages of the parasite life. Furthermore, they found that none of these proteins showed similarity to proteins of organisms from other genres. In this context, aim of this work was the structural study, the search for protein partners and biological assays seeking possible roles for the proteins encoded by genes of micro-exons of S. mansoni: MEG-5, MEG-8.2 e MEG-12. For structural characterization studies we used MEG-5 protein expressed by heterologous system (the expression of MEG-8.2 protein was not obtained) and initially performed tests Circular Dichroism (CD). This essay revealed the predominance of one disordered structure due to the presence of a negative peak in the ranges of 180-200mm and the presence of lower intensity peaks in the range 220- 240mm, indicating that part of the protein may present structure. Such structure was observed in the secondary structure predictions performed in SOPMA and Jpred3 programs, wherein the presence of a predicted alpha-helix in the C-terminal region. To confirm this fact, we performed an analysis of the maximum emission of tryptophan fluorescence by the technique of intrinsic fluorescence, because the protein has a single tryptophan present in the probable alpha-helical region. We note that the maximum fluorescence emission is at 330mm, indicating that it is in more hydrophobic environment. After the structural characterization of MEG-5 protein we seek partners through the assay two-hybrid system performing a scan on leukocyte cDNA libraries, yielding two possible partners. The CHMP1B protein was the one that drew the most attention in for being part of the formation of vesicular body and be related to the processes of antigen presentation. The synthetic peptide MEG-12 has a peculiar characteristic of an amphipathic helix predicted by Jpred3 program, and hemolytic character. This action was best observed by scanning electron microscopy (SEM), to be verifies in a clear disruption of the membrane to the breakup. The peptide is secreted into the esophagus may region associated with the digestion of erythrocytes made by the parasite. Therefore, these two proteins are shown to be important in the host-parasite relationship and possible targets for drugs or creation of more efficient vaccines. / O Schistosoma mansoni é o agente causador da esquistossomose mansônica, atingindo 249 milhões de pessoas em 78 países. Acredita-se que tal infecção é bem-sucedida devido a modulação do sistema imune do hospedeiro por meio de proteínas secretadas pelo parasita. Recentemente uma classe de proteínas derivadas de genes de micro-exon (MEGs) foi observada em análises proteômicas de secreções de esquistossômulo e ovo, e também associadas com glândulas de vários estágios de vida do parasita. Além disso, verificou que nenhuma destas proteínas apresentavam similaridade com proteínas de organismos de outros gêneros. Neste contexto, objetivo deste trabalho foi o estudo estrutural, a busca por parceiros protéicos e ensaios biológicos buscando possíveis funções para as proteínas codificadas por genes de micro-exons de S. mansoni: MEG-5, MEG-8.2 e MEG-12. Para os estudos de caracterização estrutural utilizamos a proteína MEG-5 expressa pelo sistema heterólogo (não obtivemos a expressão suficiente da proteína MEG-8.2) e inicialmente realizamos os ensaios de Dicroísmo Circular (CD). Este ensaio nos revelou a predominância de uma estrutura desordenada, devido a presença de um pico negativo nos intervalos de 180-200nm e a presença de picos de menor intensidade na faixa entre 220-240nm, indicando que parte da proteína pode apresentar estruturação. Tal estruturação foi observada nas predições de estrutura secundária realizadas nos programas SOPMA e Jpred3, em que, previram a presença de uma alfa-hélice na região C-terminal. Para a confirmação deste fato, realizamos uma análise do máximo de emissão de fluorescência no triptofano pela técnica de fluorescência intrínseca, pois a proteína possui um único triptofano presente na região da provável alfa-hélice. Constatamos que o máximo de emissão de fluorescência está em 330nm, indicando que este se encontra em ambiente mais hidrofóbico. Após a caracterização estrutural da MEG-5 buscamos parceiros protéicos por meio do ensaio de dublo hibrido realizando uma varredura em bibliotecas de cDNA de leucócitos, obtendo dois possíveis parceiros. A proteína CHMP1B foi a que mais nos chamou atenção, por fazer parte da formação do corpo vesicular e estar relacionada aos processos de apresentação de antígenos. O peptídeo codificado por MEG-12 apresenta uma característica peculiar de uma hélice anfipática, predita pelo programa Jpred3, e um caráter hemolítico. Sua ação em eritrócitos foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV), que verificou mudanças morfológicas das células, sugerindo a perturbação na membrana até o rompimento. O peptídeo é secretado na região do esôfago podendo está relacionado com a digestão de eritrócitos realizada pelo parasita. Por tanto, esta duas proteínas demonstram ser importantes na relação parasitohospedeiro e possíveis alvos para criação de medicamentos ou vacinas mais eficientes.