O advento de técnicas de sequenciamento de alta eficiência possibilitou o estudo mais aprofundado de pequenos RNAs, como os microRNAs (miRNAs), a classe melhor caracterizada, e a identificação de novas classes como a dos transfer RNA-derived Fragments (tRFs). Os pequenos RNAs podem atuar como reguladores negativos da expressão gênica do seu transcrito alvo. Este mecanismo, denominado Silenciamento Gênico Pós-Transcricional (PTGS) ou RNA interferência (RNAi), pode ocorrer pela indução da clivagem do transcrito alvo, ou pela repressão da tradução do mesmo. Em soja, ainda não foram descritos miRNAs atuantes na germinação da semente, os quais foram abordados no primeiro capítulo desta tese. Utilizando duas bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência, uma relativa a sementes maduras e outra composta de uma combinação de sementes em germinação (3, 5 e 7 dias), foram identificados um total de 178 microRNAs, sendo 36 inéditos. Dos 178, 8 miRNAs com alvos potencialmente relacionados à germinação da semente, às rotas de auxina, giberelina, metabolismo lipídico, de nitrogênio e homeostase de potencial redox, foram validados por análise de degradoma. O segundo capítulo aborda a caracterização de tRFs em Arabidopsis associados com proteínas Argonauta (AGO), as quais são essenciais ao RNAi. Foram utilizadas 26 bibliotecas de sequenciamento de argonautas imunoprecipitadas (AGO-IP), relativas às AGOs 1, 2, 4, 5, 7 e 9, além de 3 bibliotecas de degradoma. O mapeamento destas sequências nos tRNAs de Arabidopsis revelou que estes pequenos RNAs são majoritariamente associados a AGO1 e 2, sendo a classe 5' de 19 nucleotídeos de comprimento a mais comum. Contudo, estes não obedecem aos critérios de direcionamento a proteínas AGO relativos ao primeiro nucleotídeo do pequeno RNA, como ocorre com miRNAs. Foram identificados quatro transcritos alvos, validados por análise do degradoma, os quais possivelmente sofrem PTGS via tRFs. Ambos os capítulos apresentam uma robusta caracterização in silico de pequenos RNAs em plantas inferindo suas possíveis funções. Contudo, mais experimentos devem ser efetuados para confirmação de seus papeis em soja e Arabidopsis. / The advent of the deep sequencing approach enabled a better characterization of small RNAs, such as microRNAs (miRNAs), the well-known small RNA class, and the identification of new classes like the transfer RNA-derived Fragments (tRFs). The small RNAs can act as negative regulators of gene expression of their target transcript. This mechanism, known as Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS), involves dicing of the target transcript, or translational repression. In soybean, the microRNAs acting on seed germination are unknown. These miRNAs were described in the first chapter of this thesis. Using two deep sequencing libraries, relative to the mature seeds and a combination of germinating seeds (3, 5 and 7 days). A total of 178 miRNAs were identified, including 36 new ones. Eight miRNAs had targets potentially related to seed germination including some acting on auxin and gibberellin pathways, lipid and nitrogen metabolism and redox homeostasis, and were validated by degradome analysis. The second chapter showed the characterization of Argonaut (AGO) associated tRFs in Arabidopsis. AGO is an essential protein for PTGS. A total of 26 deep sequencing libraries from immunoprecipitated Argonauts (AGO-IP), relative to the AGO 1, 2, 4, 7, and 9, plus 3 degradome libraries were used. The tRFs were mainly associated with AGO1 and 2, and the 5' class of 19 nucleotides in length was the most common one. However the tRFs did not follow the rule for AGO loading, were the first nucleotide lead the microRNA to a specific AGO. We identified four tRF target transcripts validated by degradome analysis, which possibly undergo the PTGS pathway. Both chapters present a robust in silico characterization of small RNAs in plants, inferring their possible functions. However, more experiments should be performed to confirm their roles in soybean and Arabidopsis.

