La translation vers la clinique de nouveaux médicaments anti-cancéreux peut échouer à différentes étapes, notamment lors du passage des modèles animaux à l'humain. Pour améliorer la prédictibilité des tests précliniques, de nouveaux modèles in vitro humains recréant le microenvironnement tumoral sont nécessaires. Dans le cadre du mélanome cutané, les vaisseaux sanguins et lymphatiques dermiques sont des composantes essentielles à la progression tumorale, tout comme les cellules immunitaires. Nous avons émis l'hypothèse qu'il est possible de microvasculariser des substituts cutanés avec des capillaires sanguins et lymphatiques, puis d'appliquer ce contexte tissulaire à la modélisation du mélanome. Notre modèle, basé sur la méthode d'auto-assemblage, est constitué, dans un premier temps, de fibroblastes, de cellules endothéliales microvasculaires humaines et de kératinocytes. Deux types de réseaux ont été observés dans les substituts cutanés en coupe et sur tissu entier. Ils présentent des morphologies distinctes et sont caractérisés par des marquages CD31 (pan-endothéliale) et podoplanine (spécifique aux cellules lymphatiques). La capacité des cellules endothéliales à former des réseaux en fonction de leur origine, cellules de nouveau-né ou d'adulte, a été évaluée. Il a également été confirmé que la présence d'un épiderme formé de kératinocytes influe sur la formation des réseaux de capillaires sanguins et lymphatiques. Les peaux doublement microvascularisées ont permis l'étude du mélanome dans un microenvironnement humain in vitro. Ce modèle a été formé en ajoutant des sphéroïdes de mélanome aux substituts cutanés (6 lignées). Une fois incorporées dans le microenvironnement cutané, les tumeurs répondent à un traitement chronique (12 jours) au vemurafenib de façon dose-dépendante (diminution de la prolifération des cellules de mélanome et augmentation significative de l'apoptose). Par la suite, des cellules immunitaires humaines primaires (dérivées du sang périphérique) ont été incorporées dans la tumeur ainsi que dans le tissu environnant, résultant notamment en la présence de monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), lymphocytes CD8+ et cellules HLA-DR+. Ces tissus avec ou sans cellules immunitaires ont été stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS), menant à une modification de la proportion des sous-populations immunes présentes dans le modèle. Ce modèle humain répondant à des thérapies anti-cancéreuses et pouvant contenir une composante immunitaire est un outil prometteur pour l'étude du mélanome ainsi que pour l'évaluation de futures molécules en oncologie, incluant des immunothérapies. / Clinical translation of new oncology compounds can fail at different stages, including the translation from animal to human studies. To improve the predictability of preclinical testing, new in vitro human models mimicking the tumor microenvironment are needed. In skin melanoma, blood and lymphatic capillaries are key features of tumor progression, as well as immune cells. We hypothesize that it is possible to microvascularize skin substitutes with both blood and lymphatic capillaries in order to use these tissues to model and study melanoma in vitro. Our self-assembled model was produced using primary human fibroblasts, microvascular endothelial cells and keratinocytes. Two subtypes of capillary networks were present in the reconstructed skin as observed after labeling on cryosections and whole mount samples. Their morphology differs, and they were characterized by immunostaining against CD31 (pan-endothelial) and podoplanin (lymphatic endothelial cells). The ability of endothelial cells from newborn or adult to form networks was assessed. It was also confirmed that the keratinocytes can affect the capillary networks, formed by blood and lymphatic endothelial cells. The microvascularized reconstructed skin allowed to study melanoma in a human microenvironment in vitro. The melanoma model was produced by adding melanoma spheroids to the skin substitutes (with 6 melanoma cell lines). After tumor incorporation in the 3D model, it was treated chronically (12 days) with vemurafenib and displayed a dose-dependent response (significant decrease of proliferation and increase of apoptosis). The last step was to incorporate human primary blood-derived immune cells in the tumor and in the surrounding skin, leading to the presence for example monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), CD8+ lymphocytes and HLA-DR+ cells. The different tissues were stimulated with LPS, leading to a modification of immune cell subpopulations in the model (with 4 different donors and 2 melanoma cell lines). This human melanoma model which responds to a known therapy and can include an immune component is a promising tool to study melanoma and to test new therapeutic compounds, including immunotherapies.

