A febre reumática é uma das sequelas da infecção causada por Streptococcus pyogenes, afetando notadamente crianças e jovens, com altas taxas de morbidade e mortalidade em várias regiões do mundo, incluindo Brasil. Perfis imunoquímicos desenvolvidos por antígenos celulares e extracelulares desta bactéria e isotipos de anticorpos presentes em pacientes com febre reumática foram averiguados, em virtude da escassez de informação a este respeito na literatura. Na primeira fase do trabalho, as condições para o preparo de antígenos, bem como de técnicas, em especial a técnica super-micro de neutralização de anticorpos (Ac) anti-estreptolisina O (ASLO) foram padronizadas. Na segunda etapa, foram identificadas as bandas de antígenos celulares e extracelulares reconhecidas por 56 soros de pacientes com febre reumática (Grupo A), 91 soros de indivídos sem diagnóstico de sequelas não-supurativas da infecção, mas com títulos baixos, médios e altos de Ac ASLO (Grupo B), e 41 soros de crianças sem infecção (Grupo C). Em pacientes com febre reumática, Acs IgG e IgA foram detectados, mas Acs IgM não foram encontrados. Anticorpos IgG de pacientes do grupo A reconheceram um total de 30 bandas do antígeno celular, sendo específicas 18 (14, 17, 19,22,23,28,29,32,36, 73, 83, 102, 104, 108, 11 0, 116, 118 e 125 kDa). O resto das 12 bandas foram consideradas não específicas por serem reconhecidas por soros do grupo C. Um total de 19 bandas do antígeno extracelular foi reconhecido por Acs IgG do grupo A, sendo apenas 3 bandas (40, 46, 125 kDa) específicas. No grupo C, Acs IgA não foram detectados. Um total de 14 bandas (23, 30, 38, 42, 43, 46, 48, 54, 57, 60, 67, 73, 78 e 116 kDa) do antígeno celular foram identificadas por Acs IgA do grupo A. No antígeno extracelular, 8 bandas (38, 48, 54, 60, 67,\" 73, 78 e 95 kDa) foram reconhecidas por Acs IgA do mesmo grupo. Critério adotado de combinar dados imunoquímicos ou seja, bandas iguais ou maiores que 102 kDa e/ou bandas iguais ou menores que 29 kDa do antígeno celular de S. pyogenes, acrescido da presença de Acs IgA, possibilitaram a discriminação de pacientes com febre reumática e de não infectados, fornecendo máxima sensibilidade, especificidade, eficiência, bem como de valores preditivos de resultados positivo e negativo. Ademais, os achados de Acs IgG contra banda de 28 kDa que está relacionada a antígeno do tecido cardíaco, um dos 6 perfís imunoquímicos fornecidos por antígeno celular e Acs IgG do presente estudo, e a presença de Acs IgA parecem constituir sinais precoces associados à patogênese da febre reumática. Desta forma no grupo B, 9 pacientes revelaram a banda de 23 kDa do antígeno celular, destes 7 apresentaram perfis compatíveis com os do grupo A, sendo que apenas 1 deles não apresentou Acs IgA. Os dados sugerem que estes pacientes tendem a evoluir para a forma sintomática da febre reumática, requerendo acompanhamento clínico e laboratorial cuidadoso. / The rheumatic fever is one of the sequelae from the Streptococcus pyogenes infection, affecting manly children and young persons, with high rates of morbidity and mortality in many regions of the world. Immunological profiles developed by cellular and extracellular antigens from this bacterium and antibody isotypes found in the patients with rheumatic fever were investigated, due to the scarcity of information about this aspect in the literature. In the first step of this work, conditions to prepare antigens, as well as of techniques, in particular the super-micro technique for the neutralization of antistreptolysin O (ASLO) antibodies (Abs), were standardized. In the second step, bands of cellular and extracellular antigens recognized by 56 serum sera from patients with rheumatic fever (Grupo A), 91 sera from individuals with no diagnosis of supurative sequelae from the infection, but with low, moderate and high ASLO titers (Group B), and 41 sera from children with no infection (Group C) were identified. In patients with rheumatic fever, IgG and IgA antibodies were found, but IgM antibodies were absent. IgG antibodies from rheumatic fever patients recognized 30 bands of the cellular