Lorsque la levure Saccharomyces cerevisiae pousse en aérobiose, la respiration est immédiatement réprimée après l’addition de glucose au milieu de culture. Ce phénomène est appellé ”l’effet Crabtree”. Il a été rapporté que l’inhibition du flux respiratoire est concomitant avec l’accumulation cytoplasmique des hexoses phosphates provenant de la glycolyse. Dans ce travail, la levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée pour chercher à identifier les événements regulatoires à court terme qui sont associés à l’effet Crabtree ainsi que le possible rôle des hexoses phosphates dans l’inhibition de la respiration. En utilisant des mitochondries isolées il a été trouvé que le glucose 6-phosphate et le fructose 6-phosphate stimulent le flux respiratoire. Cet effet est compensé par des niveaux physiologiques de fructose 1,6-biphosphate, lequel inhibe la respiration en absence des autres hexoses phosphates. Cet effet est aussi observé in situ puisqu’il est obtenu en utiisant des sphéroplastes perméabilisés de levure. La répression du flux respiratoire induite par le fructose 1,6-biphosphate est due à une inhibition de l’activité des complexes respiratoires III et IV. Les résultats suggérent que le fructose 1,6-biphosphate pourrait être un des inducteurs de l’effet Crabtree chez la levure. Il est également possible que aussi chez les cellules mammifières cet hexose phosphate puisse réguler le metabolisme des tumeurs, où l’effet Crabtree a aussi été observé. / When the yeast Saccharomyces cerevisiae grows aerobically, its respiration is immediately repressed when adding glucose to the culture media. This phenomenon has been termed ”the Crabtree effect”. It has been reported that the respiratory flux inhibition is concomitant with the cytoplasmic accumulation of the glycolysis-derived hexoses phosphates. In this work, S. cerevisiae was used to investigate the short-term regulatory events associated to the Crabtree effect and the role of the hexoses phosphates during the respiratory inhibition. Using yeast isolated mitochondria it was found that glucose 6-phosphate and fructose 6-phosphate stimulate the respiratory flux. This was counteracted by physiological concentrations of fructose 1,6-biphosphate, which also inhibits respiration in the absence of the other two hexoses phosphate. This occurs in situ, as the effect mediated by the fructose biphosphate was also observed in yeast permeabilized spheroplasts. The respiratory flux repression mediated by fructose 1,6-biphosphate is due to an inhibition of the activity of respiratory complexes III and IV. The results suggest that fructose 1,6-biphosphate could be one of the Crabtree effect inducers in yeast. In mammals, this hexose phosphate might regulate as well tumour cell metabolism, where the Crabtree effect has also been observed.

Le peptide oncolytique LTX-315 a été développé comme un peptide cationique amphipathique qui tue les cellules cancéreuses et qui se révèle stimulant pour la réponse anti-cancer immune quand il est localement injecté dans des tumeurs présentent chez des souris immunocompétentes. La microscopie électronique par transmission révélées que LTX-315 a échoué à induire la condensation nucléaire apoptotique mais induit plutôt un phénotype nécrotique. Par conséquent, LTX-315 a échoué à stimuler l'activation de caspase-3, et l'inhibition des caspases par le biais de Z-VAD-fmk n'a pas été capable de réduire la mort cellulaire par LTX-315. En outre, deux inhibiteurs importants de la nécroptose, nommés necrostatin-1 et cycospotin-A, ont échoué à réduire la mort cellulaire par LTX-315. En conclusion, il semble que LTX-315 déclenche une nécrose non-régulée, qui peut contribuer à ses effets pro-inflammatoires et pro-immunitaires. Le fractionnement subcellulaire des cellules traitées par LTX-315, suivie par une quantification spectrométrique massive, a révélé que cet agent était enrichi en mitochondries. LTX-315 a causé un arrêt immédiat de la respiration mitochondriale sans aucun effet majeur de découplage. Par conséquent, LTX-315 a interrompu le réseau mitochondrial, a dissipé le potentiel mitochondrial de la membrane interne, et a causé la libération des protéines inter-membranaires mitochondriales dans le cytosol. LTX-315 était relativement inefficace dans la mitophagie stimulante. Les cellules dépourvues de deux pro-apoptotiques protéines à domaines multiples BAX et BAK, étaient moins susceptibles de mourir par LTX-315. De plus, les cellules conçues pour perdre leurs mitochondries étaient relativement résistantes à LTX-315, soulignant l'importance de cet organite pour la cytotoxicité induite par LTX-315. Au total, ces résultats soutiennent la notion