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Brassica napus (canola) é a terceira cultura oleaginosa mais produzida no mundo, fornecendo cerca de 13% de toda a oferta mundial de óleo vegetal. Durante o desenvolvimento de sementes, B. napus acumula compostos de reservas em estádios e tecidos específicos. A maioria destes compostos de reservas são lípidos (30-40%) e proteínas (17-26%), sendo quase que exclusivamente armazenados nos cotilédones do embrião maduro. Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel essencial em diversos aspectos do desenvolvimento de sementes. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não-codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através da clivagem e a inibição de tradução de mRNA alvo. Estudos recentes têm contribuído para a identificação de miRNAs em sementes de B. napus, mas a expressão temporal e as funções regulatórias dos miRNAs em sementes de B. napus, especialmente durante a maturação, são desconhecidas. Para entender os padrões de expressão temporal dos miRNAs durante o desenvolvimento de sementes por RT-qPCR, este trabalho se concentra primeiramente na determinação de genes de referência para serem utilizados como normalizadores em estudos de RT-qPCR e no perfil de expressão dos miRNAs durante o desenvolvimento de sementes. A estabilidade da expressão de 16 mRNA e 43 miRNAs de B. napus foi avaliada em amostras de folha, tecidos florais e diferentes estágios de desenvolvimento de sementes. Nossas análises demonstraram que os miRNAs apresentam uma maior estabilidade de expressão do que genes que codificam proteínas, e a combinação miR156-7, miR11-1 e miR408-1 foi a mais apropriada para ser utilizada como normalizadores em estudos de expressão gênica por RT-qPCR. O perfil de expressão de 40 miRNAs foi avaliado ao longo do desenvolvimento de sementes. A maioria dos miRNAs teve sua expressão induzida durante a maturação de sementes, enquanto um pequeno número foi preferencialmente expressos em estágios iniciais do desenvolvimento das sementes. Um miRNA inédito, denominado miR03-1, apresentou uma expressão diferencial entre os estágios precoces e tardios do desenvolvimento. A expressão do miR03-1 é fortemente induzida 21 dias após o florescimento. A partir de uma abordagem computacional para predição de possíveis genes-alvo de miRNAs de B. napus foi possível identificar um total de 481 alvos putativos para 104 sequências maduras de miRNAs. Todos os alvos preditos estão diretamente relacionados com o metabolismo lipídico, dentre estes fatores de transcrição e enzimas-chave do metabolismo lipídico. O estudo da regulação destes genes por miRNAs em diferentes estágios do desenvolvimento de semente contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no metabolismo lipidico. / Brassica napus (canola) is the third largest oilseed crop in the world, providing approximately 13% of the world's supply of vegetable oil. During seed development, B. napus build up storage reserves in specific stages and tissues. The vast majority of these reserves are made up of lipids (30–40%) and proteins (17–26%) that are almost exclusively stored in the cotyledons of the maturing embryo. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of seed development, including embryo development and the timing of seeds maturation. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target. Several recent studies have contributed to the identification of miRNAs in seeds from B. napus, but temporal expression and regulatory functions of miRNAs in seeds of B. napus, especially during seed maturation, are unknown. To understand the temporal expression patterns of miRNAs during seed development by RT-qPCR, this work focuses primarily on the determination of appropriate reference genes for use in RT-qPCR studies and in the expression profile of miRNAs during seed development. The expression stability of 16 previously reported reference genes and 43 B. napus miRNAs have been evaluated in leaf and flower tissues, as wel in different seed development stages. Our analyses showed that miRNAs presented higher expression stability than protein-coding genes and the combination of miR156-7, miR11-1 and miR408-1 was appropriate as normalizers in studies of gene expression by RT-qPCR. In addition, the expression profile of 40 miRNAs was studied throughout seed development. The majority of miRNAs increased their expression during seed maturation, while a small part of the miRNAs was preferentially expressed at early seed developmental stages. A new miRNA named miR03-1 showed differential expression between the early and late stages of seed development and is strongly induced 21 days after flowering. In parallel, a computational approach was carried out to predict candidate target genes for B. napus miRNAs. A total of 481 putative targets were predicted for 104 sequences of mature miRNAs. All predicted targets are directly related to the lipid metabolism, such as transcription factors and key enzymes of lipid metabolism. The study of regulation of these genes by miRNAs in different stages of seed development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in lipid metabolism.