antigens, of these 18 were specific (14,17,19,22,23,28,29,32,36,73,83,102, 104, 108, 110, 116, 118 e 125 kDa). The remaing 12 bands were considered nonspecific because they were recognized by sera from the group C. A total of 19 bands of the extracellular antigen were recognized by IgG Abs from the group A and 3 of these (40, 46 and 125 kDa) were specific. In the group C, no IgA Abs were detected. A total of 14 specific bands (23, 30, 38, 42, 43, 46, 48, 54, 57, 60, 67, 73, 78 and 116 kDa) of the cellular antigen were identified by IgA Abs from the group A. The extracellular antigen had 8 bands (38, 48, 54, 60, 67, 73, 78 and 95 kDa) recognized by IgA Abs from the same group. A criterion adopted of combining immunchemical data, i.e. bands equal or higher than 102 kDa and/or bands equal or lower than 29 kDa of the cellular antigen of S. pyogenes plus the IgA Ab finding, allowed to discriminate rheumatic fever from noninfected individuals, providing maximum sensitivity, specificity, efficiency as well as predictives of positive and negative results. Moreover, the findings of IgG Abs to 23 kDa of the cellular antigen which is associated to the heart tissue antigen, one of those 6 immunochemical profiles provided by cellular antigen and IgG Abs from this study, and the presence of IgA Abs seem to constitute early immunologic signals related to the pathogenesis of the rhematic fever. Thus in the group B, 9 patients revealed a 23 kDa band of cellular antigen, 7 of these showed immunochemical profiIes consistent with those from the group A, and lacking IgA Abs in onIy one of them. The data suggest these patients are prone to deveIop rheumatic fever, requiring a close clinical and laboratory follow-up.

Arranjos supramoleculares combinando o lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DOD) com polímeros, como carboximetilcelulose (CMC) e cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA), foram preparados na forma de nanopartículas (NPs), na ausência ou presença de antimicrobiano tradicional, como a claritromicina (CLA). NPs preparadas por atração eletrostática entre os fragmentos de bicamada (BF) de DOD, CMC e PDDA foram avaliadas, in vitro, quanto à atividade contra isolados clínicos de micro-organismos multirresistentes (MR) a antimicrobianos, como Pseudomonas aeruginosa MR, Klebsiella pneumoniae produtora da enzima carbapenemase do tipo KPC, Staphylococcus aureus resistente à meticilina/oxacilina (MRSA) e Candida albicans resistente ao fluconazol, através do método de plaqueamento e contagem de viáveis. As NPs de DOD BF/CMC/PDDA apresentam alta atividade de amplo espectro contra micro-organismos MR, em que o PDDA é o componente responsável pela excelente atividade biocida das NPs. O mecanismo de ação antimicrobiana indica a dissociação dessas NPs na presença dos micro-organismos, com a remoção de biopolímeros da parede celular microbiana pelo PDDA, conforme visualizado por microscopia eletrônica de varredura, ocorrendo lise da membrana microbiana e liberação de compostos fosforilados para o meio extracelular. Também foram desenvolvidas neste trabalho NPs carreadoras de CLA à base de DOD e polímeros. Solução etanólica contendo CLA/DOD foi injetada em solução aquosa de CMC, formando arranjos coloidalmente estáveis e aniônicos, que posteriormente foram adicionados de solução de PDDA, para a obtenção de arranjos estáveis e catiônicos. CLA/DOD/CMC e CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporaram CLA em quantidade suficiente para inibir o crescimento de M. abscessus no interior de macrófagos bem como evitar a formação de biofilmes, sendo que altas doses de CLA foram tóxicas aos macrófagos, enquanto doses menores apresentaram baixa toxicidade e boa atividade antimicrobiana. NPs catiônicas carreando CLA foram tóxicas aos macrófagos nas concentrações de PDDA testadas. A natureza particulada das CLA NPs possivelmente aumenta a retenção intracelular de CLA em comparação com CLA livre, podendo prolongar atividade da CLA contra patógenos intracelulares. Desta maneira, arranjos supramoleculares combinando lípide e polímeros, com ou sem antimicrobianos