A circulação extracorpórea (CEC) substitui as funções do coração e pulmões durante o tempo principal da cirurgia cardíaca, permitindo que o cirurgião acesse o interior do órgão por longo período de tempo e assegurando a oxigenação dos tecidos e eliminação dos seus produtos finais. Entretanto, tal técnica não é utilizada rotineiramente em medicina veterinária devido aos elevados custos e também em decorrência das alterações deletérias que promove no organismo dos animais. Visando uma melhor compreensão das complicações decorrentes da CEC, possibilitando amenizá-las, aventou-se o estudo da conexina 43 (Cx43), proteína presente no miocárdio e responsável pela formação das junções intercelulares do tipo gap. O presente estudo avaliou cinco cães indenes, SRD, não submetidos à CEC, procedendo-se a colheita de amostras correspondentes à região do septo interventricular, átrios direito e esquerdo, ventrículos direito e esquerdo e posterior análise da Cx43 através da imunofluorescência, western blot e RT-PCR. Avaliou também cinco cães indenes, SRD, submetidos à toracotomia intercostal direita convencional e posterior instituição da CEC. Amostras de miocárdio foram colhidas em três distintos momentos, quais sejam: T0 (antes da CEC), T1 (após duas horas de CEC) e T2 (após uma hora de desmame da CEC), para verificar as possíveis alterações na (Cx43) decorrentes da CEC, pela técnica de imunofluorescência. Ao final do procedimento experimental, os animais foram sacrificados. Os resultados mostraram que nos animais indenes não operados, a Cx43 apresenta localização em todas as regiões estudadas, não apresentando diferença significativa com relação à expressão nas diferentes regiões. Porém, nos animais submetidos à CEC, a referida conexina apresentou-se diminuída. Por fim, concluímos que em cães a CEC por duas horas com uma hora de circulação espontânea é técnica exeqüível, porém determina sérias alterações clínicas e induz a processos patológicos. / Cardiopulmonary bypass (CPB) replaces the heart and lung function during the main period of cardiac surgery, and it allows the access of the surgeon inside the organ for a long time, ensuring tissue oxygenation and the elimination of end products. However, this procedure isn´t used as a routine in veterinary medicine because of the high costs, and besides it causes damage in the animal organism. In order to promote a better comprehension of the complications caused by CPB, and perhaps to assuage them, this work was designed to study the connexin 43 (Cx43), a protein present in myocardium which forms intercellular communications like gap junctions. To do so five health mongrel dogs not submitted to CPB were evaluated and tissue samples were taken from specific locals as ventricular septal, right and left atrium, right and left ventricle, to perform Cx43 analyses by immunofluorescence, western blot and RT-PCR. Were also studied others five health mongrel dogs submitted to a conventional right intercostal thoracotomy for CPB procedure. Samples of myocardium were taken in three different moments: T0 (before CPB), T1 (after two hours of CPB) and T2 (after one hour the end of CPB) to check possible alterations in Cx43 caused by CPB using immunofluorescence technique. The euthanasia of the animals was performed at the end of the experimental period. The results shown that in health animals not operated, the Cx43 is located in every studied local and there is no significant difference in the protein expression areas. Nevertheless, the CPB technique reduced the connexin expressions in the operated animals. Finally, we may conclude that the cardiopulmonary bypass for two hours and a spontaneous perfusion for one hour is a feasible procedure in dogs, but it determines serious clinical alterations and may induce pathophisyological process.