O complexo Cryptococcus possui 37 espécies descritas, das quais se destacam C. neoformans e C. gattii devido a sua capacidade de causar doença tanto em humanos como animais. A fim de se prevenir de organismos patogênicos, o hospedeiro pode reduzir a disponibilidade de nutrientes em um processo conhecido como imunidade nutricional. Além disso, é bem descrito o papel central de metais essenciais em relação à expressão dos fatores de virulência nas espécies patogênicas do gênero Cryptococcus. MicroRNAs (miRNAs) são importantes mediadores da expressão gênica em resposta a estresses, incluindo privação de metais ou toxicidade causada pelos mesmos. Entretanto, pouco é conhecido sobre expressão de miRNAs ou miRNAs-like em C. gattii. Portanto, o objetivo desde trabalho foi determinar o perfil miRNAs ou miRNAs-like produzidos por C. gattii durante privação de ferro e privação de zinco. Células de C. gattii R265 foram cultivadas em três condições: privação de zinco, privação de ferro e condição controle. As sequências dos pequenos RNAs foram obtidas por RNA-Seq. A fim de identificar miRNAs em C. gattii, as sequências não redundantes foram alinhadas às sequências dos genomas das linhagens de C. gattii R265 e WM276. Foi realizada a predição de miRNAs ou microRNA-like com ferramentas de bioinformática que resultou em 31 possíveis miRNAs na linhagem R265 e 26 na linhagem WM276, respectivamente. Análises in silico da expressão diferencial dos miRNAs mostraram que a maioria está presente nas três condições, ao passo que apenas dois estão presentes apenas nas condições de privação de metais. Desta forma, estes miRNAs-like podem estar exercendo algum papel importante na homeostase de metais em resposta a condições que mimetizam o ambiente de infecção. Visto que a linhagem R265 de C. gattii não possui um gene codificador da proteína Argonauta, a qual desempenha um papel central na via de RNA de interferência (RNAi), esta via possivelmente não seria responsável pelo silenciamento de outros genes. Levanta-se a hipótese que estes miRNAs-like poderiam ser exportados da célula e, então, modular a expressão gênica no hospedeiro. Esta análise foi iniciada pela avaliação de possíveis alvos expressos pelos genomas de camundongo e humano. Alguns destes alvos mostraram relação com a resposta imune nos hospedeiros. Esta identificação deve esclarecer o papel desenvolvido por miRNAs na regulação da expressão gênica na interação patógeno-hospedeiro. / The Cryptococcus complex has 37 species described, from which C. neoformans and C. gattii stand out for their ability to cause disease in humans and animals. To prevent infection with pathogenic microorganisms, host may reduce the availability of nutrients in a process known as nutritional immunity. Furthermore, it is well described that essential metals have central roles related to the regulation of expression of virulence factors in pathogenic Cryptococcus species. MicroRNAs (miRNAs) are important mediators of gene expression in response to several stresses, including metal deprivation or toxicity. However, little is known about microRNAs or miRNAs-like expression in C. gattii. Therefore, the aim of this work was to profile miRNAs produced by C. gattii during iron and zinc deprivation. C. gattii R265 cells were incubated in three conditions: zinc deprivation, iron deprivation and control condition. The sequences of small RNAs were obtained by RNA-Seq. To identify miRNAs or miRNAs-like in C. gattii, non-redundant reads were aligned to sequences of C. gattii R265 and WM276 strains genomes. MiRNAs prediction was and resulted in 31 possible miRNAs in R265 strain and 26 in WM276 strain, respectively. In silico analysis of miRNAs differential expression showed that the majority of them are present in the three conditions, while two are present only in metal deprivation. Thereby, these miRNAs-like may be exerting some important role at metal homeostasis in response to infection environment mimicry conditions. As the C. gattii R265 strain does not have an Argonaut encoding gene, the protein that plays a central role in the RNA interference (RNAi) pathway, we assumed that probably this pathway would not be responsible for silencing of others genes. We hypothesized that these miRNAs-like could be exported and modulate the gene expression in host cells. This analysis was initialized by evaluating the potential targets expressed by human and mouse genome. Some of these targets were related to immune response in the host. This identification should clarify the role played by miRNAs in the regulation of gene expression in the host-pathogen interaction.