que LTX-315 tue les cellules cancéreuses par sa vertue à perméabiliser les membranes mitochondriales. Nous avons observé que LTX-315 induit toutes les charactéristiques d'ICD connues. Cette conclusion a étévalidée par diverses méthodes indépendantes incluant la teinture par immunofluorence, dosage par bioluminescence, immunodosages, RT-PCRs. Quand il a été injecté dans des cancers créés, LTX-315 a causé une nécrose focale transitoirement hémorragique accompagnée d'une libération massive de HMGB1, aussi bien que l'activation de caspase-3 dans une partie des cellules. LTX-315 était au moins aussi efficace que le controle positif, l' anthracycline mitoxantrone en induisant une inflammation locale par infitration de cellules myéloïdes et de lymphocytes T. Collectivement, ces résultats appuient l'idée que LTX-315 peut induire l'ICD, expliquant sa capacité à induire des effets thérapeutiques immuno-dépendants.L'autre Lytix composé LTX-401 est un acide aminé oncolytique dérivé avec des propriétés immunogéniques potentielles. Nous démontrons que LTX-401 détruit sélectivement la strucutre du dispositif Golgi. Le fractionnement subcellulaire suivi par une détection spectométrique massive a révélé que LTX-401 a enrichi sélectivement dans le Golgi mieux que dans la mitochondrie ou dans le cytosol. Lagent Golgi-dissociant Brefeldin A a réduit la mort cellulaire par LTX-401 comme cela a partiellement inhibé la libération mitochondrial induite par LTX-401 de cytochrome C et l'activation de BAX. L'effet cytotoxique de LTX-401 a été atténué par la double suppression de BAX et BAK, comme la déplétion mitophagique forcée de la mitochondrie, déjà réfractaire à l'inhibition de caspase. LTX-401 induit toutes les caractéristiques majeures de la mort cellulaire immunogénique. En outre, les tumeurs traitées par LTX-401 ont manifesté une forte infiltration lymphoïde. Ensemble, ces résultats soutiennent l'idée que LTX-401 peut stimuler la mort immunogétique des cellules à travers un passage dans lequel LTX-401 localisé sur Golgi opère en amont de la perméabilisation de la membrane mitochondriale. / The oncolytic peptide LTX-315 has been developed as an amphipathic cationic peptide that kills cancer cells and turned out to stimulate anticancer immune responses when locally injected into tumors established in immunocompetent mice. We investigated whether LTX-315 induces apoptosis or necrosis. Transmission electron microscopy or morphometric analysis of chromatin-stained tumor cells revealed that LTX-315 failed to induce apoptotic nuclear condensation and rather induced a necrotic phenotype. Accordingly, LTX-315 failed to stimulate the activation of caspase-3. Moreover, inhibition of caspases by Z-VAD-fmk was unable to reduce cell killing by LTX-315. In addition, two prominent inhibitors of necroptosis, necrostatin-1 and cyclosporin A, failed to reduce LTX-315-induced cell death. In conclusion, it appears that LTX-315 triggers unregulated necrosis, which may contribute to its pro-inflammatory and pro-immune effects. Subsequently, we investigated the putative involvement of mitochondria in the cytotoxic action of LTX-315. Subcellular fractionation of LTX-315-treated cells, followed by mass spectrometric quantification, revealed that the agent was enriched in mitochondria. LTX-315 caused an immediate arrest of mitochondrial respiration without any major uncoupling effect. Accordingly, LTX-315 disrupted the mitochondrial network, dissipated the mitochondrial inner transmembrane potential, and caused the release of mitochondrial intermembrane proteins into the cytosol. LTX-315 was relatively inefficient in stimulating mitophagy. Cells lacking the two pro-apoptotic multidomain proteins BAX and BAK, were less susceptible to LTX-315-mediated killing. Moreover, cells engineered to lose their mitochondria were relatively resistant against LTX-315, underscoring the importance of this organelle for LTX-315-mediated cytotoxicity. Altogether, these results support the notion that LTX-315 kills cancer cells by virtue of its capacity to permeabilize mitochondrial membranes. Following, we investigated whether LTX-315 may elicit the hallmarks of immunogenic cell death (ICD). Overally, we observed that LTX-315 induces all known ICD characteristics. This conclusion was validated by several independent methods including immunofluorescence staining, bioluminescence assays, immunoassays, and RT-PCRs. The injection of LTX-315 into established cancers resulted in transiently hemorrhagic focal necrosis that was accompanied by massive release of HMGB1, as well as caspase-3 activation in a fraction of the cells. LTX-315 was equal or more efficient as the positive control, the