A circulação extracorpórea (CEC) substitui as funções do coração e pulmões durante o tempo principal da cirurgia cardíaca, permitindo que o cirurgião acesse o interior do órgão por longo período de tempo e assegurando a oxigenação dos tecidos e eliminação dos seus produtos finais. Entretanto, tal técnica não é utilizada rotineiramente em medicina veterinária devido aos elevados custos e também em decorrência das alterações deletérias que promove no organismo dos animais. Visando uma melhor compreensão das complicações decorrentes da CEC, possibilitando amenizá-las, aventou-se o estudo da conexina 43 (Cx43), proteína presente no miocárdio e responsável pela formação das junções intercelulares do tipo gap. O presente estudo avaliou cinco cães indenes, SRD, não submetidos à CEC, procedendo-se a colheita de amostras correspondentes à região do septo interventricular, átrios direito e esquerdo, ventrículos direito e esquerdo e posterior análise da Cx43 através da imunofluorescência, western blot e RT-PCR. Avaliou também cinco cães indenes, SRD, submetidos à toracotomia intercostal direita convencional e posterior instituição da CEC. Amostras de miocárdio foram colhidas em três distintos momentos, quais sejam: T0 (antes da CEC), T1 (após duas horas de CEC) e T2 (após uma hora de desmame da CEC), para verificar as possíveis alterações na (Cx43) decorrentes da CEC, pela técnica de imunofluorescência. Ao final do procedimento experimental, os animais foram sacrificados. Os resultados mostraram que nos animais indenes não operados, a Cx43 apresenta localização em todas as regiões estudadas, não apresentando diferença significativa com relação à expressão nas diferentes regiões. Porém, nos animais submetidos à CEC, a referida conexina apresentou-se diminuída. Por fim, concluímos que em cães a CEC por duas horas com uma hora de circulação espontânea é técnica exeqüível, porém determina sérias alterações clínicas e induz a processos patológicos. / Cardiopulmonary bypass (CPB) replaces the heart and lung function during the main period of cardiac surgery, and it allows the access of the surgeon inside the organ for a long time, ensuring tissue oxygenation and the elimination of end products. However, this procedure isn´t used as a routine in veterinary medicine because of the high costs, and besides it causes damage in the animal organism. In order to promote a better comprehension of the complications caused by CPB, and perhaps to assuage them, this work was designed to study the connexin 43 (Cx43), a protein present in myocardium which forms intercellular communications like gap junctions. To do so five health mongrel dogs not submitted to CPB were evaluated and tissue samples were taken from specific locals as ventricular septal, right and left atrium, right and left ventricle, to perform Cx43 analyses by immunofluorescence, western blot and RT-PCR. Were also studied others five health mongrel dogs submitted to a conventional right intercostal thoracotomy for CPB procedure. Samples of myocardium were taken in three different moments: T0 (before CPB), T1 (after two hours of CPB) and T2 (after one hour the end of CPB) to check possible alterations in Cx43 caused by CPB using immunofluorescence technique. The euthanasia of the animals was performed at the end of the experimental period. The results shown that in health animals not operated, the Cx43 is located in every studied local and there is no significant difference in the protein expression areas. Nevertheless, the CPB technique reduced the connexin expressions in the operated animals. Finally, we may conclude that the cardiopulmonary bypass for two hours and a spontaneous perfusion for one hour is a feasible procedure in dogs, but it determines serious clinical alterations and may induce pathophisyological process.

A revascularização cardíaca utilizando a ponte de safena é um procedimento bastante comum usado para restabelecer o fluxo coronariano. O sucesso do implante depende da adaptação do vaso que estava em um regime hemodinâmico venoso, e passa subitamente para um regime arterial. Durante este processo adaptativo, ocorrem diversas alterações moleculares cujo conhecimento pode fornecer alternativas de melhoramento da patência dos enxertos venosos em leito arterial. Neste trabalho está sendo investigada a regulação da IL-1beta tanto em veia safena humana como em modelo animal de arterialização venosa. A IL-1beta mostrou-se aumentada em veia safena humana arterializada tanto in vivo como ex vivo. Interessantemente, este aumento observado nos dias iniciais (1-5 dias) parece diminuir em tempos mais tardios (1-4 anos). Em modelo de arterialização de rato foi observado aumento de 12 vezes na expressão da IL-1beta após o primeiro dia de arterialização com diminuição posterior, mantendo-se