A calcineurina é uma fosfatase ativada por Ca2+ e calmodulina presente em todos os eucariotos que, em fungos, atua na sinalização de eventos em resposta a estímulos do ambiente e tem papel essencial na patogenicidade de fungos causadores de doenças. O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica profunda de importância para a Saúde Pública no Brasil e no restante da América Latina. Neste e em outros fungos dimórficos patogênicos, a transição dimórfica é necessária para o desenvolvimento de patogenicidade, sendo a calcineurina essencial o dimorfismo. Neste trabalho foram caracterizadas as estruturas gênicas das duas subunidades que compõe o heterodímero de calcineurina e sua expressão durante a transição dimórfica. Foram sugeridos possíveis alvos moleculares de interação com a calcineurina através de bioinformática e os níveis de expressão de três deles foram analisados durante a transição dimórfica. Espera-se que este trabalho contribua para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a transição dimórfica, virulência e patogenicidade em P. brasiliensis e, dessa forma, auxilie no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a paracoccidioidomicose. / The calcineurin is a Ca2+/almodulin-dependent phosphatase present in all eukaryotes. In fungi, it acts as a signaling molecule that works in response to environmental stimuli and has key role in pathogen city of diverse disease-causing fungi. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus and the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis important to public health in Brazil and other Latin Americans countries. As in other dimorphic pathogenic fungi, the dimorphic transition is necessary for the development of pathogenicity, with calcineurin playing an essential role to the process of dimorphism. In this work we characterized the gene structures of two subunits that make up the calcineurin heterodimer as well as its expression during the dimorphic transition. We raised possible targets for molecular interaction with calcineurin by bioinformatics and the levels of expression of three of them were examined during the dimorphic transition. We expect that this work might contribute to a better understanding of the mechanisms that regulate the dimorphic transition, virulence and pathogenicity in P. brasiliensis and thus help in developing of new therapeutic approaches against paracoccidioidomycosis.

As proteínas de choque frio pertencem a uma família de proteínas com um domínio altamente conservado, denominado domínio de choque frio (CSD). Estão envolvidas em vários processos celulares, incluindo adaptação a baixas temperaturas, estresse nutricional e fase estacionária. Em C. crescentus, uma <font face=\"Symbol\">&#945;-proteobacteria não patogênica, as proteínas CspC e CspD apresentam dois CSDs e seus níveis aumentam apenas durante a fase estacionária. Este trabalho tem como objetivo determinar os fatores de transcrição e sinais celulares envolvidos na regulação do gene cspC em C. crescentus. No presente trabalho, foi realizada a varredura de uma biblioteca de 4000 clones mutados pela inserção do transposon Tn5, onde foram identificados sete mutantes com expressão reduzida de cspC: CCNA03569 (proteína hipotética); CCNA02510 (deacetilase de oligossacarídeos); CCNA01594 (metiltransferase da proteína ribossomal L11); CCNA02186 (pequena subunidade da acetato lactato sintase); CCNA00084 (fosforibosil aminoimidazol carboxamida formiltransferase/ IMP ciclohidrase); CCNA03616 (sulfito redutase dependente de NADPH) e CCNA01448 (frutose-1,6-bisfosfatase). Através de ensaios de expressão na presença de um meio condicionado, verificou-se que cspC e cspD aparentemente não são induzidos em resposta ao aumento de densidade populacional. O fenótipo do mutante cspC na fase estacionária foi avaliado em relação a sua resistência a estresse oxidativo, e vimos que a linhagem <font face=\"Symbol\">DcspC é altamente sensível ao peróxido de hidrogênio e a superóxidos, mas não é sensível a hidroperóxido orgânico. A ausência de cspC provavelmente é compensada por dps, já que a expressão deste gene aumenta no mutante <font face=\"Symbol\">DcspC. Por outro lado, a transcrição de katG diminui, mas as atividades de KatG e SodB não são afetadas no mutante cspC. Em condições de estresses provocados por peróxido de hidrogênio, sacarose e sal a expressão de cspC não é afetada. Os fatores sigmas SigT e SigU e o regulador de transcrição Fur não estão envolvidos na regulação de cspC, mas no mutante <font face=\"Symbol\">DsigJ a expressão de cspC aumenta, e no mutante <font face=\"Symbol\">DoxyR ela é diminuída. Foi verificado também que cspC