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21664号 / 医博第4470号 / 新制||医||1035(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙橋 良輔, 教授 浅野 雅秀, 教授 影山 龍一郎 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Os genes micro-exons (MEGs) foram recentemente identificados no genoma do Schistosoma mansoni, verme responsável pela esquistossomose, doença que afeta mais de 262 milhões de pessoas em mais de 78 países. Devido à capacidade de produção de proteínas variantes pelo splicing alternativo de MEGs, expressão preferencial em estágios do ciclo de vida em contato com o hospedeiro definitivo e a verificação de que várias proteínas codificadas por estes genes são secretadas para o meio externo ao parasito, acredita-se que estas proteínas possuam um papel importante na interação parasito-hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar e caracterizar a estrutura e dinâmica conformacional das proteínas codificadas por MEG-11 e MEG-14 e verificar a interação da proteína MEG-14 com proteínas humanas. A análise das proteínas MEG-11 e MEG-14 produzidas em sistema recombinante com a técnica de dicroísmo circular (CD) demonstrou que ambas as proteínas apresentavam estruturas secundárias majoritariamente desordenadas quando em solução aquosa. Entretanto, foi verificado que a presença de TFE, a desidratação das proteínas e o aumento de temperatura favoreciam o surgimento de estruturas ordenadas nestas proteínas. Um ganho de estrutura secundária também foi observado para a proteína MEG-14 na presença de vesículas de fosfolipídios e micelas de detergente carregadas negativamente. Estes resultados suportam a identificação destas proteínas como clássicas proteínas intrinsicamente desordenadas (IDPs) e abre a possibilidade de sua interação com diferentes parceiros e fatores a serem relacionados com os papéis multifuncionais e estados dentro do hospedeiro. Resultados prévios de experimentos de duplo-hibrido do nosso grupo apontavam uma possível interação de MEG-14 com a proteína humana S100A9. Através da técnica de pulldown foi possível confirmar uma interação dependente da presença de cálcio entre estas duas proteínas. Análises adicionais da interação MEG-14/S100A9 com as técnicas de ITC e SPR permitiram calcular a constante de dissociação entre as proteínas em aproximadamente 2 μM. Finalmente, experimentos ex vivo permitindo a ingestão da proteína S100A9 acoplada a uma molécula fluorescente pelo S. mansoni resultaram na acumulação da proteína na glândula do esôfago, local onde já foi localizada a proteína MEG-14 em S. japonicum, sugerindo que a interação observada nos experimentos in vitro está ocorrendo com a proteína MEG-14 nativa. / The micro-exon genes (MEGs) were recently identified in Schistosoma mansoni’s genome, worm responsible for schistosomiasis, a disease that affects more than 262 million people in more than 78 countries. Due to the capacity of variant protein production by alternative splicing of MEGs, preferential expression in certain life stages in contact with the definitive host, and the confirmation that many proteins coded by these genes are secreted to the external environment, It’s believed that these proteins have an important role in parasite-host relationship. The objective of this work was to study and characterize the structure and conformational dynamics of proteins coded by MEG-11 and MEG-14 and verify the interaction of Meg-14 protein with human proteins. The analysis of MEG-11 and MEG-14 proteins produced in recombinant system with circular dichroism (CD) shows that both proteins present secondary structures mostly disordered in aqueous solution. However, It was found that in presence of TFE, the dehydration of proteins and the increasing of temperature favor the surging of ordered structures. An increase of secondary structure was observed too for MEG-14 protein in presence of phospholipid vesicles and negative charged detergent micelles. These results support the identification of these proteins as classical intrinsically disordered proteins (IDPs) and opens the possibility of its interaction with different partners and factors related with the multifunctional roles and states in the host. Previous results of double-hybrid experiments pointed a possible interaction between MEG-14 and the human protein S100A9. By pulldown technique was possible confirm an calcium dependent interaction between these proteins. Additional analysis of MEG-14/S100A9 interaction with ITC and SPR experiments were able to calculate the dissociation constant between proteins equals to 2 μM. Finally, ex vivo experiments permit the ingestion of S100A9 coupled to a fluorescent molecule by S. mansoni, resulting in the accumulation of protein in the esophageal gland, where was localized the MEG-14 in S. japonicum, suggesting that the interaction observed in the in vitro experiments are occurring with the native MEG-14.