tradicionais poderão encontrar diversas aplicações nas áreas farmacêutica, médica, alimentícia e biotecnológica. / Supramolecular assemblies combining cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DOD) and polymers, such as sodium carboxymethylcellulose (CMC) and poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA), were prepared as nanoparticles (NPs), in the absence or presence of traditional antibiotic, such as clarithromycin (CLA). NPs prepared by electrostatic attraction between DOD bilayer fragments (BF), CMC and PDDA were evaluated against clinical strains of multidrug resistant (MDR) microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa MDR, Klebsiella pneumoniae producer of KPC carbapenemase enzyme, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Candida albicans fluconazole resistant, by plating and colony forming unities counting. DOD BF/CMC/PDDA NPs display high and broad-spectrum activity against MDR microrganisms, and PDDA is the excellent biocidal component in the NPs. The mechanism of antimicrobial action shows that NPs disassembly in the presence of microrganisms, with biopolymers withdrawn from the cell wall, as observed by scanning electron microscopy, consecutively lysing bacterial membrane as determined from the leakage of inner phosphorylated compounds. In this work there have also been developed NPs, based on lipid and polymers, as carriers for CLA. Ethanolic solution co-solubilizing CLA/DOD was injected in CMC aqueous solution, yielding colloidaly stable and anionic NPs, that were further added of PDDA solution, yielding stable and cationic NPs. CLA/DOD/CMC NPs and CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporated CLA at doses high enough to inhibit M. abscessus growth inside macrophages or in biofilms. Larger CLA doses were toxic to macrophages while lower CLA doses reduced toxicity to macrophages despite their high antimicrobial activity. Cationic CLA NPs exhibited substantial toxicity against macrophages at the PDDA concentrations tested. The particulate nature of these CLA NPs possibly increases intracellular CLA retention in comparison to free CLA, probably extending CLA activity against intracellular pathogens. In conclusion, supramolecular assemblies combining cationic lipid and polymers, with or without traditional antibiotics, may find multiple possibilities of applications at pharmaceutical, medical, food and biotecnological fields.

A tuberculose continua sendo um grave problema de saúde pública mundial. O principal agente etiológico da doença é o Mycobacterium tuberculosis, infectando entre outras células, os macrófagos. A infecção pode manter-se latente por vários anos sem causar sintomas clínicos aparentes. Para esta pesquisa, foi proposto o estudo de indução de marcadores de resposta inflamatória em células THP-1 diferenciadas em macrófagos utilizando isolados micobacterianos sensíveis, uni ou multidrogas resistentes transfectados com o plasmídeo pFPCAGFP carreando o gene da proteína verde fluorescente, como marcador de infecção celular. Objetivou também avaliar a relação entre isolados clínicos de M.tuberculosis sensíveis ou com resistência a uma ou multidrogas e sua relação à virulência. Para isso, culturas da linhagem monocítica humana (THP-1) foram mantidas para posterior infecção por isolados clínicos, genotipicamente identificados pertencentes à nossa micobacterioteca. A expressão do RNAm foi quantificada e avaliada por RTPCR e posteriormente, PCR em tempo real foi realizado. Após infecção das células THP-1 diferenciadas em macrófagos, observou-se que houve um aumento na expressão das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e TLRs (TLR2 e TLR4) em relação ao controle da infecção. As análises estatísticas permitiram a correlação na expressão destas citocinas e TLRs, e através desses resultados, foi possível constatar que TLR2 regula a expressão das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e que os Isolados clínicos com maior resistência, sinalizam melhor a expressão das citocinas próinflamatórias e TLRs, ao passo que isolados clínicos sensíveis, possuem uma fraca