La combinaison de plusieurs procédés d’imagerie et de mesure permet d’obtenir des ensembles de données complémentaires et parfois uniques. A l’aide d’une technique hybride de microscopie présentant des modalités de mesure différentes et des enregistrements synchrones, on peut recueillir des informations complémentaires sur des échantillons à l’échelle nanométrique. De plus, l’intégration de procédés nanorobotiques et de logiciels open-source permet une approche technologique pour la recherche sur les semi-conducteurs et les sciences des matériaux. Ce travail démontre le potentiel d’une telle technologie. Ce démonstrateur fonctionne dans la chambre d‘un MEB et sert de plateforme technologique dans laquelle sont intégrés différentes modalités, technologies et procédés. Un AFM basé sur un interféromètre optique compact permet l’imagerie de la topographie de surface tandis qu’un microscope à micro-ondes à balayage enregistre les caractéristiques électromagnétiques dans la gamme de fréquence des micro-ondes, le tout opérant dans le même MEB. L’engin est contrôlé par un ensemble de logiciels qui est optimisé pour la nanorobotique basée sur l‘imagerie. Ce démonstrateur technologique permet d’observer en direct la région d’intérêt à l’aide du microscope électronique tandis qu’est effectuée en champ proche la caractérisation de la surface de l’échantillon par intermédiaire des micro-ondes évanescentes et des forces intermoléculaires. Ensuite, est présenté un standard multimodal de test et qui valide la fonctionnalité de l’instrument démonstrateur. Le présent travail est complété par une analyse électrique de capacités MOS ainsi que leur approximation destinée au calibrage. / Various disciplines of micro- and nanotechnology requires combinatorial tools for the investigation, manipulation and transport of materials in the submicrometer range. The coupling of multiple sensing and imaging techniques allows for obtaining complementary and often unique datasets of samples under test. By means of an integrated microscopy technique with different modalities, it is possible to gain multiple information about nanoscale samples by recording at the same time. The expansion with nanorobotics and an open-source software framework, leads to a technology approach for semiconductor research and material science. This work shows the potential of such a multimodal technology approach by focusing on a demonstrator setup. It operates under high-vacuum conditions inside the chamber of a Scanning Electron Microscope and serves as a technology platform by fusing various microscopy modalities, techniques and processes. An Atomic Force Microscope based on a compact, optical interferometer performs imaging of surface topography, and a Scanning Microwave Microscope records electromagnetic properties in the microwave frequency domain, both operating inside an SEM. A software framework controls the instrument. The setup allows for observing with SEM, while imaging and characterizing with interacting evanescent microwaves and intermolecular forces simultaneously. In addition, a multimodal test standard is introduced and subsequently confirms the functionality of the demonstrator. Within this context, the work also includes an electrical analysis of micro-scale MOS capacitors, including an approximation for use in the calibration.

Le travail effectué au cours de cette thèse a porté sur le développement et la mise en œuvre de nouvelles stratégies en microscopie non linéaire permettant d'augmenter le nombre de signaux non linéaires simultanément observables d'une part, et la vitesse d'acquisition d'autre part. Dans un premier temps, nous avons exploré la possibilité de produire des signaux multiples au moyen de deux trains d'impulsions synchronisés de longueur d'onde centrale distincte. Nous avons montré que cette approche permet d'exciter de façon optimale et simultanée trois protéines fluorescentes respectivement bleue, jaune, et rouge. Une application de cette méthode consiste à imager de grands volumes de tissus marqués avec des transgènes Brainbow dans le but d'étudier la connectivité ou le lignage cellulaire. Plus généralement, nous avons montré que cette approche permet de combiner plusieurs signaux non linéaires tels que la fluorescence, la génération de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques, ainsi que le mélange à quatre ondes (FWM). Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'augmenter la vitesse d'imagerie. Pour cela, nous avons mis en œuvre plusieurs manières de produire des faisceaux de Bessel focalisés afin d'augmenter la profondeur de champ d'un microscope à balayage. Enfin, en vue d'augmenter la vitesse d'acquisition tout en préservant le sectionnement optique, nous avons construit un microscope biphotonique à nappe de lumière de profil spatial programmable. Dans cette géométrie nous avons comparé les propriétés d'imagerie de profils d'excitation de type gaussien et de Bessel pour des applications en biologie du développement.

