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Désassemblage de réseaux de filaments d'actine : rôle de l'architecture et du confinement / Actin filament network disassembly : role of architecture and confinement

Gressin, Laurène 18 November 2016 (has links)
Le cytosquelette est un assemblage de protéines intracellulaires qui assure le maintien de la forme des cellules et la production de force. Ce cytosquelette est formé de trois types de polymères, dont les filaments d'actine qui sont impliqués dans des fonctions essentielles telles que la motilité cellulaire, la division cellulaire ou encore la morphogénèse. Les filaments d'actine s'agencent en structures organisées dont la dynamique est assurée par la polymérisation et le désassemblage des filaments, contrôlés spatio-temporellement. La plupart des structures d'actine sont dans un état stationnaire dynamique où l'assemblage est compensé par le désassemblage, ce qui permet de maintenir une concentration de monomères intracellulaire élevée. En effet, le réservoir d'actine in vivo est limité et la formation de nouvelles structures de filaments d'actine est dépendante d'un désassemblage efficace des structures les plus âgées. Le but de ma thèse a été d'étudier comment l'organisation architecturale des structures d'actine influence le désassemblage par la machinerie protéique composée de l'ADF/cofiline et d'un de ses cofacteurs Aip1.J'ai d'abord pu montrer que l'efficacité du désassemblage dépendait de l'agencement des filaments d'actine. Quand les réseaux branchés ne requièrent que l'action de l'ADF/cofiline pour être désassemblés efficacement, les faisceaux de filaments d'actine ont besoin de la présence simultanée de l'ADF/cofiline et de l'Aip1. Une étude à l'échelle moléculaire a ensuite été menée pour comprendre le mécanisme du désassemblage des filaments d'actine par ces deux protéines au niveau du filament individuel.Dans un second temps, j'ai développé un système expérimental composé de micropuits de taille comparable à la cellule. Cette technologie nous a permis de réaliser des expériences en milieu confiné, dans lequel le réservoir d'actine était limité de la même manière que le réservoir d'actine cellulaire. J'ai mis ce système a profit pour reconstituer le turnover d'une comète d'actine, un réseau branché formé à la surface d'une bille recouverte de nucléateurs de l'actine.Ce travail de thèse a permis d’établir des lois fondamentales contrôlant la dynamique de l’actine et plus particulièrement comment l’architecture de l’actine et l’environnement peuvent influencer le désassemblage de structures complexes. / The actin cytoskeleton is a major component of the internal architecture of eukaryotic cells. Actin filaments are organized into different structures, the dynamics of which is spatially and temporally controlled by the polymerization and disassembly of filaments. Most actin structures are in a dynamic steady state regime where the assembly is balanced by the disassembly, which maintains a high concentration of intracellular actin monomers. In vivo the pool of actin monomers is limited and the formation of new actin filament structures is dependent on an effective disassembly of the older structures. The goal of my thesis was to study the influence of different architectures of actin by the disassembly machinery made of ADF/cofilin and its cofactor Aip1.Firstly, I showed that the efficiency of the disassembly was dependent on the architecture of actin filaments organizations. Although the branched networks need only ADF/cofilin to be efficiently disassembled, the actin cables require the simultaneous action of ADF/cofilin and Aip1. Further investigations at the molecular scale indicate that the cooperation between ADF/cofilin and Aip1 is optimal above a certain threshold of molecules of ADF/cofilin bound to actin filaments. During my PhD I demonstrated that although ADF/cofilin is able to dismantle selectively branched networks through severing and debranching, the stochastic disassembly of actin filaments by ADF/cofilin and Aip1 represents an efficient alternative pathway for the full disassembly of all actin networks. We propose a model in which the binding of ADF/cofilin is required to trigger a structural change of the actin filaments, as a prerequisite for their disassembly by Aip1.Secondly, I developed an experimental system made of cell-sized microwells. This technology allowed us to develop experiments in a closed environment in which the actin pool is limited in the same way as the cellular environment. I used this experimental system to study how a limited pool of components limits both the assembly and the disassembly of a branched network.This thesis highlights the importance of developing new tools to obtain more “physiological” reconstituted systems in vitro to establish some of the general principles governing actin dynamics.
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Mechanically micropatterned polyelectrolyte multilayers to control cell behavior / Multicouches de polyélectrolytes aux propriétés mécaniques spatialement contrôlées : étude de cellules eucaryotes et procaryotes