A soja é uma das culturas mais importantes a nível mundial, devido à produção de óleo e a seu alto teor proteico. A fase reprodutiva é a mais importante para a produtividade da soja, visto que seu cultivo se destina principalmente à produção de grãos. Os microRNAs (miRNAs) desempenham funções essenciais em diversos aspectos do desenvolvimento reprodutivo, incluindo o florescimento, a fertilidade e o desenvolvimento da semente. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através de clivagem e inibição da tradução de mRNAs alvos. A identificação de miRNAs ainda não está saturada e, em soja, não há trabalhos relacionando-os aos diferentes órgãos florais, que são fundamentais na produtividade desta cultura. Neste estudo, amostras de flores, carpelos, estames e pétalas de soja foram usadas na construção de quatro bibliotecas de sRNAs sequenciadas utilizando a plataforma Solexa, gerando um total de 13.557.795 sequências. Através da análise do mapeamento das sequências de sRNAs das bibliotecas em candidatos a precursores de miRNAs de soja identificados, 276 foram considerados precursores autênticos, incluindo 143 precursores novos. Foram identificados 235 miRNAs maduros, dos quais 51 são miRNAs inéditos, pertencentes a 40 novas famílias. Os demais miRNAs identificados pertencem a 64 famílias conhecidas de miRNAs de plantas, das quais três ainda não tinham sido reportadas em soja. Todas as famílias de miRNAs que estão envolvidas na regulação do florescimento foram identificadas entre as mais frequentes nos tecidos florais de soja. Na análise de expressão pela frequência de sequências nas bibliotecas de sRNAs de carpelos, estames e pétalas, 67.2% (158) dos miRNAs identificados foram diferencialmente expressos. Análises de expressão por PCR quantitativa (RT-qPCR) comprovaram a expressão diferencial de 19 miRNAs. O miRNA inédito denominado NF13 apresentou a maior diferença entre os tecidos, sendo fortemente induzido nos carpelos. Para os miRNAs com expressão diferencial comprovada por RT-qPCR foi feita a predição computacional dos genes alvos, para muitos dos quais já foram descritas funções relacionadas ao processo reprodutivo em plantas. O estudo da regulação destes genes pelos miRNAs em diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento floral contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na reprodução da soja. / Soybean is one of the most important crops worldwide, due to the production of oil and its high protein content. The reproductive phase is considered the most important for the yield of soybean, which is mainly intended to produce the grains. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of reproductive development, including flowering, fertility and seed development. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target mRNAs. The identification of miRNAs is not yet saturated in soybeans, and there are no studies linking them to the different floral organs, which are fundamental in the productivity of this crop. In this study, samples of flowers, carpels, petals and stamens of soybeans were used in the construction of four sRNA libraries sequenced using the platform Solexa, generating a total of 13,557,795 sequences. The sRNAs sequences from four libraries were mapped in precursors candidates. Among them, 276 were considered authentic precursors, including 143 new precursors. 235 mature miRNAs were identified, of which 51 are novel miRNAs belonging to 40 new families. The other identified miRNAs belongs to 64 known plant miRNA families, of which three had not yet been reported in soybean. All miRNAs families which are involved in regulating flowering were identified among the most frequent floral tissue of soybean. Expression analysis based on the frequency of sequences in the libraries of sRNAs of carpels, stamens and petals demonstrated that 67.2% (158) corresponded to differentially expressed miRNAs. Most of 22 and 24 nt miRNAs that were differentially expressed was induced in carpels, suggesting that these miRNAs sizes are important in regulating the processes occurring specifically in these organs. Analysis of expression by quantitative PCR (RT-qPCR) confirmed the differential expression of 19 miRNAs. The novel miRNA named NF13 showed the greatest difference between the tissues and is strongly induced in the carpels. A computational prediction of targets for miRNAs with differential expression confirmed by RT-qPCR was performed. Many of the predicted targets have described functions related to the reproductive process in plants. The study of regulation of these genes by miRNAs in different tissues and stages of flower development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in reproduction of soybean.