sinalização. / Tuberculosis is the major causative of death and morbidity and still is a serious problem to the health in the world. Mycobacterium tuberculosis is the major causative agent of tuberculosis disease, infecting cells like macrophages. The infection can keep dormant for several years without any clinical symptoms. For this research, the study was proposed for induction of markers of inflammatory response in cells differentiated THP-1 in macrophages by clinical isolates from sensitive or multidrug resistant mycobacteria caring pFPCAGFP plasmid that contains green fluorescent protein gene, a marker of infection cell. Also objective assesses the relationship between clinical isolates of sensitive or with resistance to one or four drugs M.tuberculosis and its relationship to virulence. For this, cultures of monocitic lineage human (THP-1) were kept for subsequent infection by clinical isolates, genotypically identified belonging to our mycobacterioteca. The expression of mRNA was quantified and evaluated by RT-PCR and subsequently, real-time PCR was performed. After infection of the THP-1 differentiated cells in macrophages, it was observed that there was an increase expression of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6 and TNF-α) and TLRs (TLR2 and TLR4) compared to infection control. Statistical analyses allowed expression correlation of these cytokines and TLRs, and through those results, it was possible to see that TLR2 regulates pro-inflammatory cytokines (IL-1β , IL-6 and TNF-α) expression and those clinical isolates with four resistance have better signal of pro-inflammatory cytokines and TLRs expression, while sensitive clinical isolates, has a weak signal.

Arranjos supramoleculares combinando o lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DOD) com polímeros, como carboximetilcelulose (CMC) e cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA), foram preparados na forma de nanopartículas (NPs), na ausência ou presença de antimicrobiano tradicional, como a claritromicina (CLA). NPs preparadas por atração eletrostática entre os fragmentos de bicamada (BF) de DOD, CMC e PDDA foram avaliadas, in vitro, quanto à atividade contra isolados clínicos de micro-organismos multirresistentes (MR) a antimicrobianos, como Pseudomonas aeruginosa MR, Klebsiella pneumoniae produtora da enzima carbapenemase do tipo KPC, Staphylococcus aureus resistente à meticilina/oxacilina (MRSA) e Candida albicans resistente ao fluconazol, através do método de plaqueamento e contagem de viáveis. As NPs de DOD BF/CMC/PDDA apresentam alta atividade de amplo espectro contra micro-organismos MR, em que o PDDA é o componente responsável pela excelente atividade biocida das NPs. O mecanismo de ação antimicrobiana indica a dissociação dessas NPs na presença dos micro-organismos, com a remoção de biopolímeros da parede celular microbiana pelo PDDA, conforme visualizado por microscopia eletrônica de varredura, ocorrendo lise da membrana microbiana e liberação de compostos fosforilados para o meio extracelular. Também foram desenvolvidas neste trabalho NPs carreadoras de CLA à base de DOD e polímeros. Solução etanólica contendo CLA/DOD foi injetada em solução aquosa de CMC, formando arranjos coloidalmente estáveis e aniônicos, que posteriormente foram adicionados de solução de PDDA, para a obtenção de arranjos estáveis e catiônicos. CLA/DOD/CMC e CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporaram CLA em quantidade suficiente para inibir o crescimento de M. abscessus no interior de macrófagos bem como evitar a formação de biofilmes, sendo que altas doses de CLA foram tóxicas aos macrófagos, enquanto doses menores apresentaram baixa toxicidade e boa atividade antimicrobiana. NPs catiônicas carreando CLA foram tóxicas aos macrófagos nas concentrações de PDDA testadas. A natureza particulada das CLA NPs possivelmente aumenta a retenção intracelular de CLA em comparação com CLA livre, podendo prolongar atividade da CLA contra patógenos intracelulares. Desta maneira, arranjos supramoleculares combinando lípide e polímeros, com ou sem antimicrobianos tradicionais poderão