Saha, Naresh 18 December 2013 (has links)
Les films polyélectrolytes ont émergé comme un outil polyvalent dans le domaine desbiomatériaux et de l’ingénierie tissulaire. Dans cette étude, nous avons conçu des films à base debiopolymère, dont la rigidité peut être modulée par photo-réticulation. L’adhésion de bactéries etde cellules mammifères sur ces films a été étudiée. Une telle manipulation de rigidité superficielleconduit à une réponse différentielle des bactéries et des cellules mammifères. Les bactéries àGram négatif présentent une meilleure croissance sur des films nous alors que les cellulesmammifères préféraient les films plus rigides. Ces films ont été spatialement structurés à l’aided’un photomasque, permettant de créer des zones adjacentes de rigidité variable et de formecontrôlée. Les motifs photostructurés ont conduit les cellules à s’organiser préférentiellement surles zones les plus rigides. Une étude comparative a été réalisée avec des micropatronsbiochimiques. Les résultats ont montré des réponses similaires pour trois types cellulairesdifférents. Ces films offrent des perspectives intéressantes pour l’ingénierie tissulaire et pour letest de médicaments. / Polyelectrolyte multilayers have emerged as a versatile tool in the field of biomaterials and tissueengineering. In this study, photocrosslinkable polyelectrolyte films based on biopolymers whosestiffness can be easily tuned by UV irradiation were prepared. Then, they were tested againstbacteria and mammalian cells to address the influence of the film stiffness on cell behavior. Suchsuperficial stiffness manipulation resulted in differential response of bacteria and mammaliancells. Gram negative bacteria evidenced better growth on softer films while various mammaliancells preferred stiffer films. Stiffness patterns of various geometries and sizes were generated byexposing the films to the UV light through a photomask incorporated in transparent substrates.The patterned films composed of stiff motifs distributed in a soft background induced apreferential spatial organization, which depended on pattern shape and size. A comparative studywith commercial biochemical patterns revealed similar pattern fidelity for three differentmammalian cell types. Such mechanical patterns on a 2D film appear promising for futureapplications in tissue engineering or for drug screening.
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Etude des mécanismes régissant les divisions symétriques et asymétriques dans les cellules souches musculaires squelettiques / Investigation of mechanisms regulating symmetric and asymmetric cell divisions in skeletal muscle stem cells

Yennek, Siham 25 September 2015 (has links)
Pendant la régénération musculaire, les cellules souches musculaires (dites satellites) prolifèrent de manière symétrique et asymétrique. La ségrégation non aléatoire des brins d'ADN est un mécanisme associé à la division asymétrique, souvent en lien avec des destins cellulaires distincts. Quand ce phénomène apparaît et comment il est régulé durant la régénération musculaire sont des points clés sur lesquels je me suis focalisée durant ma thèse. Afin d'étudier le rôle de signaux extracellulaires dans les décisions du type de division, nous avons utilisé des micropatrons de motifs symétrique et asymétrique recouverts de matrice extracellulaire. Nous avons alors montré que les fréquences de divisions asymétriques peuvent être modulées selon la forme du motif. En outre, nous décrivons une fenêtre de temps in vivo au cours de la régénération musculaire où une sous population de cellules satellites peut passer d'une division symétrique à asymétrique. Une analyse transcriptionnelle de ces cellules a permis d'identifier des gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation de cette transition. Nous avons testé l'effet de quelques protéines associées à ces gènes incorporées dans des niches artificielles 2D. Des données préliminaires suggérèrent que des signaux extrinsèques (protéine de la matrice extracellulaire et rigidité du substrat) combinés à une signalisation intracellulaire peuvent réguler la balance entre prolifération et différentiation. L'ensemble de ces données de thèse montre l'importance d'un dialogue entre le microenvironnement et les signaux intracellulaires dans la régulation du comportement des cellules souches. / During muscle regeneration, muscle stem (satellite) cells proliferate symmetrically and asymmetrically. Non-random segregation of old and new template DNA strands (NRDS) is one mechanism associated with an asymmetric cell division, and this is often linked with distinct daughter cell fates. How this frequency is modulated and when during tissue remodelling are key questions that are the focus of my thesis project. To address the role of extrinsic cues in NRDS and cell fate decisions, we used micropatterns coated with extracellular matrix and designed with symmetric and asymmetric topological motifs. We show that the frequency of NRDS and transcription factors asymmetry (Pax7, stem; Myogenin, differentiated) can be modulated depending on the topology of the adhesion cues of the micropattern. Moreover, we show that a temporal switch occurs in vivo during early muscle regeneration from symmetric to asymmetric DNA segregation in a subpopulation of satellite cells. Gene expression profiling of symmetrically and asymmetrically dividing cells allowed the identification of candidate regulators that might impinge on this regulatory transition. Some candidate genes were assayed in a high throughput screen that was on 2D artificial stem-cell niches. Preliminary data show that extrinsic cues (ECM protein and substrate stiffness) combined with signalling pathways can regulate the balance between proliferation and differentiation in a context dependent manner. Taken together, this thesis project shows that the interplay between microenvironment and intracellular signalling impacts on the regulation of stem cell behaviour.

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