anthracycline mitoxantrone (MTX), in inducing local inflammation with infiltration by myeloid cells and T lymphocytes. Collectively, these results support the idea that LTX-315 can induce ICD, explaining its capacity to mediate immune-dependent therapeutic effects. The second Lytix compound investigated, LTX-401, is an oncolytic amino acid derivative with potential immunogenic properties. We demonstrated that LTX-401 selectively destroys the structure of the Golgi apparatus. Subcellular fractionation followed by mass spectrometric detection revealed that LTX-401 was selectively enriched in the Golgi rather than in the mitochondria or in the cytosol. The Golgi-dissociating agent Brefeldin A (BFA) reduced cell killing by LTX-401 as it partially inhibited LTX-401-induced mitochondrial release of cytochrome c and the activation of BAX. The cytotoxic effect of LTX-401 was attenuated by the double knockout of BAX and BAK, as well as the mitophagy-enforced depletion of mitochondria, yet was refractory to caspase inhibition. LTX-401 induced all major hallmarks of immunogenic cell death. Moreover, LTX-401-treated tumors manifested a strong lymphoid infiltration. Altogether, these results support the contention that LTX-401 can stimulate immunogenic cell death through a pathway in which Golgi-localized LTX-401 operates upstream of mitochondrial membrane permeabilization.

Les niveaux de chlorure sont rigoureusement régulés par des canaux de chlorure tels que le régulateur transmembranaire de mucoviscidose (CFTR), la famille de canaux CLC ou les canaux de chlorure activés par le calcium. Un dérèglement des concentrations de chlorure ou du transport de ce dernier a été rapportée pour être lié à plusieurs maladies telles que la mucoviscidose, la myotonie, l'épilepsie, l'hyperekplexie ou la surdité. Toutes ces maladies appartiennent à la famille des pathologies qui présentent un déficit de la fonction lysosomale et qui sont caractérisées par un défaut du processus autophagique.Les cellules épithéliales pulmonaires des malades atteints de mucoviscidose montrent également un défaut d’autophagie. L’association de deux produits : la cysteamine et l’epigallocathecin gallate (EGCG) permet de restaurer la fonction autophagique de ces cellules et améliore les symptômes de la maladie. Nous avons tenté d'améliorer cette combinaison en criblant des inducteurs de l'autophagie pour leur capacité d’interaction avec la cystéamine et pour une meilleure efficacité de traitement. Nous avons ainsi trouvé que l'amiodarone, de manière similaire à l'EGCG, était capable d'engager une interaction coopérative avec la cystéamine pour stimuler l'autophagie dans les lignées cellulaires. De plus, l'amiodarone s’est révélé relativement efficace pour restaurer l'expression d’une protéine Del 508 CFTR mature et fonctionnelle dans les cellules épithéliales.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons exploré les relations entre la modulation des concentrations intracellulaires des ions chlorure et l'autophagie. Trois approches complémentaires ont été utilisées (i) l’appauvrissement / réduction du chlorure dans le milieu de culture des cellulaires (ii) la réduction de l'expression du gène CLCN7 codant pour le seul transporteur de chlorure connu pour être présent dans les lysosomes et (iii) l’utilisation de transporteurs synthétique des ions chlorure. Nous avons montré que la modulation de la concentration des ions Cl- régulait l'autophagie. Cela a été observé lorsque nous avons déplété le chlorure du milieu de culture cellulaire ou lorsque nous avons aboli le gradient de chlorure en utilisant des transporteurs de chlorure synthétique (SCTs). Nous avons également montré que les STCs modifiaient la structure et la fonction des mitochondries. De plus, nous avons montré que les antioxydants restauraient la fonction mitochondriale et inhibaient la stimulation de l'autophagie, ce qui permet de voir sous un jour nouveau le rôle que le chlorure pourrait jouer dans la signalisation de différentes voies cellulaire de réponse au stress. / Chloride levels are stringently regulated by chloride channels such as cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR), the CLC family of channels or calcium activated chloride channels. A dysregulation of chloride concentrations or transport has been reported to be linked to several diseases including cystic fibrosis (CF), myotonia, epilepsy, hyperekplexia or deafness. All these diseases belong to the family of lysosomal storage pathologies which are characterized by a defect in the autophagic process.The pulmonary epithelial cells of CF patients show a defect of autophagy. The combination of two products: cysteamine and epigallocathecin gallate (EGCG) has been shown to restore the autophagic function of these cells and to improve the symptoms of the disease. We have tried to enhance this combination by screening inducers of autophagy for their ability to interact with cysteamine and for better treatment efficacy. We found that amiodarone, similarly to EGCG, was able to engage in a cooperative interaction with cysteamine to stimulate autophagy in cell lines. In addition, amiodarone has been found to be relatively effective in restoring expression of a mature and functional Del F508 CFTR protein in epithelial cells.In the second part of this thesis, we explored the relationships between the modulation of intracellular chloride concentration and autophagy. Three complementary approaches were used (i) the depletion/reduction of chloride in the cell culture medium (ii) the reduction of the expression of the CLCN7 gene encoding the only chloride transporter known to be present in lysosomes and (iii) the use of synthetic carriers of chloride ions. We have shown that the modulation of the concentration of Cl- modulates autophagy. This was observed when we depleted chloride from the cell culture medium or when we abolished the chloride gradient using Synthetic Chloride Transporters (SCTs). We have also shown that SCTs modify the structure and function of mitochondria. In addition, we have shown that anti-oxidants restore mitochondrial function and inhibit the stimulation of autophagy, allowing us to see in a new light the role that chloride could play in different stress response pathways.

En 1985 Kroto décrit le troisième allotrope du carbone, le fullerène, une sphère de 60 carbones d’1nm de diamètre aux caractéristiques physico-chimiques particulières. La réactivité chimique du C₆₀ est dominée par les réactions d’addition et sa grande affinité pour les radicaux libres grâce à ses 30 double-liaisons. Cette propriété a été explorée dans le stress oxydant, tant in vitro qu’in vivo, où l’équilibre redox est impliqué, comme dans les situations pathophysiologiques impliquant l’inflammation et la dégénérescence cellulaire. En particulier, un traitement au C₆₀ solubilisé dans de l’huile a permis de prolonger l’espérance de vie chez le rat. Le produit, commercialisé à travers le monde, n’a pas encore fait l’objet d’essai clinique. D’autre part certaines préparations peuvent contenir des impuretés. Il est donc important d’établir des critères de pureté et d’intégrité des préparations de C₆₀. Ce travail de thèse comporte deux parties. La première, physicochimique, nous a permis d’évaluer la pureté de préparations commerciales de C₆₀ de différentes origines faisant appel à différentes techniques d’analyse: microscopie électronique à balayage, diffraction aux rayons X, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), analyse thermogravimétrique, chromatographie liquide (CLHP) ou en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM), ainsi que la spectroscopie ultraviolet-visible ou infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). La DSC est la technique de choix pour établir le critère de pureté et la FTIR la plus rapide. La CG-SM est nécessaire à l’identification des impuretés volatiles, tandis que la CLHP permet de détecter les fullerènes lourds et les dérivés du C₆₀. La deuxième partie a porté sur des aspects fonctionnels des fullerènes et nous avons, pour cela, utilisé des préparations pures selon les critères définis précédemment. Dans un premier temps, nous avons cherché à préciser le sous-compartiment cellulaire ciblé par le C₆₀ injecté in vivo chez la souris. Après administration d’une solution huileuse, les molécules de C₆₀ sont retrouvées dans le foie et la rate, à l’intérieur des cellules, parfois au niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique. La présence des molécules de C₆₀, au niveau des mitochondries a été corroborée par la mise en évidence de modifications spécifiques d’activité des enzymes de la mitochondrie (malate déshydrogénase et complexe I de la chaîne respiratoire). Dans un deuxième temps, nous avons abordé l’effet des fullerènes sur des cellules intervenant dans une dysrégulation immunologique où l’inflammation joue un rôle important : l’allergie. L’évènement cellulaire à l’origine des symptômes allergiques est la libération de médiateurs de l’inflammation et de la réponse immunitaire lors de l’activation dépendante des IgE des basophiles et des mastocytes. L’effet régulateur de C₆₀ et de quatre dérivés hydrosolubles, le fullérol, la β-cyclodextrine C₆₀, le dendro C₆₀ et le C₆₀ serinol-malonate, a été testé. L’innocuité des dérivés à des concentrations nanomolaires et leur pouvoir