encontrar diversas aplicações nas áreas farmacêutica, médica, alimentícia e biotecnológica. / Supramolecular assemblies combining cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DOD) and polymers, such as sodium carboxymethylcellulose (CMC) and poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA), were prepared as nanoparticles (NPs), in the absence or presence of traditional antibiotic, such as clarithromycin (CLA). NPs prepared by electrostatic attraction between DOD bilayer fragments (BF), CMC and PDDA were evaluated against clinical strains of multidrug resistant (MDR) microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa MDR, Klebsiella pneumoniae producer of KPC carbapenemase enzyme, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Candida albicans fluconazole resistant, by plating and colony forming unities counting. DOD BF/CMC/PDDA NPs display high and broad-spectrum activity against MDR microrganisms, and PDDA is the excellent biocidal component in the NPs. The mechanism of antimicrobial action shows that NPs disassembly in the presence of microrganisms, with biopolymers withdrawn from the cell wall, as observed by scanning electron microscopy, consecutively lysing bacterial membrane as determined from the leakage of inner phosphorylated compounds. In this work there have also been developed NPs, based on lipid and polymers, as carriers for CLA. Ethanolic solution co-solubilizing CLA/DOD was injected in CMC aqueous solution, yielding colloidaly stable and anionic NPs, that were further added of PDDA solution, yielding stable and cationic NPs. CLA/DOD/CMC NPs and CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporated CLA at doses high enough to inhibit M. abscessus growth inside macrophages or in biofilms. Larger CLA doses were toxic to macrophages while lower CLA doses reduced toxicity to macrophages despite their high antimicrobial activity. Cationic CLA NPs exhibited substantial toxicity against macrophages at the PDDA concentrations tested. The particulate nature of these CLA NPs possibly increases intracellular CLA retention in comparison to free CLA, probably extending CLA activity against intracellular pathogens. In conclusion, supramolecular assemblies combining cationic lipid and polymers, with or without traditional antibiotics, may find multiple possibilities of applications at pharmaceutical, medical, food and biotecnological fields.

A febre reumática é uma das sequelas da infecção causada por Streptococcus pyogenes, afetando notadamente crianças e jovens, com altas taxas de morbidade e mortalidade em várias regiões do mundo, incluindo Brasil. Perfis imunoquímicos desenvolvidos por antígenos celulares e extracelulares desta bactéria e isotipos de anticorpos presentes em pacientes com febre reumática foram averiguados, em virtude da escassez de informação a este respeito na literatura. Na primeira fase do trabalho, as condições para o preparo de antígenos, bem como de técnicas, em especial a técnica super-micro de neutralização de anticorpos (Ac) anti-estreptolisina O (ASLO) foram padronizadas. Na segunda etapa, foram identificadas as bandas de antígenos celulares e extracelulares reconhecidas por 56 soros de pacientes com febre reumática (Grupo A), 91 soros de indivídos sem diagnóstico de sequelas não-supurativas da infecção, mas com títulos baixos, médios e altos de Ac ASLO (Grupo B), e 41 soros de crianças sem infecção (Grupo C). Em pacientes com febre reumática, Acs IgG e IgA foram detectados, mas Acs IgM não foram encontrados. Anticorpos IgG de pacientes do grupo A reconheceram um total de 30 bandas do antígeno celular, sendo específicas 18 (14, 17, 19,22,23,28,29,32,36, 73, 83, 102, 104, 108, 11 0, 116, 118 e 125 kDa). O resto das 12 bandas foram consideradas não específicas por serem reconhecidas por soros do grupo C. Um total de 19 bandas do antígeno extracelular foi reconhecido por Acs IgG do grupo A, sendo apenas 3 bandas (40, 46, 125 kDa) específicas. No grupo C, Acs IgA não foram detectados. Um total de 14 bandas (23, 30, 38, 42, 43, 46, 48, 54, 57, 60, 67, 73, 78 e 116 kDa) do antígeno celular foram identificadas