apresenta uma autoregulação positiva, que pode se dar por meio de estabilização de seu próprio mRNA. / The cold shock proteins belong to a family of proteins presenting a highly conserved domain, called cold shock domain (CSD). They are involved in various cellular processes, including adaptation to low temperature, nutritional stress, cell growth and stationary phase. In C. crescentus, a non-pathogenic <font face=\"Symbol\">&#945;-proteobacteria, the cold shock proteins CspC and CspD have two CSDs and they are induced during stationary phase. This study aims to determine the transcription factors and cellular signals involved in cspC gene regulation in C. crescentus. In the present study we scanned a library of 4000 mutant clones with the Tn5 transposon, from which seven mutants were identified presenting reduced expression of cspC: CCNA03569 (hypothetical protein); CCNA02510 (polysaccharide deacetylase); CCNA01594 (ribosomal protein L11 methyltransferase); CCNA02186 (acetolactate synthase 3 regulatory subunit); CCNA00084 (bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase); CCNA03616 (sulfite reductase (NADPH)) e CCNA01448 (fructose 1,6-bisphosphatase II). Expression assays in the presence of a conditioned medium, showed that cspC and cspD are apparently not induced in response to increased cell density. The phenotype of the mutant cspC was evaluated as to oxidative stress resistance in the stationary phase. The results showed that the <font face=\"Symbol\">DcspC strain is highly sensitive to hydrogen peroxide and superoxide but is not sensitive to organic hydroperoxide. The absence of cspC probably is compensated by dps, since the expression of this gene is increased in <font face=\"Symbol\">DcspC strain. In contrast, the transcritpion of katG is decreased, but the activities of KatG and SodB are not affected in the cspC mutant. Under conditions of stress caused by hydrogen peroxide, sucrose or salt, cspC expression is not affected. The sigma factors sigmas SigT and SigU and transcription regulator Fur are not involved in the regulation of cspC, but cspC expression is increased in <font face=\"Symbol\">DsigJ and decreased in <font face=\"Symbol\">DoxyR strains, respectively. It was also determined that cspC shows a positive autoregulation, which may occur via stabilization of its own mRNA.

As proteínas de choque frio pertencem a uma família de proteínas com um domínio altamente conservado, denominado domínio de choque frio (CSD). Estão envolvidas em vários processos celulares, incluindo adaptação a baixas temperaturas, estresse nutricional e fase estacionária. Em C. crescentus, uma <font face=\"Symbol\">&#945;-proteobacteria não patogênica, as proteínas CspC e CspD apresentam dois CSDs e seus níveis aumentam apenas durante a fase estacionária. Este trabalho tem como objetivo determinar os fatores de transcrição e sinais celulares envolvidos na regulação do gene cspC em C. crescentus. No presente trabalho, foi realizada a varredura de uma biblioteca de 4000 clones mutados pela inserção do transposon Tn5, onde foram identificados sete mutantes com expressão reduzida de cspC: CCNA03569 (proteína hipotética); CCNA02510 (deacetilase de oligossacarídeos); CCNA01594 (metiltransferase da proteína ribossomal L11); CCNA02186 (pequena subunidade da acetato lactato sintase); CCNA00084 (fosforibosil aminoimidazol carboxamida formiltransferase/ IMP ciclohidrase); CCNA03616 (sulfito redutase dependente de NADPH) e CCNA01448 (frutose-1,6-bisfosfatase). Através de ensaios de expressão na presença de um meio condicionado, verificou-se que cspC e cspD aparentemente não são induzidos em resposta ao aumento de densidade populacional. O fenótipo do mutante cspC na fase estacionária foi avaliado em relação a sua resistência a estresse oxidativo, e vimos que a linhagem <font face=\"Symbol\">DcspC é altamente sensível ao peróxido de hidrogênio e a superóxidos, mas não é sensível a hidroperóxido orgânico. A ausência de cspC provavelmente é compensada por dps, já que a expressão deste gene aumenta no mutante <font face=\"Symbol\">DcspC. Por outro lado, a transcrição de katG diminui, mas as atividades de KatG e SodB não são afetadas no mutante cspC. Em condições de estresses provocados por peróxido de hidrogênio, sacarose e sal a expressão de cspC não é afetada. Os fatores sigmas SigT e SigU e o regulador de transcrição Fur não estão envolvidos na regulação de cspC, mas no mutante <font face=\"Symbol\">DsigJ a expressão de cspC aumenta, e no mutante <font face=\"Symbol\">DoxyR ela é diminuída. Foi verificado também que cspC apresenta uma autoregulação positiva, que pode se dar por meio de estabilização de seu