Background: Assessment of platelet vitality is important for patients presenting with inherited or acquired disorders of platelet function and for quality assessment of platelet concentrates. Methods: Herein we combined live stains with intra-vital confocal fluorescence microscopy in order to obtain an imaging method that allows fast and accurate assessment of platelet vitality. Three fluorescent dyes, FITC-coupled wheat germ agglutinin (WGA), tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate (TMRM) and acetoxymethylester (Rhod-2), were used to assess platelet morphology, mitochondrial activity and intra-platelet calcium levels. Microscopy was performed with a microlens-enhanced Nipkow spinning disk-based system allowing live confocal imaging. Results: Comparison of ten samples of donor platelets collected before apheresis and platelets collected on days 5 and 7 of storage showed an increase in the percentage of Rhod-2positive platelets from 3.6 to 47 and finally to 71%. Mitochondrial potential was demonstrated in 95.4% of donor platelets and in 92.5% of platelets stored for 7 days. Conclusion: Such fast and accurate visualization of known key parameters of platelet function could be of relevance for studies addressing the quality of platelets after storage and additional manipulation, such as pathogen inactivation, as well as for the analysis of inherited platelet function disorders. / Hintergrund: Die Vitalitätsbestimmung von Blutplättchen ist sowohl für die Analyse angeborener Plättchendefekte als auch für die Qualitätsbestimmung von Plättchenkonzentraten von zentraler Bedeutung. Methoden: In der vorliegenden Arbeit stellen wir eine Methode vor, die mittels einer Kombination von Vitalfarbstoffen und konfokaler «Real time»-Mikroskopie neue Einblicke in die Vitalitätsbestimmung lebender Plättchen ermöglicht. Mittels der Zugabe von FITC-gekoppeltem Weizenkeimlektin (WGA), Tetramethylrhodamin-Methylesterperchlorat (TMRM) und Acetoxymethylester (Rhod-2) wurde bei lebenden Blutplättchen deren Morphologie, mitochondriale Aktivität und Veränderungen im Calcium-Haushalt im Rahmen der Lagerung analysiert. Für die Mikroskopie wurde ein Nipkow-System gewählt, das eine konfokale Mikroskopie lebender Zellen ermöglicht. Ergebnisse: Der Vergleich von 10 humanen Blutplättchenproben zu Beginn bzw. nach 5 und 7 Tagen Lagerung zeigte einen Anstieg der Rhod-2-positiven Plättchen von 3,6 über 47 auf 71%. Die Anzahl der Blutplättchen mit TMRM-positiven Mitochondrien hingegen lag vor der Lagerung bei 95,4% und nach den 7 Tagen Lagerung bei 92,5%. Schlussfolgerung: Die hier vorgestellte Methodik der Bildgebung zur Bestimmung vitaler Parameter von Blutplättchen eignet sich als ergänzende Analysemodalität für eine bessere Bestimmung der Blutplättchenqualität. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Plants of the genus Bergenia are part of remedies used in Ayurveda medicine. They also play an important part in traditional healing practice in China, India, Mongolia and Russia. Theoretical part of this thesis sums the newest findings and research results concerning three Bergenia species: Bergenia ciliata (Haw.) Sternb., Bergenia crassifolia (L.) Fritsch a Bergenia ornata Stein. The thesis mainly focuses on their current and potential use in medicine and pharmacy. Bergenia extract is traditionally used for dissolving kidney stones, treating respiratory tract illnesses and to stop bleeding. The most important active substances of these plants, their characteristics and main effects are also noted. Bergenia is an important source of arbutin and bergenin. Bergenin has antitussive, antiflogistic and gastroprotective effects. Arbutin is used to treat urinary tract diseases and in cosmetology to lighten the skin. The experimental part of this thesis includes methods of preparation of permanent microscope slides from leaves of chosen Bergenia species. Photographs have been taken from both permanent and native slides. Anatomy of the leaf and leaf epidermis is described including stomatal index. Presence of calcium oxalate crystals in form of druses is also documented. Basic anatomical features were...

This thesis deals with the topic of 3D image processing for digital holographic microscopy - numerical refocusing. This method allows to perform mathematically accurate defocus correction on image of a sample captured away from the sample plane and it was applicable only for images that were made made using coherent illumination source. It has been generalized to a form in which it is also applicable to devices that use incoherent (non-monochromatic or extended) illumination sources. Another presented achievement concerns hologram processing. The advanced hologram processing method enables obtaining more data mainly concerning precision of quantities from one hologram — normally, one would have to capture multiple holograms to get those. Both methods have been verified experimentally.