por Acs IgA do grupo A. No antígeno extracelular, 8 bandas (38, 48, 54, 60, 67,\" 73, 78 e 95 kDa) foram reconhecidas por Acs IgA do mesmo grupo. Critério adotado de combinar dados imunoquímicos ou seja, bandas iguais ou maiores que 102 kDa e/ou bandas iguais ou menores que 29 kDa do antígeno celular de S. pyogenes, acrescido da presença de Acs IgA, possibilitaram a discriminação de pacientes com febre reumática e de não infectados, fornecendo máxima sensibilidade, especificidade, eficiência, bem como de valores preditivos de resultados positivo e negativo. Ademais, os achados de Acs IgG contra banda de 28 kDa que está relacionada a antígeno do tecido cardíaco, um dos 6 perfís imunoquímicos fornecidos por antígeno celular e Acs IgG do presente estudo, e a presença de Acs IgA parecem constituir sinais precoces associados à patogênese da febre reumática. Desta forma no grupo B, 9 pacientes revelaram a banda de 23 kDa do antígeno celular, destes 7 apresentaram perfis compatíveis com os do grupo A, sendo que apenas 1 deles não apresentou Acs IgA. Os dados sugerem que estes pacientes tendem a evoluir para a forma sintomática da febre reumática, requerendo acompanhamento clínico e laboratorial cuidadoso. / The rheumatic fever is one of the sequelae from the Streptococcus pyogenes infection, affecting manly children and young persons, with high rates of morbidity and mortality in many regions of the world. Immunological profiles developed by cellular and extracellular antigens from this bacterium and antibody isotypes found in the patients with rheumatic fever were investigated, due to the scarcity of information about this aspect in the literature. In the first step of this work, conditions to prepare antigens, as well as of techniques, in particular the super-micro technique for the neutralization of antistreptolysin O (ASLO) antibodies (Abs), were standardized. In the second step, bands of cellular and extracellular antigens recognized by 56 serum sera from patients with rheumatic fever (Grupo A), 91 sera from individuals with no diagnosis of supurative sequelae from the infection, but with low, moderate and high ASLO titers (Group B), and 41 sera from children with no infection (Group C) were identified. In patients with rheumatic fever, IgG and IgA antibodies were found, but IgM antibodies were absent. IgG antibodies from rheumatic fever patients recognized 30 bands of the cellular antigens, of these 18 were specific (14,17,19,22,23,28,29,32,36,73,83,102, 104, 108, 110, 116, 118 e 125 kDa). The remaing 12 bands were considered nonspecific because they were recognized by sera from the group C. A total of 19 bands of the extracellular antigen were recognized by IgG Abs from the group A and 3 of these (40, 46 and 125 kDa) were specific. In the group C, no IgA Abs were detected. A total of 14 specific bands (23, 30, 38, 42, 43, 46, 48, 54, 57, 60, 67, 73, 78 and 116 kDa) of the cellular antigen were identified by IgA Abs from the group A. The extracellular antigen had 8 bands (38, 48, 54, 60, 67, 73, 78 and 95 kDa) recognized by IgA Abs from the same group. A criterion adopted of combining immunchemical data, i.e. bands equal or higher than 102 kDa and/or bands equal or lower than 29 kDa of the cellular antigen of S. pyogenes plus the IgA Ab finding, allowed to discriminate rheumatic fever from noninfected individuals, providing maximum sensitivity, specificity, efficiency as well as predictives of positive and negative results. Moreover, the findings of IgG Abs to 23 kDa of the cellular antigen which is associated to the heart tissue antigen, one of those 6 immunochemical profiles provided by cellular antigen and IgG Abs from this study, and the presence of IgA Abs seem to constitute early immunologic signals related to the pathogenesis of the rhematic fever. Thus in the group B, 9 patients revealed a 23 kDa band of cellular antigen, 7 of these showed immunochemical profiIes consistent with those from the group A, and lacking IgA Abs in onIy one of them. The data suggest these patients are prone to deveIop rheumatic fever, requiring a close clinical and laboratory follow-up.