inhibiteur sur la dégranulation IgE et non IgE dépendante des lignées mastocytaires de rat a été vérifié in vitro. Dans un test d’activation cellulaire mesurant l’expression des marqueurs CD63 et CD203c par cytométrie de flux, nous montrons que les différents dérivés sont capables d’interférer ex vivo avec l’activation de basophiles de patients allergiques dans des conditions naturelles de sang total. Les taux d’inhibition dépendent des dérivés et des patients avec un maximum observé à 35% en présence de C₆₀ serinol-malonate. Ces inhibitions ont été reproduites sur des basophiles humains purifiés en étudiant des marqueurs d’activation supplémentaires CD107a et CD69. Les perspectives de ce travail portent sur la spécificité et les mécanismes d’inhibitions observés au niveau intracellulaire. Elles incluent, par exemple, l’étude des flux de calcium ou des protéines de fusion, ou des facteurs de transcription. / In 1985 Kroto discovered the third allotrope of carbon, fullerene, spherical molecule consists of 60 carbons with 1 nm in diameter with a specific physico-chemical characteristic. The chemical reactivity of C₆₀ is governed by addition reactions and its high affinity for scavenging free radicals thanks to its 30 double bonds. This property has been widely explored in the field of oxidative stress, in vitro and in vivo, where redox balance is involved, as physio-pathological situations involving inflammation and cellular degeneration. In particular, treatment with C₆₀ solubilized in olive oil extended life span in a rat experimental model. The product, marketed worldwide, has not yet been clinically tested. On the other hand, some preparations may contain impurities. It is therefore important to establish criteria for the purity and integrity of C₆₀ preparations. This thesis work consists of two parts. In the first physico-chemical part, a criterion of C₆₀ purity was established for evaluating the purity of several commercial preparations of C₆₀ with different origins using the following techniques: scanning electron microscopy, X-ray diffraction, Differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), liquid chromatography and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), as well as ultraviolet-visible and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results show that FTIR is the easiest way to control the quality of C₆₀ and GC-MS is necessary for identifying volatile impurities, while HPLC remains essential for detecting other fullerenes and C₆₀ derivatives. The second part of the thesis deals with functional aspect of fullerenes and for this purpose we used the pure preparation of C₆₀ evaluated according to the previously defined criteria. In a first chapter, to precise the sub-cellular compartment targeted, the C₆₀ dissolved in olive oil were in vivo injected in mice. After administration, C₆₀ molecules were visualized in the liver and in the spleen, inside the cells and sometimes in mitochondria and endoplasmic reticulum. The targeting of [60]fullerene to the mitochondria was confirmed by a specific modification of the activities of mitochondrial enzymes (malate dehydrogenase and complex I of respiratory chain). In a second chapter we studied the effect of fullerenes on cells involved in an immune dysregulation where inflammation plays a role: allergy. The cellular mechanism at the basis of allergic symptoms is the release in circulation and tissues of mediators of inflammation and immune response from IgE-dependent activation of basophiles and mast cells. The regulatory effects of [60]fullerene and 4 hydrosoluble derivatives, fullerol, β-cyclodextrin [60]fullerene, dendro [60]fullerene and [60]fullerene serinol-malonate, were tested. In vitro experiments showed an absence of toxicity at nanomolar concentrations and inhibitory abilities on the IgE-dependent and -independent activation of the rat mast cell line (RBL). In a cellular activation test monitoring the expression of the degranulation and activation markers CD63 and CD203c on basophiles, by flow cytometry, we show that the various fullerenes are able also to inhibit the ex vivo activation of basophiles from peanut allergic patients in a natural physiological environment: in whole blood. Inhibition rates depend on patients and derivatives with a maximum inhibition observed at 35% in presence of [60]fullerene serinol-malonate. These inhibitions were reproduced on purified human basophiles by studying further activation markers CD107a and CD69. Working perspectives will be on the specificity and the mechanisms of inhibition by studying intracellularly calcium influx or the expression of fusion proteins and transcription factors.