Despite the capabilities of molecular-biological methods in deciphering the interplay of different biological molecules and molecular complexes, the understanding of respective functions in living cells requires application of in situ methods. Obviously, these methods should provide maximal resolution and the best possible preservation of the biological object in a native state, as well as correct statistical evaluation of the spatial characteristics of detected molecular players. Transmission electron microscopy provides the highest possible resolution for analysis of biological samples. The simultaneous detection of biological molecules by means of indirect immunolabeling provides valuable information about their localization in cellular compartments and their possible interactions in macromolecular complexes. To analyze this, we have developed a complex stereological method for statistical evaluation of immunogold clustering and colocalization patterns of antigens on ultrathin sections, including a user-friendly interface. Functional microarchitecture of DNA replication and transcription sites has been successfully characterized using the developed stereological tools. Our data demonstrate that DNA replication is compartmentalized within cell nuclei at the level of DNA foci and support the view...

Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind. / Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einsatz der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) für die Beurteilung von humanen Osteoblasten auf experimentellen Implantatoberflächen zu prüfen. Die acht Probekörper besaßen anodische Konversionsoberflächen, die aus den Elektrolyten Zirkoniumsulfat, Phosphorsäure und Kaliumfluorid sowie deren Kombinationen hergestellt waren. Als Positivstandard dienten TICER® und Cercon®, als Negativstandard commercial pure Titan (CPT/Reintitan). Diese Probekörper wurden in Chamber Slides mit einer humanen Osteoblastenkultur inkubiert. Am 3., 5., 7. und 10. Versuchstag erfolgte die immunhistochemische Darstellung von Bone-Sialoprotein (BSP). Anschließend wurden im LSM fluoreszenzmikroskopisch 3D-Bildstapel aufgenommen und mit dem 2D-mikroskopischen Verfahren verglichen. Es zeigte sich, dass das Bone-Sialoprotein einen Hinweis auf aktive Osteoblasten darstellt. Die BSP-exprimierenden Strukturen, die sich zu Volumina zusammenfügen, variieren an den verschiedenen Versuchstagen und bei den unterschiedlichen Oberflächenstrukturen. Eine deutlich erhöhte BSP-Expressionsrate wurde bei den elektrolytisch beschichteten Probekörpern aus Zirkoniumsulfat, Kaliumfluorid und Phosphorsäure erfasst. Ein eindeutiger Unterschied zwischen der 2D-Mikroskopie und der LSM ergab sich jedoch nicht. Die LSM erlaubt aber zusätzlich Aussagen über absorbierte Proteine an den Probekörperoberflächen durch eine um 90°-gedrehte Projektion der 3D-Bildstapel.

Diese Arbeit beschreibt die Untersuchung der Diffusion in dünnen Flüssigkeitsfilmen auf festen Oberflächen mit Methoden der Einzelmoleküldetektion. Anhand von Computersimulationen wird die Spotgrößenanalyse als neue Methode zur Analyse von Diffusionsprozessen vorgestellt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Diffusion von Farbstoffen in ultradünnen Flüssigkeitsfilmen stark verlangsamt ist. In einem ca. 3 nm dicken Film aus Tetrakis(2-ethyl-hexoxy)-silan werden Diffusionsprozesse beobachtet, die durch Sprünge zwischen Bereichen mit diskreten Werten der Diffusionskonstante gekennzeichnet sind. Die Existenz diskreter Werte der Diffusionskonstante kann durch die Ausbildung von Flüssigkeitsschichten molekularer Dicke (Liquid Layering) erklärt werden. Die Spotgrößenanalyse erweist sich als unabhängige Methode zur Bestimmung der Diffusionskonstante diffundierender Moleküle. Gegenüber der etablierten Bestimmung der Diffusionskonstante aus Trajektorien diffundierender Moleküle durch Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung bietet die Spotgrößenanalyse eine höhere statistische Genauigkeit und die Möglichkeit, Änderungen der Diffusionskonstante instantan zu detektieren.

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This thesis presents the recent progress of diffusion measurements in nanoporous host systems by micro-imaging. Interference microscopy is applied as a powerful tool to record transient, intracrystalline concentration profiles of different sorbate species in the porous framework of two different zeolites, viz. ZSM-5 (MFI) and ZSM-58 (DDR). These profiles, yielding high temporal and spatial resolutions of about 10 s and 0.45 μm, follow the change of the refractive index of the host-guest system during uptake and release of certain guest molecules. With the thus accessible changes of concentration and particle fluxes, mass transport parameters, such as intracrystalline diffusivity and surface permeability, can be obtained by the use of the very fundamental equations on diffusion. Additionally, in two examples of never before performed types of experiments, further insights into challenging fields of host-guest interactions are provided: The well known phase transition in MFI type zeolites covering high benzene loadings is investigated in a single crystal study, allowing to follow the change of the sorbate phase in great detail. Furthermore, in DDR zeolites, a new way of data analysis facilitates to study the uptake and release of binary mixtures. Here, from the two-dimension profiles obtained by interference microscopy, the local concentrations of the sorbate species could be retrieved by using the so-called ideal adsorbed solution theory.