Les cellules endothéliales cornéennes constituent un tissu à la fois extrêmement particulier et d'une importance singulière. En effet, celui-ci est pourvu d'une capacité régénératrice pratiquement nulle, mais son intégrité est essentielle à la transparence cornéenne et donc à la vision. Par contre, l'endothélium cornéen fait défaut dans diverses pathologies telles que la dystrophie de Fuch et la kératopathie bulleuse du pseudophaque. La méthode traditionnelle pour le remplacement d'un endothélium cornéen pathologique est la greffe de cornée pleine épaisseur. Par contre, la greffe lamellaire postérieure est une alternative chirurgicale en plein essor, très intéressante, puisqu'elle permet de remplacer seulement la portion malade de la cornée. Cette technique chirurgicale a ouvert la porte à une nouvelle possibilité au niveau du génie tissulaire. En effet, il est maintenant envisageable de greffer un endothélium produit en laboratoire. Un défi supplémentaire, que s'est imposé notre équipe, est de reconstruire non seulement un endothélium complet, mais d'en reconstruire un qui serait également autologue, l'immunogénicité jouant un rôle non négligeable lors d'échec de greffes. Mon rôle dans ce projet était donc d'évaluer la faisabilité de reconstruire par génie tissulaire un endothélium cornéen autologue pour notre modèle animal, et ce, à des fins de greffes. D'abord en optimisant les conditions de culture afin de permettre la croissance des cellules endothéliales cornéennes animales. Puis en reconstruisant in vitro un endothélium à partir d'une biopsie cornéenne de taille minimale. Un endothélium sain similaire au tissu natif a ainsi été reconstruit.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2003-2004 / Une déficience en cellules souches épithéliales mène à une conjonctivalisation progressive de la cornée se traduisant par une perte de vision. Nous nous sommes attardés à l'étude de la régénération de l'épithélium cornéen initiée par une greffe de cellules épithéliales de cornée de lapin (CECL) cultivées sur un gel de fibrine. À confluence des cellules, le gel est greffé de façon autologue sur une cornée de lapin déficiente en cellules souches et la guérison est observée par rapport à un contrôle non greffé. À différents temps, les cornées sont prélevées et utilisées pour une analyse histologique ou par immunomarquage. Nos résultats démontrent qu'en seulement deux semaines, nous pouvons préparer un greffon d'épithélium cornéen autologue qui est sans risque de rejet. Après un mois, les lapins ayant reçu une greffe montrent un phénotype cornéen normal comparé aux témoins non-greffés. Ces résultats indiquent que la greffe de CECL autologues permet d'aider à la guérison d'un déficit en cellules souches.

Contexte : En culture, les cellules endothéliales cornéennes humaines (CECH) adoptent fréquemment une morphologie fibroblastique [transition endothélio-mésenchymateuse (TEM)], les rendant inutilisables en génie tissulaire en raison de l’incapacité fonctionnelle associée. Objectifs : En accord avec les précédents travaux provenant de notre laboratoire et la littérature scientifique, nous avons séparément étudié les effets de la culture sous pression hydrostatique physiologique (18 mmHg) et de l’antagonisme de la TEM sur la fonctionnalité des CECH. Méthodes : D’une part, l’ensemencement des CECH sur stromas décellularisés et la culture en chambre antérieure artificielle ont permis de soumettre les CECH à une pression hydrostatique. D’autre part, les agents présumés antagonistes de la TEM suivants ont été étudiés : le SB431542, la dexaméthasone et BMP-7. Résultats : La pression hydrostatique physiologique et l’antagonisme de la TEM par le SB431542 et la dexaméthasone sont des moyens efficaces pour maintenir et améliorer la fonctionnalité des CECH in vitro. / Background: Cultured human corneal endothelial cells (HCEC) often adopt a fibroblastic-like morphology [endothelial-mesenchymal transition (EMT)], making them unusable in tissue engineering due to the associated loss of function. Purpose: In agreement with previous work from our laboratory and scientific literature, we separately investigated the effects of culture under physiological hydrostatic pressure (18 mmHg) and the antagonism of EMT on HCEC functionality. Methods: First, seeding HCEC on decellularized corneal stromas and culture in an artificial anterior chamber allowed to submit HCEC to hydrostatic pressure. Second, the following putative EMT antagonists agents were studied: SB431542, dexamethasone and BMP-7. Results: Physiological hydrostatic pressure and EMT antagonism by SB431542 and dexamethasone are effective ways to maintain and improve HCEC functionality in vitro.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique caractérisée par l'absence de dystrophine dans les muscles des patients. Un des traitements envisageables est la greffe de myoblastes dans les muscles dystrophiques afin de permettre l'expression de dystrophine. Les cellules souches embryonnaires, qui ont la capacité de se différencier en tous les types de cellules, pourraient servir de source illimitée de cellules pour traiter les patients. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent premièrement qu'il est possible d'obtenir une population de myoblastes dérivées de cellules souches embryonnaires murines. Il est aussi démontré qu'un traitement à l'azacytidine augmente le pourcentage de cellules souches embryonnaires différenciées en cellules myogéniques. De plus, ces cellules différenciées permettent de régénérer la dystrophine lorsque greffées à des souris dystrophiques. Des essais de purification de ces cellules myogéniques ont été tentés et sont toujours en cours d'étude. Une bonne purification des cellules différenciées permettrait en effet d'éviter les risques de formation de tumeurs lors de la greffe des cellules. Les expériences de différenciation, lorsque mises au point, pourraient être appliquées à des cellules souches embryonnaires humaines afin de traiter des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne.