Diversos trabalhos demonstram que a resposta das plantas ao alumínio é complexa. Porém, nenhum trabalho caracterizou o envolvimento de microRNAs nesta resposta. Parte deste trabalho visou caracterizar o perfil de expressão de diferentes famílias de microRNAs em resposta ao alumínio comparando-se as raízes de plantas de arroz japonica e indica. De um total de dezesseis microRNAs diferencialmente expressos, treze microRNAs tiveram a expressão reduzida e outros seis tiveram a expressão aumentada nas raízes de plantas de arroz japonica tratadas com 450 M de AlCl3 após 8h. Nas plantas de arroz indica tratadas nas mesmas condições, nove microRNAs foram detectados como diferencialmente expressos. Destes, quatro tiveram a expressão aumentada e os outros cinco tiveram a expressão reduzida. Por RT-qPCR foram confirmados dois alvos do miR528. Um dos alvos, o gene L-Ascorbato Oxidase está relacionado com a regulação da divisão celular. Sugere-se que a regulação pelo miR528 pode estar de acordo com a inibição do desenvolvimento das raízes em resposta ao alumínio em plantas sensíveis. Estes resultados demonstram que a resposta dos microRNAs ao tratamento com alumínio também é complexa, pois vários microRNAs, que provavelmente regulam alvos distintos tiveram sua expressão modulada após o tratamento das plantas. Já foi demonstrado que o desenvolvimento de raízes laterais sofre regulação por microRNAs em Arabidopsis. A outra parte deste trabalho visou caracterizar funcionalmente o miR164 e a expressão espacial de diferentes membros da família miR164 em raízes de plantas de arroz. Plantas superexpressando o miR164 apresentaram as raízes laterais reduzidas em comparação com as plantas não transformadas. Interessantemente, a análise por RT-qPCR de dois alvos do miR164 revelaram resultados inversos. A análise das plantas contendo os promotores de três genes da família miR164 fusionados ao gene repórter GUS revelou uma sobreposição da expressão espacial no órgão. Os microRNAs miR164a e miR164d localizam-se nas raízes laterais, e o miR164f está localizado nas raízes laterais e também na raiz primária. Porém, cortes transversais das raízes demonstraram que os miR164a e o miR164f localizam-se na endoderme e no estelo, respectivamente. Uma análise in silico das seqüências dos promotores dos seis membros da família miR164 e de seus respectivos alvos revelou a presença de motivos de DNA provavelmente responsivos a fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de meristemas primários. Com base nestes resultados, sugere-se que os microRNAs miR164a e miR164f devem estar regulando seus alvos em diferentes tecidos da raiz. Este resultado está de acordo com o desenvolvimento inicial das raízes laterais, pois estas se originam do periciclo componente do estelo. Os microRNAs têm função crucial ao longo do desenvolvimento e em resposta a estresses abióticos. O papel regulatório dos microRNAs reside na complexidade e diversidade das respostas a estresses abióticos e ao desenvolvimento, visto que diversos microRNAs, que provavelmente regulam distintos alvos, estão envolvidos em redes complexas na regulação da expressão gênica. / Previous works showed that the response to aluminum (Al) in plants is complex. However, at present, there is no data regarding microRNA expression in this response. Part of this work aimed to characterize the expression profile of different families of microRNAs in response to Al comparing roots of japonica and indica roots. From sixteen microRNAs differentially expressed, thirteen were down-regulated and six were upregulated in japonica rice roots treated with 450 M of AlCl3 after 8h. For the indica rice roots under the same conditions, nine microRNAs were differentially expressed. From these microRNAs, four were up-regulated and five were down-regulated. Two miR528 targets were confirmed by RT-qPCR. One of the targets is the L-AScorbate oxidase gene, which regulate cell divisions. These results help explaining rice root inhibition under Al teatment in sensitive plants. Our results suggest that microRNA response to Al is also complex, because several microRNAs that had their expression modulated probably regulate distinct target genes. It is known that lateral root development is regulated by microRNAs in Arabidopsis. The other part of this work was to characterize the miR164 function and the spatial expression of different members of the miR164 family in rice roots. Plantas overexpressing the miR164 had less lateral roots when compared to the non-transformed plants. Interestingly, the expression by RT-qPCR of two miR164 target was inverse in the miR164 overexpressing plants. The spatial expression analysis of different members of the miR164 family revealed overlapping domains. MicroRNAs miR164a and miR164d localized in the lateral roots, and miR164 is localized in lateral roots and also in primary roots. However, hand-sectioning of the miR164a and miR164f GUS fusion plants demonstrate that miR164a is expressed in the endodermis and miR164f is expressed in the stele. An in silico analysis of promoter sequences of all miR164 genes revealed the presence of DNA motifs probably responsive to transcription factors involved in the development of primary meristems. Base on these results, we suggest that different members of the miR164 family are regulating their targets in different tissues of rice roots. These results are in agreement with the initial development of lateral roots originating from the pericycle cells. The key of the regulatory role of microRNAs in response to abiotic stresses and during development brought complexity to the regulatory networks of gene expression.

