Le nombre de thérapies cellulaires à l'étude va grandissant. Parmi ces thérapies, on retrouve la thérapie cellulaire de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cette dernière vise l'amélioration des conditions de vie des enfants atteints par cette maladie génétique rare. En effet, on dénombre 1 garçon sur 3500 touché par cette maladie. Il s'agit d'une maladie génétique irréversible affectant le gène de la dystrophine, qui occasionne une dégradation prématurée des fibres musculaires. Les patients touchés se retrouvent rapidement immobilisés, ce qui amène une mort lente, généralement causée par une insuffisance pulmonaire ou cardiaque, entre l'âge de 20 à 30 ans. Cette thérapie consiste à prélever des cellules du patient qui seront mises en culture, corrigées génétiquement, pour alors être greffées vers les muscles ciblés. Pour contribuer à la sécurité de cette thérapie, un milieu de culture cellulaire non supplémenté par du sérum sanguin (serum-free medium, SFM) a été développé par Victor Parent, étudiant au doctorat sous la supervision d'Alain Garnier. Ce milieu permet de remplacer le milieu conventionnel utilisé pour multiplier ces cellules (serum containing media, SCM) contenant du sérum fœtal bovin (fetal bovine serum, FBS). Le FBS est efficace en culture cellulaire, cependant il augmente les risques de contamination chimique et biologique. Il fait en sorte que la composition du milieu de culture est variable d'un lot à l'autre de FBS, ce qui augmente la variabilité du procédé de croissance cellulaire et son coût dispendieux n'est pas à l'abri des fluctuations du marché. Ces fortes contraintes motivent le développement de milieux définis sans sérum. Le SFM a été développé en testant plus de 6 milieux de base et plus de 60 ingrédients divers. Cependant les cellules cultivées dans ce milieu ne présentent pas la même morphologie que celles cultivées en présence de FBS. Aussi, en fin de culture en SFM, les cellules peuvent présenter un début de différentiation en myotubes. Cette différentiation est non désirable lors de la culture de cellules précurseurs des muscles (myoblastes). De plus, le coût de l'ensemble des ingrédients du SFM représente 1600 $/L, soit 5 fois celui du milieu standard (SCM). Afin de résoudre ces problèmes et réduire le coût de ce milieu, une étude a été lancée pour optimiser le SFM. Pour ce faire, un algorithme d'analyse d'image a été utilisé afin d'évaluer objectivement, simplement et en direct, la morphologie cellulaire. Cette méthode est non destructive et a la capacité d'analyser automatiquement cette morphologie en étant combinée à un microscope automatisé dans un environnement contrôlé. Combiné à l'utilisation de plans statistiques d'expérience, ces moyens permettent d'obtenir les informations nécessaires en utilisant un minimum d'échantillons, d'efforts et de coûts. Afin de répondre aux objectifs de ce projet, quatre groupes de plans d'expérience ont été effectués sur les ingrédients existants du SFM. Les résultats de ces essais ont permis d'exclure quatre des huit ingrédients les plus coûteux du SFM, ce qui représente une diminution totale de son coût de 59%, aboutissant à l'identification d'un milieu optimal (MSFM). De plus, la morphologie et le temps doublement des cellules dans le MSFM est similaire au SCM et ne présente aucune formation de myotubes. Un essai de greffe de cellules cultivées avec ce milieu démontre que la greffe de cellules cultivées dans le MSFM est 20% plus efficace in vivo par rapport aux milieux standards (SFM et SCM). Face à deux compétiteurs de ce milieu, le MSFM se situe parmi les moins chers du marché (2 fois plus élevé que le SCM) et il est 81% plus performant que son plus proche concurrent. En conclusion, cette recherche a permis d'optimiser un milieu de culture cellulaire sans sérum. Cette optimisation rend ce milieu, le MSFM, le plus performant et le moins cher actuellement disponible. Il va donc ainsi pouvoir s'intégrer dans tous travaux de recherche menés sur les myoblastes humains ainsi que lors du développement de thérapies cellulaires de la dystrophie musculaire de Duchenne et finalement de l'application de ces thérapies.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant un garçon sur 3500. Elle entraîne une dégénération progressive et irréversible des muscles. Actuellement, la maladie est incurable et aucune thérapie ne permet de traiter les patients de façon efficace et sécuritaire. La thérapie cellulaire, qui consiste à injecter des cellules musculaires humaines saines, les myoblastes, dans les muscles des personnes atteintes de la DMD, a déjà donné des résultats cliniques prometteurs. Par contre, quelques problèmes entravent le développement de cette thérapie. Entre autre, le milieu de culture utilisé pour l’expansion des myoblastes contient du sérum fœtal bovin (FBS). Le FBS est un produit animal non défini pouvant être contaminé par des bactéries, des virus ou des prions. Les risques possibles pour la santé des patients peuvent entraver l'acceptation de la thérapie. Il