Au LOEX, un modèle de folliculogénèse a été caractérisé. Ce modèle consiste à incorporer des follicules pileux immatures de souris dans les peaux reconstruites par génie tissulaire. À l'aide des peaux reconstruites, nous avons comparé l'influence des cellules dermiques sur la différenciation des cellules souches des follicules pileux. La maturation in vitro des follicules pileux immatures sur les fibroblastes murins et humains a mené à l'apparition d'inclusions intradermiques. Cependant, les études de caractérisation ont révélé la présence de marqueurs de différenciation épidermique dans les kystes dérivants des follicules pileux immatures cultivés sur fibroblastes humains, contrairement à ceux cultivés sur fibroblastes murins. Ces derniers ont plutôt des caractéristiques histologiques qui ressemblent davantage aux cellules retrouvées au niveau de la gaine folliculaire externe du follicule pileux. Un dérèglement de la voie de signalisation Wnt pourrait expliquer ces phénomènes, puisque la p-caténine et le facteur Lef-l ne sont pas activés dans ces peaux reconstruites.

L'objectif du présent projet était d'optimiser le modèle de peau reconstruite par génie tissulaire déjà mis au point par notre équipe afin qu'il stimule le processus de régénération nerveuse après greffe pour améliorer la récupération tactile des grands brûlés. Nous avons utilisé des follicules pileux murins et des neurones sensoriels extraits des ganglions de la racine dorsale de f?tus de souris et avons posé comme hypothèse que les poils avaient une influence positive sur la migration axonale. Une élongation vigoureuse des neurites a été détectée à l'intérieur du derme reconstruit. En présence de cellules épithéliales, il y a eu une migration préférentielle des axones vers les follicules pileux immatures implantés dans le modèle, migration qui a été suivie d'une association étroite des axones et des follicules pileux. Nous avons donc développé avec succès un modèle nous permettant d'étudier les effets de l'épiderme et des follicules pileux sur la croissance des nerfs.

Ce travail visait à exploiter le potentiel des protéines de soya afin de concevoir et de développer des biomatériaux sous forme de biofilms aux propriétés physico-chimiques, et surtout biologiques, contrôlées. Pour ce faire, des films à base d'isolats de protéines de soya (IPS) ont été préparés à l'aide de plastifiant, le glycérol, et de différentes concentrations d'agent de réticulation, le formaldéhyde, afin d'obtenir un biomatériau favorable pour la culture de cellules cutanées (fibroblastes et kératinocytes) humaines. La toxicité des films a été testée en évaluant l'adhésion, la croissance, la prolifération et la formation d'une structure cutanée bien organisée. La biocompatibilité et l'immunogénicité des biofilms ont été étudiées grâce aux analyses de cytokines produites par les fibroblastes et les kératinocytes. Les diverses observations microscopiques ont démontré l'innocuité de tous les biofilms vis-à-vis des kératinocytes qui ont adhères. Ces biofilms n'ont aucun effet nocif sur la viabilité cellulaire. Il est intéressant de noter que ces cellules ont une prolifération croissante malgré l'augmentation de la concentration en réticulant. La prolifération des cellules cutanées est, cependant, réduite à fort pourcentage de formaldéhyde. En effet, celles-ci prolifèrent mieux sur les biofilms contenant 0 %, 1 % et 2 % de formaldéhyde comparativement à ceux contenant 3 % d'agent de réticulation. En conclusion, les biofilms à base de protéines de soya offrent un environnement favorable à l'adhésion et la croissance des kératinocytes. Les biofilms ayant le meilleur potentiel sont ceux contenant une concentration de 1 % de formaldéhyde.