em torno de 2 vezes maior em comparação a veia jugular normal. Além da regulação temporal da IL-1beta, foram também acompanhadas as alterações morfológicas que ocorrem durante o processo de arterialização venosa. Observou-se uma redução gradual de células musculares lisas (SMC) que quase desaparecem 3 dias após a cirurgia. Esta perda celular pode estar relacionada ao pico de apoptose observado já no primeiro dia de arterialização. Após 7 dias as SMC reaparecem, porém, de maneira ainda desorganizada. Concomitante com o reaparecimento das SMC observou-se progressivo espessamento da camada média, assim como surgimento de uma camada neoíntima. A IL-1beta, devido ao seu padrão de regulação assim como sua localização durante o processo de arterialização, pode estar relacionada com as alterações estruturais verificadas na arterialização do enxerto. Estratégias de intervenção modulando a atividade da IL-1beta poderão fornecer indicativos da sua participação no remodelamento do enxerto venoso. Em conjunto, demonstramos que o modelo de arterialização de segmento venoso em rato reproduz várias das alterações morfológicas descritas na doença do enxerto venoso em humanos e por isso será útil na caracterização de genes candidatos que participam deste processo. A IL-1beta tem sua expressão aumentada em segmento venoso arterializado in vivo e ex vivo, podendo representar um interessante alvo para aplicação de metodologias de intervenção visando influenciar a adaptação de enxertos venosos com finalidade terapêutica / The vein graft is subjected to increased tensile stress and the complex adaptive vein response to the arterial hemodynamic condition may predispose to bypass failure in some individuals. The understanding of molecular changes underlying this process may be useful for the development of novel therapeutical interventions to increase the vein graft patency. In this work, we investigated the early effect of arterialization on the expression of IL-1beta gene in human saphenous vein and the time-course regulation in rat arterialization model. IL-1beta is upregulated in early stage of human saphenous vein arterialization in vivo and ex vivo. This increase is also observed in arterialized rat jugular vein which showed IL-1beta expression 12 times higher on day 1 compared to normal jugular vein. Later, the IL-1beta levels decreases and maintain the level about twice above normal jugular vein. Moreover, it is observed gradual reduction of smooth muscle cells (SMC), which almost disappeared on the 3rd day after surgery. Apoptosis, which is markedly increased on the 1st day, appears to be an important event during this process. At the 7th day, cellular density and SMC proliferation gradually increased till the 90th day. There was a gradual thickening of the medial layer and formation of neointima with deposition of SMC in the subendotelial layer from day 7 on. Initially the medial layer appeared disorganized, day 7 to 14, then by day 28 it became more organized and the presence of an intimal layer with SMCs was evident. The neointimal layer increased gradually from day 7 on. These results provide evidence that the modulation of IL-1beta activity may be an interesting target to be explored I the future to increase the vein graft patency. Altogether, we demonstrate that the model of arterialization of venous segment in rat reproduces several of the morphological changes described in the venous graft disease in humans and thus will be useful in characterization of candidate genes involved in this process and testing them as a potential therapeutic targets. The IL-1beta expression is increased after 1 day of arterialization of vein segment in vivo and ex vivo and shall be an interesting target to be tested to influence the adaptation of venous grafts for therapeutic purpose

Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T16:30:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbin_IsabelCristinaChagas_M.pdf: 1008389 bytes, checksum: 5452120032625931602b36f22c3e2986 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia caracterizada pela ausência de distrofina, uma proteína estrutural da membrana plasmática. A ausência da distrofina faz com que a fibra muscular esquelética e cardíaca sofram alterações funcionais seguida de necrose. Com o avançar da idade cerca de 40% dos pacientes desenvolvem cardiomiopatia devido à progressiva fibrose miocárdica (FM) e vão a óbito por esta razão. Portanto, tratamento que impeça a progressão da FM é de importância em pacientes com DMD. O camundongo mdx, modelo animal da distrofia, também apresenta progressiva FM e por isso tem servido de modelo experimental para a cardiomiopatia na DMD. Parte da FM em camundongos mdx tem sido atribuída à deficiência em óxido nítrico. Desta forma, terapias baseadas na administração exógena de óxido nítrico têm sido aventadas e a L-arginina, substrato para óxido nítrico sintase tem se revelado uma candidata para tal. Esse trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da administração de longo tempo da L-arginina sobre a progressão da FM em camundongos mdx. Os animais foram tratados com L-arginina durante 60 semanas. Os corações foram retirados e preparados para avaliação histomorfométrica da FM através de coloração com tricrômico de Masson. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina (H&E) serviram para observação histológica e quantificação da densidade de células inflamatórias. Corações de camundongos mdx de mesma idade que aqueles tratados com L-arginina serviram como controle. Nossos resultados mostram que a área média de FM nos camundongos que receberam L-Arginina não foi diferente (p> 0,05) da dos camundongos do grupo controle (29.5 ± 2.5 % para controle vs 31.4 ± 2 % para L-arginina). De outro lado, a densidade de células inflamatórias foi significativamente inferior nos camundongos que receberam L-arginina comparados ao controle (169.3 ± 6.7 células/mm2 no controle vs 102 ± 6 células/mm2 em L-arginina). Baseado nisto, conclui-se que a administração por longo tempo de L-arginina não é capaz de prevenir a FM sugerindo que o uso da L-arginina pode não ser eficaz na prevenção da FM em DMD. Durante a realização do trabalho verificou-se que a administração de Larginina aumenta a já conhecida susceptibilidade dos camundongos mdx desenvolverem tumores. Cerca de 40% dos camundongos mdx que receberam L-arginina por longo tempo apresentaram tumores cuja análise histopatológica, incluindo-se a expressão de MyoD revela serem rabdomiossarcomas. Uma análise mais detalhada mostra que a maioria deles é do tipo embrionário e um do tipo alveolar. Esses resultados são importantes uma vez que esse protocolo poderá ser empregado para indução desse tipo de câncer e consequentemente servir como modelo experimental para o mesmo. / Abstract: The Duchenne Muscle Dystrophy (DMD) is a myopathy characterized by dystrophin absence, which is a structural protein of the plasma membrane. The dystrophin absence leads to functional alterations followed by necrosis in the skeletal and cardiac muscle fiber. As the patients grow older, about 40% of them develop cardiomyopathy due to progressive myocardial fibrosis (MF), and eventually die because of this. Therefore, a treatment that avoids the MF progression is very important to DMD patients. The mouse mdx, animal model of dystrophy, also presents progressive FM and thus, has been used as an experimental model for cardiomyopathy in DMD. The MF in mice mdx has been partially attributed to the deficiency of nitric oxide. This way, therapies based on the exogenous administration of nitric oxide have been quoted and the L-arginine, which is a substrate of the synthase nitric, has been revealed to be a strong candidate to these therapies. The aim of this current project is evaluating the effect of long-term administration of L-arginine on the progression of MF in mice mdx. The animals were treated with L-arginine for 60 weeks. The hearts were taken out and prepared for histomorphometric evaluation of the myocardial fibrosis through the colouring with Masson's trichrome. Slides stained with hematoxilin and eosin (H&E) were used for histological observation and quantification of the density of inflamatory cells. Hearts of mice mdx at the same age of those ones treated with L-arginine were used as control. Our results show that the average area of MF in mice which received L-arginine wasn't different (p>0,05) from the area of the control group (29,5 ± 2,5% for the control vs 31,4 ± 2% for the L-arginine). On the other hand, the density of inflamatory cells was significantly smaller in mice which received L-arginine compared to the control (169.3 ± 6.7 cells/mm² in the control vs 102 ± 6 cells/mm² in L-arginine). Based on this, we can conclude that the long-term administration of L-arginine is not enough to prevent the MF, suggesting that the use of L-arginine may not be effective to prevent the MF in DMD. During the research achievement, we could verify that the L-arginine administration increases the already known susceptibility of mice mdx of developing tumors. About 40% of the mice mdx which received L-arginine for a long time presented tumors whose histopathological analysis, including the MyoD expression, reveals them to be rhabdomyosarcomas. A further analysis reveals that most of them is the embrionic kind and one is the alveolar kind. These results are important since this protocol can be used to induce this kind of cancer and consequently serve as an experimental model for it. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A revascularização cardíaca utilizando a ponte de safena é um procedimento bastante comum usado para restabelecer o fluxo coronariano. O sucesso do implante depende da adaptação do vaso que estava em um regime hemodinâmico venoso, e passa subitamente para um regime arterial. Durante este processo adaptativo, ocorrem diversas alterações moleculares cujo conhecimento pode fornecer alternativas de melhoramento da patência dos enxertos venosos em leito arterial. Neste trabalho está sendo investigada a regulação da IL-1beta tanto em veia safena humana como em modelo animal de arterialização venosa. A IL-1beta mostrou-se aumentada em veia safena humana arterializada tanto in vivo como ex vivo. Interessantemente, este aumento observado nos dias iniciais (1-5 dias) parece diminuir em tempos mais tardios (1-4 anos). Em modelo de arterialização de rato foi observado aumento de 12 vezes na expressão da IL-1beta após o primeiro dia de arterialização com diminuição posterior, mantendo-se em torno de 2 vezes maior em comparação a veia jugular normal. Além da regulação temporal da IL-1beta, foram também acompanhadas as alterações morfológicas que ocorrem durante o processo de arterialização venosa. Observou-se uma redução gradual de células musculares lisas (SMC) que quase desaparecem 3 dias após a cirurgia. Esta perda celular pode estar relacionada ao pico de apoptose observado já no primeiro dia de arterialização. Após 7 dias as SMC reaparecem, porém, de maneira ainda desorganizada. Concomitante com o reaparecimento das SMC observou-se progressivo espessamento da camada média, assim como surgimento de uma camada neoíntima. A IL-1beta, devido ao seu padrão de regulação assim como sua localização durante o processo de arterialização, pode estar relacionada com as alterações estruturais verificadas na arterialização do enxerto. Estratégias de intervenção modulando a atividade da IL-1beta poderão fornecer indicativos da sua participação no remodelamento do enxerto venoso. Em conjunto, demonstramos que o modelo de arterialização de segmento venoso em rato reproduz várias das alterações morfológicas descritas na doença do enxerto venoso em humanos e por isso será útil na caracterização de genes candidatos que participam deste processo. A IL-1beta tem sua expressão aumentada em segmento venoso arterializado in vivo e ex vivo, podendo representar um interessante alvo para aplicação de metodologias de intervenção visando influenciar a adaptação de enxertos venosos com finalidade terapêutica / The vein graft is subjected to increased tensile stress and the complex adaptive vein response to the arterial hemodynamic condition may predispose to bypass failure in some individuals. The understanding of molecular changes underlying this process may be useful for the development of novel therapeutical interventions to increase the vein graft patency. In this work, we investigated the early effect of arterialization on the expression of IL-1beta gene in human saphenous vein and the time-course regulation in rat arterialization model. IL-1beta is upregulated in early stage of human saphenous vein arterialization in vivo and ex vivo. This increase is also observed in arterialized rat jugular vein which showed IL-1beta expression 12 times higher on day 1 compared to normal jugular vein. Later, the IL-1beta levels decreases and maintain the level about twice above normal jugular vein. Moreover, it is observed gradual reduction of smooth muscle cells (SMC), which almost disappeared on the 3rd day after surgery. Apoptosis, which is markedly increased on the 1st day, appears to be an important event during this process. At the 7th day, cellular density and SMC proliferation gradually increased till the 90th day. There was a gradual thickening of the medial layer and formation of neointima with deposition of SMC in the subendotelial layer from day 7 on. Initially the medial layer appeared disorganized, day 7 to 14, then by day 28 it became more organized and the presence of an intimal layer with SMCs was evident. The neointimal layer increased gradually from day 7 on. These results provide evidence that the modulation of IL-1beta activity may be an interesting target to be explored I the future to increase the vein graft patency. Altogether, we demonstrate that the model of arterialization of venous segment in rat reproduces several of the morphological changes described in the venous graft disease in humans and thus will be useful in characterization of candidate genes involved in this process and testing them as a potential therapeutic targets. The IL-1beta expression is increased after 1 day of arterialization of vein segment in vivo and ex vivo and shall be an interesting target to be tested to influence the adaptation of venous grafts for therapeutic purpose