A soja é uma das culturas mais importantes a nível mundial, devido à produção de óleo e a seu alto teor proteico. A fase reprodutiva é a mais importante para a produtividade da soja, visto que seu cultivo se destina principalmente à produção de grãos. Os microRNAs (miRNAs) desempenham funções essenciais em diversos aspectos do desenvolvimento reprodutivo, incluindo o florescimento, a fertilidade e o desenvolvimento da semente. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através de clivagem e inibição da tradução de mRNAs alvos. A identificação de miRNAs ainda não está saturada e, em soja, não há trabalhos relacionando-os aos diferentes órgãos florais, que são fundamentais na produtividade desta cultura. Neste estudo, amostras de flores, carpelos, estames e pétalas de soja foram usadas na construção de quatro bibliotecas de sRNAs sequenciadas utilizando a plataforma Solexa, gerando um total de 13.557.795 sequências. Através da análise do mapeamento das sequências de sRNAs das bibliotecas em candidatos a precursores de miRNAs de soja identificados, 276 foram considerados precursores autênticos, incluindo 143 precursores novos. Foram identificados 235 miRNAs maduros, dos quais 51 são miRNAs inéditos, pertencentes a 40 novas famílias. Os demais miRNAs identificados pertencem a 64 famílias conhecidas de miRNAs de plantas, das quais três ainda não tinham sido reportadas em soja. Todas as famílias de miRNAs que estão envolvidas na regulação do florescimento foram identificadas entre as mais frequentes nos tecidos florais de soja. Na análise de expressão pela frequência de sequências nas bibliotecas de sRNAs de carpelos, estames e pétalas, 67.2% (158) dos miRNAs identificados foram diferencialmente expressos. Análises de expressão por PCR quantitativa (RT-qPCR) comprovaram a expressão diferencial de 19 miRNAs. O miRNA inédito denominado NF13 apresentou a maior diferença entre os tecidos, sendo fortemente induzido nos carpelos. Para os miRNAs com expressão diferencial comprovada por RT-qPCR foi feita a predição computacional dos genes alvos, para muitos dos quais já foram descritas funções relacionadas ao processo reprodutivo em plantas. O estudo da regulação destes genes pelos miRNAs em diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento floral contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na reprodução da soja. / Soybean is one of the most important crops worldwide, due to the production of oil and its high protein content. The reproductive phase is considered the most important for the yield of soybean, which is mainly intended to produce the grains. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of reproductive development, including flowering, fertility and seed development. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target mRNAs. The identification of miRNAs is not yet saturated in soybeans, and there are no studies linking them to the different floral organs, which are fundamental in the productivity of this crop. In this study, samples of flowers, carpels, petals and stamens of soybeans were used in the construction of four sRNA libraries sequenced using the platform Solexa, generating a total of 13,557,795 sequences. The sRNAs sequences from four libraries were mapped in precursors candidates. Among them, 276 were considered authentic precursors, including 143 new precursors. 235 mature miRNAs were identified, of which 51 are novel miRNAs belonging to 40 new families. The other identified miRNAs belongs to 64 known plant miRNA families, of which three had not yet been reported in soybean. All miRNAs families which are involved in regulating flowering were identified among the most frequent floral tissue of soybean. Expression analysis based on the frequency of sequences in the libraries of sRNAs of carpels, stamens and petals demonstrated that 67.2% (158) corresponded to differentially expressed miRNAs. Most of 22 and 24 nt miRNAs that were differentially expressed was induced in carpels, suggesting that these miRNAs sizes are important in regulating the processes occurring specifically in these organs. Analysis of expression by quantitative PCR (RT-qPCR) confirmed the differential expression of 19 miRNAs. The novel miRNA named NF13 showed the greatest difference between the tissues and is strongly induced in the carpels. A computational prediction of targets for miRNAs with differential expression confirmed by RT-qPCR was performed. Many of the predicted targets have described functions related to the reproductive process in plants. The study of regulation of these genes by miRNAs in different tissues and stages of flower development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in reproduction of soybean.