Les lipides de la couche cornée, la partie externe de la peau, sont connus pour jouer un rôle très important au niveau de la perméabilité de celle-ci. Une modification des propriétés de perméabilité est observée lors de certaines maladies cutanées, dont le psoriasis. La première partie du projet consistait à la caractérisation physicochimique de substituts sains et psoriasiques produits par la méthode d'auto-assemblage. Nos résultats ont permis de montrer que les substituts psoriasiques lésionnels présentent une couche cornée plus désorganisée que les contrôles. Nous avons également posé l'hypothèse que les propriétés de la peau non-lésionnelle des patients pourraient varier selon la gravité de la pathologie. De plus, des systèmes lipidiques modèles de la couche cornée ont été étudiés pour tenter d'établir le mécanisme d'action de l'acide oléique qui facilite la pénétration de molécules à travers la peau. Nos résultats démontrent une déstabilisation des membranes par l'acide oléique.

La thérapie cellulaire est une méthode d’avenir innovante, actuellement utilisée dans le traitement de pathologies multiples (auto-immunitaire, cancéreuses, pathologies inflammatoires, allogreffes…) et la régénération des pertes de substance tissulaire. Les cellules souches mésenchymateuses, par la variabilité de leurs origines, présentent des propriétés très intéressantes à la thérapie, notamment un potentiel de différenciation en lignées multiples, et des propriétés d’immunomodulation importantes. Mon projet s’intéresse à l’utilisation de cellules souches orales récemment isolées de la gencive par notre équipe : cellules souches gingivales (GSC), et présentant un avantage fonctionnel par rapport aux sources cellulaires traditionnelles d’origine mésodermique (moelle osseuse) ou orales (pulpe dentaire, follicule dentaire, ligament parodontal, glandes salivaires…). Les défauts osseux des mâchoires, de par leur multitude d’étiologies (traumatismes, dysmorphoses, cancer, ...) et le handicap généré, représentent une cible thérapeutique privilégiée. Les GSCs ont la même origine embryologique neurectodermique que les os maxillaires et par là-même un phénotype proche, exploré dans notre équipe. Cette source gingivale de prélèvement non traumatique est une alternative aux techniques chirurgicales actuelles mutilantes pour le site donneur. Notre objectif est double : Etablir un protocole préclinique de culture des GSC en ostéoblastes, pour être compatibles avec la thérapie humaine afin d’obtenir une régénération osseuse optimale. Les capacités immunomodulatrices des GSCs sont par là-même étudiées dans ces nouvelles conditions, dans le but de maitriser la réaction inflammatoire et préserver la greffe osseuse, grâce à la plateforme exceptionnelle mise à notre disposition par l’établissement français du sang, et une équipe très spécialisée dans l’étude des mécanismes de régulation immunitaires. Nos résultats permettront non seulement une régénération osseuse transposable chez l’homme, mais également d’utiliser ces cellules pour le traitement d’autres pathologies (cancéreuses, auto-immunitaires…) en utilisant leur capacité immunomodulatrice. / Cell therapy is an innovative method of the future, currently used in the treatment of multiple diseases (autoimmune, cancer, inflammatory pathologies, allografts ...) and the regeneration of tissue loss. Mesenchymal stem cells (MSC), regardless their origins, exhibit very interesting properties for therapy, including a potential for multi-line differentiation, and important immunomodulation properties. My project focuses on the use of oral stem cells recently isolated from the gingiva by our team (GSC), and having a functional advantage over traditional mesodermal (bone marrow) cellular sources. The bone defects of the jaws, due to their multitude of etiologies (trauma, dysmorphoses, cancer...) and the generated handicap, represent a preferred therapeutic target. GSCs have the same neurectodermal embryological origin as the maxillary bones and thus a similar phenotype, explored in our team. This gingival source of non-traumatic removal is an alternative to current mutilating surgical techniques for the donor site. Our goal is twofold: To establish a preclinical GSC culture protocol in osteoblasts, to be compatible with human therapy, in order to achieve optimal bone regeneration. The immunomodulatory capacities of the GSCs are themselves studied under these new conditions, with the aim of controlling the inflammatory reaction and preserving the bone graft, thanks to the exceptional platform made available to us by the French blood establishment, and A highly specialized team in the study of immune regulation mechanisms. Our results will not only allow transposable bone regeneration in humans but also use these cells for the treatment of other pathologies (cancerous, autoimmune ...) using their immunomodulatory capacity.