próprio mRNA. / The cold shock proteins belong to a family of proteins presenting a highly conserved domain, called cold shock domain (CSD). They are involved in various cellular processes, including adaptation to low temperature, nutritional stress, cell growth and stationary phase. In C. crescentus, a non-pathogenic <font face=\"Symbol\">&#945;-proteobacteria, the cold shock proteins CspC and CspD have two CSDs and they are induced during stationary phase. This study aims to determine the transcription factors and cellular signals involved in cspC gene regulation in C. crescentus. In the present study we scanned a library of 4000 mutant clones with the Tn5 transposon, from which seven mutants were identified presenting reduced expression of cspC: CCNA03569 (hypothetical protein); CCNA02510 (polysaccharide deacetylase); CCNA01594 (ribosomal protein L11 methyltransferase); CCNA02186 (acetolactate synthase 3 regulatory subunit); CCNA00084 (bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase); CCNA03616 (sulfite reductase (NADPH)) e CCNA01448 (fructose 1,6-bisphosphatase II). Expression assays in the presence of a conditioned medium, showed that cspC and cspD are apparently not induced in response to increased cell density. The phenotype of the mutant cspC was evaluated as to oxidative stress resistance in the stationary phase. The results showed that the <font face=\"Symbol\">DcspC strain is highly sensitive to hydrogen peroxide and superoxide but is not sensitive to organic hydroperoxide. The absence of cspC probably is compensated by dps, since the expression of this gene is increased in <font face=\"Symbol\">DcspC strain. In contrast, the transcritpion of katG is decreased, but the activities of KatG and SodB are not affected in the cspC mutant. Under conditions of stress caused by hydrogen peroxide, sucrose or salt, cspC expression is not affected. The sigma factors sigmas SigT and SigU and transcription regulator Fur are not involved in the regulation of cspC, but cspC expression is increased in <font face=\"Symbol\">DsigJ and decreased in <font face=\"Symbol\">DoxyR strains, respectively. It was also determined that cspC shows a positive autoregulation, which may occur via stabilization of its own mRNA.

A calcineurina é uma fosfatase ativada por Ca2+ e calmodulina presente em todos os eucariotos que, em fungos, atua na sinalização de eventos em resposta a estímulos do ambiente e tem papel essencial na patogenicidade de fungos causadores de doenças. O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica profunda de importância para a Saúde Pública no Brasil e no restante da América Latina. Neste e em outros fungos dimórficos patogênicos, a transição dimórfica é necessária para o desenvolvimento de patogenicidade, sendo a calcineurina essencial o dimorfismo. Neste trabalho foram caracterizadas as estruturas gênicas das duas subunidades que compõe o heterodímero de calcineurina e sua expressão durante a transição dimórfica. Foram sugeridos possíveis alvos moleculares de interação com a calcineurina através de bioinformática e os níveis de expressão de três deles foram analisados durante a transição dimórfica. Espera-se que este trabalho contribua para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a transição dimórfica, virulência e patogenicidade em P. brasiliensis e, dessa forma, auxilie no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a paracoccidioidomicose. / The calcineurin is a Ca2+/almodulin-dependent phosphatase present in all eukaryotes. In fungi, it acts as a signaling molecule that works in response to environmental stimuli and has key role in pathogen city of diverse disease-causing fungi. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus and the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis important to public health in Brazil and other Latin Americans countries. As in other dimorphic pathogenic fungi, the dimorphic transition is necessary for the development of pathogenicity, with calcineurin playing an essential role to the process of dimorphism. In this work we characterized the gene structures of two subunits that make up the calcineurin heterodimer as well as its expression during the dimorphic transition. We raised possible targets for molecular interaction with calcineurin by bioinformatics and the levels of expression of three of them were examined during the dimorphic transition. We expect that this work might contribute to a better understanding of the mechanisms that regulate the dimorphic transition, virulence and pathogenicity in P. brasiliensis and thus help in developing of new therapeutic approaches against paracoccidioidomycosis.