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O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença rara, mas possui uma taxa de incidência muito próxima à taxa de letalidade. Parte da alta mortalidade do ADP se deve ao diagnóstico difícil (muitas vezes somente possível com análise de tecido pancreático) e tardio da doença, que geralmente acontece com o tumor já em estágio avançado. Assim, a descoberta de biomarcadores não-invasivos surge como uma possibilidade de diagnóstico mais seguro e, de preferência, precoce. Recentemente descobriuse que os microRNAS (miRNAs - pequenos RNAs não-codificantes, envolvidos na iniciação e na manutenção de tumores, incluindo o ADP) são estáveis em amostras circulantes, e a diferença em seus níveis de expressão pode discriminar com acurácia a presença ou ausência de determinadas doenças. Neste estudo, nós avaliamos a expressão de seis miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b e -376a) escolhidos de acordo com dados prévios da literatura, em amostras de soro e saliva de pacientes com e sem ADP, e também em tecido tumoral e não-tumoral de pacientes com ADP. Esta avaliação comparativa teve como objetivo verificar a presença de biomarcadores de diagnóstico, e possivelmente de prognóstico, neste perfil. Os níveis de expressão foram mensurados através de quantificação relativa, por PCR quantitativo em tempo real. Embora os níveis de expressão tenham se mostrado elevados em todas as amostras de tecido tumoral em relação ao tecido não-tumoral, esta diferença não foi significativa. Isso pode ser explicado pelo pequeno tamanho amostral, pela heterogeneidade tumoral e tecidual e pela ampla variabilidade de expressão dos miRNAs. Em amostras de soro, miR-21 e miR-34a foram significativamente mais expressos em pacientes com ADP e ambos foram capazes de discriminar pacientes com e sem doença com sensibilidade e especificidades clinicamente aceitáveis. Nosso estudo mostrou ainda que existe uma correlação forte e positiva entre os níveis de expressão destes dois miRNAs em amostras de soro e tecido, embora o mecanismo responsável por esta correlação seja desconhecido. A ausência de correlação de miR-21 e de miR-34a, quando analisados individualmente em amostras de soro e tecido pareadas, sugere que diferentes mecanismos regulam a expressão destes miRNAs em diferentes tecidos. Nas amostras de saliva, de modo geral, os níveis de miRNA foram muito baixos, e mesmo os miRNA detectáveis não apresentaram valores de expressão significativamente diferentes entre casos e controles. Tais achados sugerem que os miRNAs escolhidos neste estudo não são biomarcadores salivares adequados para diagnóstico, embora seja necessário uma confirmação destes dados em uma série maior de casos. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a rare disease, whose incidence rates are very close to mortality rates. Part of the high mortality of PDAC is due to its difficult (often only possible with pancreatic tissue analysis) and late diagnosis, when disease is at an advanced stage. Thus, the discovery of noninvasive diagnostic biomarkers emerges as a possibility to perform a safe diagnosis, preferably early in the disease course. Recently, microRNAs (miRNAs - small non-coding RNAs involved in tumors initiation and maintenance, including PDAC) were discovered as stable molecules in circulating samples. Several studies have shown that the difference in their expression levels between cases and controls can accurately discriminate the presence or absence of certain diseases. In this study, we evaluated the expression levels of six miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b and -376a), chosen according to previous literature data, in serum and saliva samples from patients with and without PDAC, and also in non-tumoral and tumoral tissue. The aim of our study was to investigate the presence of diagnostic and/or prognostic biomarkers. Expression levels were measured by relative quantification using real-time quantitative PCR. Although expression levels were increased in tumor tissues, this difference did not reach significance. This can be explained by the small sample size and the heterogeneity of tumor and tissue, beyond the already described wide variability in miRNAs expression levels. In serum, miR-21 and miR-34a were significantly more expressed in samples from patients with ADP and both were able to distinguish patients with and without disease with clinically acceptable sensitivity and specificity. Our study also showed that there is a strong positive correlation between the expression levels of these two miRNAs in serum and tissue. However, the mechanism related to this correlation remains unknown. The absence of correlation between each miR-21 and miR-34a individually, when matched serum and tissue samples were compared, indicates that different mechanisms regulate the expression of these miRNAs in different body compartments. In saliva samples, generally, miRNA levels were very low, and no difference in miRNA expression levels was seen between cases and controls. These findings suggest that the chosen miRNAs are not adequate as diagnostic biomarkers in saliva, although these findings require confirmation in a larger series of cases.