La polarimétrie de Mueller est une technique optique qui mesure la réponse polarimétrique complète d’un milieu sous la forme d’une seule matrice de Mueller afin de remonter à ses propriétés optiques comme le dichroïsme, la biréfringence et la dépolarisation. Le couplage avec la microscopie non-linéaire (SHG par exemple) permet d’avoir accès à des informations précises sur un milieu biologique (structure, organisation, . . .). Cela impose de passer à une modalité d’imagerie à balayage laser, qui nécessite de mesurer la réponse polarimétrique du milieu pixel-par-pixel en des temps relativement courts (de l’ordre de la microseconde). Le but de cette thèse est de mettre en oeuvre un polarimètre de Mueller dont les cadences d’acquisition sont compatibles avec l’imagerie à balayage laser. Dans un premier temps, un polarimètre de Mueller inédit est proposé, basé sur le codage spectral de la polarisation dont toute l’information polarimétrique de l’échantillon est mesurée sous la forme d’un seul signal d’intensité en un temps record (10 μs). Ce dispositif est constitué d’une source à balayage rapide en longueur d’onde à 100 kHz (ou swept-source), de lames de phase d’ordre élevé et d’un détecteur monocanal. Les erreurs systématiques qui entachent la mesure sont évaluées et des méthodes de correction permettent de les prendre en compte dans une étape d’étalonnage qui utilise la réponse de deux milieux étalons.Ensuite, le polarimètre est implémenté dans un microscope commercial à balayage laser, utilisé initialement pour réaliser de l’imagerie non-linéaire (SHG). Cela requiert un redimensionnement du montage, ainsi que la synchronisation entre les deux systèmes. Par ailleurs, un protocole de calibration du dispositif est développé et permet de tenir compte de l’ensemble des erreurs systématiques du polarimètre indépendamment des anisotropies optiques engendrées par le microscope. Enfin, les premières images polarimétriques de Mueller en microscopie à balayage laser ont été acquises sur des échantillons inhomogènes spatialement (rubans adhésifs et cristaux de roches). La potentialité de la microscopie multimodale est démontrée sur des échantillons de fibroses de foie, en couplant l’imagerie polarimétrique de Mueller et la microscopie non-linéaire au sein d’un seul instrument. / Mueller polarimetry is an optical technique allowing the acquisition of the full polarimetric signature of a medium with a single Mueller matrix, and leading to its polarimetric parameters such as dichroism, birefringence and depolarization. Coupling Mueller polarimetry with nonlinear microscopy techniques (SHG for example), more precise information about the medium could be obtained (structure, organization . . .). This imaging technique uses a laser scanning system to measure the Mueller matrix of a medium point-to-point quickly (of the order of the microsecond). The aim of this thesis is to develop a Mueller polarimeter compatible with the laser scanning system. First, a new Mueller polarimeter is proposed using spectral encoding of the polarization and measuring the full polarimetric signature of a sample with a single channeled spectrum in a fast way (10 μs). This setup is composed of a 100 kHz swept-source laser, high order retarders and a single channel detector. Systematic errors on the Mueller matrix measurement are evaluated and correction methods take into account these errors in a calibration step that uses polarimetric signature of two references medium. Then, the polarimeter is implemented on a commercial laser scanning microscope that usually images non-linear contrasts (SHG). The update needs to reduce the dimension of the polarimeter and ensure an electronic synchronization between these two systems. However, a new calibration step is proposed and takes into account all the systematic errors of the polarimeter, independently of the optical anisotropy induced by the microscope. Finally, the images with the first Mueller scanning microscope are obtained with spatially inhomogeneous samples (cellophane tapes, rocks). The potentiality of the multimodal scanning microscopy Mueller/SHG on the same instrument is demonstrated in the case of hepatic fibrosis.

La microscopie non-linéaire résolue en polarisation est un outil puissant pour accéder à des informations structurelles dans les assemblages biomoléculaires. Les interactions non-linéaires entre matière et lumière induisent des processus complexes où des champs électromagnétiques cohérents interagissent avec les dipôles de transitions moléculaires. Le contrôle de la polarisation des champs électromagnétiques excitateurs et l’étude des réponses non-linéaires induites procurent de riches informations sur la distribution angulaire des molécules présentes dans le volume focal de l’objectif du microscope. Dans cette thèse, nous appliquons cette sensibilité à la polarisation à plusieurs modalités de microscopie cohérentes sans marquage (diffusion cohérente Raman anti-Stokes (CARS), diffusion Cohérente stimulée (SRS)) et à la fluorescence à deux photons (2PEF) afin d’obtenir des informations quantitatives sur la forme de la distribution moléculaire et l’orientation des lipides dans les membranes artificielles, ainsi que dans les membranes biologiques telles que la myéline des tissus de la moelle épinière. Avec cette technique, nous adressons une question fondamentale sur le comportement des ensembles lipidiques dans les membranes et sur l’effet d’autres molécules telles que le cholestérol et les marqueurs fluorescents. Nous démontrons que le CARS résolu en polarisation permet d’accéder à de fines informations sur l’organisation des lipides dans les membranes de la myéline, en deçà de la limite de diffraction. / Polarization resolved nonlinear microscopy is a powerful tool to image structural information in biomolecular assemblies. Nonlinear interaction between light and matter lead to complex processes where coherent combinations of optical fields couple to assemblies of molecular transition dipoles. Controlling polarized optical fields and monitoring nonlinear induced signals in a medium can nevertheless bring rich information on molecular orientational organization within the focal spot of a microscope objective. In this PhD thesis we apply this polarization sensitivity to different label-free optical coherent techniques (coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS), stimulated Raman scattering (SRS)) and to two-photon fluorescence (2PEF) to retrieve quantitative information on the static molecular distribution shape and orientation of lipids in model membranes and biological membranes such as myelin sheaths in spinal cord tissues. With this technique, we address fundamental questions about lipid packing behavior in membranes, and how it can be affected by other molecules such as cholesterol and the insertion of fluorescent lipid probes. We demonstrate that polarization resolved CARS give access to fine details on lipids arrangement in myelin sheaths, at a sub-diffraction scale. In the context of experimental autoimmune encephalomyelitis disease (EAE) we show, that even at the stage of disruption of the myelin envelope during the demyelination process, lipids multilayers reveal strong capability to preserve their macroscopic self-assembly into highly organized structures, with a degree of disorganization occurring only at the molecular scale.