Os genes micro-exons (MEGs) foram recentemente identificados no genoma do Schistosoma mansoni, verme responsável pela esquistossomose, doença que afeta mais de 262 milhões de pessoas em mais de 78 países. Devido à capacidade de produção de proteínas variantes pelo splicing alternativo de MEGs, expressão preferencial em estágios do ciclo de vida em contato com o hospedeiro definitivo e a verificação de que várias proteínas codificadas por estes genes são secretadas para o meio externo ao parasito, acredita-se que estas proteínas possuam um papel importante na interação parasito-hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar e caracterizar a estrutura e dinâmica conformacional das proteínas codificadas por MEG-11 e MEG-14 e verificar a interação da proteína MEG-14 com proteínas humanas. A análise das proteínas MEG-11 e MEG-14 produzidas em sistema recombinante com a técnica de dicroísmo circular (CD) demonstrou que ambas as proteínas apresentavam estruturas secundárias majoritariamente desordenadas quando em solução aquosa. Entretanto, foi verificado que a presença de TFE, a desidratação das proteínas e o aumento de temperatura favoreciam o surgimento de estruturas ordenadas nestas proteínas. Um ganho de estrutura secundária também foi observado para a proteína MEG-14 na presença de vesículas de fosfolipídios e micelas de detergente carregadas negativamente. Estes resultados suportam a identificação destas proteínas como clássicas proteínas intrinsicamente desordenadas (IDPs) e abre a possibilidade de sua interação com diferentes parceiros e fatores a serem relacionados com os papéis multifuncionais e estados dentro do hospedeiro. Resultados prévios de experimentos de duplo-hibrido do nosso grupo apontavam uma possível interação de MEG-14 com a proteína humana S100A9. Através da técnica de pulldown foi possível confirmar uma interação dependente da presença de cálcio entre estas duas proteínas. Análises adicionais da interação MEG-14/S100A9 com as técnicas de ITC e SPR permitiram calcular a constante de dissociação entre as proteínas em aproximadamente 2 μM. Finalmente, experimentos ex vivo permitindo a ingestão da proteína S100A9 acoplada a uma molécula fluorescente pelo S. mansoni resultaram na acumulação da proteína na glândula do esôfago, local onde já foi localizada a proteína MEG-14 em S. japonicum, sugerindo que a interação observada nos experimentos in vitro está ocorrendo com a proteína MEG-14 nativa. / The micro-exon genes (MEGs) were recently identified in Schistosoma mansoni’s genome, worm responsible for schistosomiasis, a disease that affects more than 262 million people in more than 78 countries. Due to the capacity of variant protein production by alternative splicing of MEGs, preferential expression in certain life stages in contact with the definitive host, and the confirmation that many proteins coded by these genes are secreted to the external environment, It’s believed that these proteins have an important role in parasite-host relationship. The objective of this work was to study and characterize the structure and conformational dynamics of proteins coded by MEG-11 and MEG-14 and verify the interaction of Meg-14 protein with human proteins. The analysis of MEG-11 and MEG-14 proteins produced in recombinant system with circular dichroism (CD) shows that both proteins present secondary structures mostly disordered in aqueous solution. However, It was found that in presence of TFE, the dehydration of proteins and the increasing of temperature favor the surging of ordered structures. An increase of secondary structure was observed too for MEG-14 protein in presence of phospholipid vesicles and negative charged detergent micelles. These results support the identification of these proteins as classical intrinsically disordered proteins (IDPs) and opens the possibility of its interaction with different partners and factors related with the multifunctional roles and states in the host. Previous results of double-hybrid experiments pointed a possible interaction between MEG-14 and the human protein S100A9. By pulldown technique was possible confirm an calcium dependent interaction between these proteins. Additional analysis of MEG-14/S100A9 interaction with ITC and SPR experiments were able to calculate the dissociation constant between proteins equals to 2 μM. Finally, ex vivo experiments permit the ingestion of S100A9 coupled to a fluorescent molecule by S. mansoni, resulting in the accumulation of protein in the esophageal gland, where was localized the MEG-14 in S. japonicum, suggesting that the interaction observed in the in vitro experiments are occurring with the native MEG-14.