O advento de técnicas de sequenciamento de alta eficiência possibilitou o estudo mais aprofundado de pequenos RNAs, como os microRNAs (miRNAs), a classe melhor caracterizada, e a identificação de novas classes como a dos transfer RNA-derived Fragments (tRFs). Os pequenos RNAs podem atuar como reguladores negativos da expressão gênica do seu transcrito alvo. Este mecanismo, denominado Silenciamento Gênico Pós-Transcricional (PTGS) ou RNA interferência (RNAi), pode ocorrer pela indução da clivagem do transcrito alvo, ou pela repressão da tradução do mesmo. Em soja, ainda não foram descritos miRNAs atuantes na germinação da semente, os quais foram abordados no primeiro capítulo desta tese. Utilizando duas bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência, uma relativa a sementes maduras e outra composta de uma combinação de sementes em germinação (3, 5 e 7 dias), foram identificados um total de 178 microRNAs, sendo 36 inéditos. Dos 178, 8 miRNAs com alvos potencialmente relacionados à germinação da semente, às rotas de auxina, giberelina, metabolismo lipídico, de nitrogênio e homeostase de potencial redox, foram validados por análise de degradoma. O segundo capítulo aborda a caracterização de tRFs em Arabidopsis associados com proteínas Argonauta (AGO), as quais são essenciais ao RNAi. Foram utilizadas 26 bibliotecas de sequenciamento de argonautas imunoprecipitadas (AGO-IP), relativas às AGOs 1, 2, 4, 5, 7 e 9, além de 3 bibliotecas de degradoma. O mapeamento destas sequências nos tRNAs de Arabidopsis revelou que estes pequenos RNAs são majoritariamente associados a AGO1 e 2, sendo a classe 5' de 19 nucleotídeos de comprimento a mais comum. Contudo, estes não obedecem aos critérios de direcionamento a proteínas AGO relativos ao primeiro nucleotídeo do pequeno RNA, como ocorre com miRNAs. Foram identificados quatro transcritos alvos, validados por análise do degradoma, os quais possivelmente sofrem PTGS via tRFs. Ambos os capítulos apresentam uma robusta caracterização in silico de pequenos RNAs em plantas inferindo suas possíveis funções. Contudo, mais experimentos devem ser efetuados para confirmação de seus papeis em soja e Arabidopsis. / The advent of the deep sequencing approach enabled a better characterization of small RNAs, such as microRNAs (miRNAs), the well-known small RNA class, and the identification of new classes like the transfer RNA-derived Fragments (tRFs). The small RNAs can act as negative regulators of gene expression of their target transcript. This mechanism, known as Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS), involves dicing of the target transcript, or translational repression. In soybean, the microRNAs acting on seed germination are unknown. These miRNAs were described in the first chapter of this thesis. Using two deep sequencing libraries, relative to the mature seeds and a combination of germinating seeds (3, 5 and 7 days). A total of 178 miRNAs were identified, including 36 new ones. Eight miRNAs had targets potentially related to seed germination including some acting on auxin and gibberellin pathways, lipid and nitrogen metabolism and redox homeostasis, and were validated by degradome analysis. The second chapter showed the characterization of Argonaut (AGO) associated tRFs in Arabidopsis. AGO is an essential protein for PTGS. A total of 26 deep sequencing libraries from immunoprecipitated Argonauts (AGO-IP), relative to the AGO 1, 2, 4, 7, and 9, plus 3 degradome libraries were used. The tRFs were mainly associated with AGO1 and 2, and the 5' class of 19 nucleotides in length was the most common one. However the tRFs did not follow the rule for AGO loading, were the first nucleotide lead the microRNA to a specific AGO. We identified four tRF target transcripts validated by degradome analysis, which possibly undergo the PTGS pathway. Both chapters present a robust in silico characterization of small RNAs in plants, inferring their possible functions. However, more experiments should be performed to confirm their roles in soybean and Arabidopsis.