est donc préférable de remplacer le FBS par un mélange d'additifs définis, notamment par des cytokines. De plus, les procédés de production actuels sont inadéquats pour répondre à la demande en cellules musculaires. Ce projet vise à élaborer un milieu de culture sans sérum pour la prolifération in vitro des cellules musculaires et à développer un procédé de production à grande échelle de ces cellules. Pour développer un milieu sans sérum, une méthode en boucle a été utilisée. Celle-ci se divise en 3 étapes : a) monter une banque de facteurs potentiels en identifiant les récepteurs cellulaires par RT-PCR et par un criblage de la littérature, b) tester ces facteurs en culture en utilisant, entre autre, une planification statistique des expériences (DOE) permettant de vérifier les effets individuels et synergiques de ces additifs et c) ajouter les additifs générant une réponse bénéfique au milieu de culture. Cette boucle a été itérée jusqu'à ce que le nombre de facteurs testés soit suffisant pour que la réponse cellulaire avec le nouveau milieu soit comparable au milieu avec FBS. Pour atteindre l'objectif de mise à l’échelle, le projet s’est limité à la sélection de microporteurs permettant une adhésion efficace des myoblastes. Suite à l'essai par DOE de 9 milieux de base et de 72 additifs, un milieu sans sérum, le LOBSFM, a été développé. Il s'agit, à notre connaissance, du seul milieu de culture sans sérum existant qui est aussi efficace que le milieu traditionnel pour la prolifération des myoblastes. Un brevet a été déposé pour protéger ce milieu. Il permet la prolifération spécifique des myoblastes (~80% myoblastes dans la culture, vérifié par marquage immunocytochimique) aussi efficacement que le milieu standard contenant 15% de FBS, durant au moins 60 jours de culture. De plus, les myoblastes cultivés dans le LOBSFM conservent leur capacité de fusionner et ainsi former des fibres musculaires. Pour ce qui est du procédé de culture, les microporteurs poreux Cytoline2™ ont permis d'obtenir une concentration cellulaire finale de 1,5E6 cell/mL, comparable à la culture en flacon statique. Les pores protègent les myoblastes contre les contraintes hydrodynamiques et permettent une récupération simple des cellules. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a genetic disease affecting one boy out of 3500. It leads to progressive and irreversible muscle degeneration. Currently, there is no cure for this disease and no therapy allows an efficient and safe treatment. Cell therapy consists in injecting healthy human muscle cells, myoblasts, into the muscles of DMD patients. Promising results have been obtained in clinical trials using this approach. However, some problems need to be overcome. Particularly, the original culture medium used to expand myoblasts contains Foetal Bovine Serum (FBS). FBS is an undefined product derived from animal, which can be contaminated with bacteria, viruses or prions. The possibility of harmful consequences for the patients hampers the acceptability of the therapy, so FBS must be replaced by a mixture of defined factors such as specific recombinant cytokines. Moreover, the production processes are currently inappropriate to meet the demand for muscle cells. Therefore, this project aims to develop a serum-free medium for the in vitro proliferation of muscle cells and a large-scale process for the production of those cells. A multi-step method was used to develop the serum-free medium. It is divided into three main steps: a) to build a panel of potential factors from a screen of the literature followed by the detection of more than 100 receptors and autocrine factors using RT-PCR, b) to test those factors in culture using statistical design of experiment (DOE) allowing to verify individual and synergistic effects and c) to add the factors that generate beneficial response to the culture medium. Those steps are followed until a cellular response comparable to the culture in standard medium is obtained. To achieve the scale-up objective, the project was limited to the selection of microcarriers that allowed the proper adhesion of myoblasts. The potential factors identified in the first stage, together with additional ones taken from the literature, formed a panel of 9 basal culture media and 72 additives that have been tested by means of DOE. At the end of this process, a serum-free medium, LOBSFM, was developed. To our best knowledge, it is the only existing efficient serum-free medium for myoblast proliferation and a patent has been obtained to protect its use. It allows a specific expansion of myoblasts (~80% myoblasts, verified by immunostaining) comparable to a standard medium containing 15% FBS over a 60-day culture period. Moreover, myoblasts kept their ability to form muscle fibers. Porous microcarriers Cytoline2 allowed a final cell concentration of 1.5E6 cells/mL, comparable to cell expansion in static culture plate. The pores protected the cells against mechanical stresses while the cell recovery remained easy.

Le sérum ajouté aux milieux de culture est connu pour être une substance difficile à contrôler en raison de la présence de facteurs variables. Le but de cette étude était de faire varier les conditions de culture en retirant le sérum lors de la montée à l'interface air-liquide et de poursuivre les observations sur la qualité des substituts cutanés sains et psoriasiques produits par la méthode d'auto-assemblage. Les résultats histologique, macroscopique et immunohistochimique des substituts sains cultivés avec ou sans sérum ne montrent aucune différence significative. Les analyses infrarouges effectuées sur ces derniers permettent d'observer que ceux cultivés en absence de sérum possèdent une meilleure organisation lipidique au niveau de la couche cornée. Par contre, l'absorption percutanée démontre des différences au regard des propriétés physico-chimiques des molécules étudiées. De plus, les substituts conçus à partir de cellules psoriasiques affichent des résultats différents lorsque le sérum est retiré. Il semble que l'apport du sérum soit davantage important lors de l'utilisation de cellules pathologiques.

La thérapie cellulaire est une méthode d’avenir innovante, actuellement utilisée dans le traitement de pathologies multiples (auto-immunitaire, cancéreuses, pathologies inflammatoires, allogreffes…) et la régénération des pertes de substance tissulaire. Les cellules souches mésenchymateuses, par la variabilité de leurs origines, présentent des propriétés très intéressantes à la thérapie, notamment un potentiel de différenciation en lignées multiples, et des propriétés d’immunomodulation importantes. Mon projet s’intéresse à l’utilisation de cellules souches orales récemment isolées de la gencive par notre équipe : cellules souches gingivales (GSC), et présentant un avantage fonctionnel par rapport aux sources cellulaires traditionnelles d’origine mésodermique (moelle osseuse) ou orales (pulpe dentaire, follicule dentaire, ligament parodontal, glandes salivaires…). Les défauts osseux des mâchoires, de par leur multitude d’étiologies (traumatismes, dysmorphoses, cancer, ...) et le handicap généré, représentent une cible thérapeutique privilégiée. Les GSCs ont la même origine embryologique neurectodermique que les os maxillaires et par là-même un phénotype proche, exploré dans notre équipe. Cette source gingivale de prélèvement non traumatique est une alternative aux techniques chirurgicales actuelles mutilantes pour le site donneur. Notre objectif est double : Etablir un protocole préclinique de culture des GSC en ostéoblastes, pour être compatibles avec la thérapie humaine afin d’obtenir une régénération osseuse optimale. Les capacités immunomodulatrices des GSCs sont par là-même étudiées dans ces nouvelles conditions, dans le but de maitriser la réaction inflammatoire et préserver la greffe osseuse, grâce à la plateforme exceptionnelle mise à notre disposition par l’établissement français du sang, et une équipe très spécialisée dans l’étude des mécanismes de régulation immunitaires. Nos résultats permettront non seulement une régénération osseuse transposable chez l’homme, mais également d’utiliser ces cellules pour le traitement d’autres pathologies (cancéreuses, auto-immunitaires…) en utilisant leur capacité immunomodulatrice. / Cell therapy is an innovative method of the future, currently used in the treatment of multiple diseases (autoimmune, cancer, inflammatory pathologies, allografts ...) and the regeneration of tissue loss. Mesenchymal stem cells (MSC), regardless their origins, exhibit very interesting properties for therapy, including a potential for multi-line differentiation, and important immunomodulation properties. My project focuses on the use of oral stem cells recently isolated from the gingiva by our team (GSC), and having a functional advantage over traditional mesodermal (bone marrow) cellular sources. The bone defects of the jaws, due to their multitude of etiologies (trauma, dysmorphoses, cancer...) and the generated handicap, represent a preferred therapeutic target. GSCs have the same neurectodermal embryological origin as the maxillary bones and thus a similar phenotype, explored in our team. This gingival source of non-traumatic removal is an alternative to current mutilating surgical techniques for the donor site. Our goal is twofold: To establish a preclinical GSC culture protocol in osteoblasts, to be compatible with human therapy, in order to achieve optimal bone regeneration. The immunomodulatory capacities of the GSCs are themselves studied under these new conditions, with the aim of controlling the inflammatory reaction and preserving the bone graft, thanks to the exceptional platform made available to us by the French blood establishment, and A highly specialized team in the study of immune regulation mechanisms. Our results will not only allow transposable bone regeneration in humans but also use these cells for the treatment of other pathologies (cancerous, autoimmune ...) using their immunomodulatory capacity.