La mitochondrie forme un réseau dynamique de tubules, dont la morphologie et la distribution sont étroitement régulées. Les mitochondries sont des organelles à double membrane dont l’architecture interne est complexe. Les crêtes mitochondriales forment des invaginations de la membrane interne. Elles sont le lieu des phosphorylations oxydatives, réactions par lesquelles l’ATP synthase produit l’ATP. L’ATP synthase est également connue pour son rôle clé dans la morphogenèse des crêtes. Dans cette étude j’ai mis en évidence in vivo la localisation en cluster de l’ATP synthase au sein du réseau mitochondrial de S. cerevisiae se développant sur substrat fermentescible. Mes résultats suggèrent que ces clusters correspondent aux crêtes mitochondriales, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude du remaniement de la membrane interne.La morphologie du réseau mitochondrial est maintenue par un équilibre entre les processus de fusion et de fission des tubules mitochondriaux. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai mis en évidence une fragmentation progressive du réseau mitochondrial lors de l’entrée des cellules en quiescence, un état cellulaire non prolifératif réversible. En quiescence, le réseau mitochondrial est constitué de petites vésicules sous corticales immobiles au contenu enzymatique variable. Lors d’un retour à l’état prolifératif ces vésicules fusionnent rapidement pour reformer un réseau tubulaire, et ce, avant l’émergence de la cellule fille. De façon surprenante j’ai mis en évidence que ni les machineries canoniques de fusion ou de fission, ni le cytosquelette d’actine ne sont requis lors du remaniement du réseau mitochondrial dans les transitions entre prolifération et quiescence. / Mitochondria form a dynamic tubular network which organization and distribution is highly regulated.Mitochondria are double membrane organites with a complex internal architecture. Cristae, which areinner membrane invaginations, are the site of oxidative phosphorylation, reactions by which ATP synthaseproduces ATP. ATP synthase also play a key role in cristae morphogenesis. In this study, I have shown thatATP synthase localized as discrete clusters along the mitochondrial network in living S. cerevisiae cellsgrown on a fermentable carbon source. Overall our data suggest that ATP synthase clusers correspond tomitochondrial cristae, opening new avenues to explore the mechanisms involved in inner membraneremodelling.Mitochondrial network morphology is regulated by a dynamic equilibrium between the fusion and fissionof mitochondrial tubules. In the second part of my thesis, I highlight a progressive mitochondrialfragmentation during quiescence establishment, a state defined as a reversible absence of proliferation.Quiescent cells mitochondrial network is composed of immobile small cortical mitochondrial vesicles witha variable enzymatic content. Upon quiescence exit, cortical mitochondrial vesicles rapidly fuse and atubular network is reconstituted prior to bud emergence. Astonishingly, neither the canonical fusion orfission machineries nor the actin cytoskeleton are required for the mitochondrial network modificationduring quiescence / proliferation transition.

Vitamine E analogues α-tocopheryl succinate (α-TOS) and mitochondrially targeted vitamine E succinate (MitoVES) are anti-cancer agents from the group of "mitocans", the compounds acting via mitochondria which present a promising invariant target for cancer cell therapy. α-TOS and MitoVES induce apoptosis selectively in various cancer cell types involving generation of reactive oxygen species (ROS). Generated superoxid anion radicals in response to α-TOS and MitoVES are believed to be converted into hydrogen peroxide that is known to activate Mammalian sterile 20-like kinase (Mst1), the central component of Hippo signalling pathway, that presents an universal size control mechanism in all metazoans and its deregulation is linked to tumourigenesis. MitoVES and α-TOS were both reported to activate Mst1 that phosphorylates Forkhead box O1 (FoxO1) transcription factor resulting in its transport to nucleus where induce the expression of pro-apoptotic genes, including NOXA, and thus promote apoptosis. The target of Hippo signalling pathway is transcriptional co- activator Yes-associated protein (Yap) which was found in Drosophila melanogaster to regulate the expression of transcription factor c-Myc which is known as the most prominent human oncogene. This thesis focused on involvement of Hippo signalling...

Title: Imaging of fluorescently labelled mitochondria using Biplane FPALM microscopy Author: Bc. Marek Dostál Department: Fyzikální ústav UK Supervisor: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Consultants: RNDr. Petr Ježek, DrSc. Mgr. Hana Engstová, Ph.D. Abstract: In this thesis the results are presented of a search for suitable PCFP markers for a visualization inner and outer mitochondrial membranes by unique biplane FPALM microscope. We participated in debugging the measuring software for the purpose of 3D vizualization mitochondrial nets and determine their parameters. For this purpose were developed two methods. The first one can be applied to determine the parametrs of outer membranes and the second one is applicable to determine parametrs of inner membranes. On smaller statistical file we managed to confirm dependence quality of mitochondrial net on the cell culture conditions. Under stress conditions e.g. hypoxia the quality of mitochondrial net is changed. Keywords: mitochondria, Biplane FPALM, GFP, 3D visualization.

Isolated deficiency of F1FO-ATPsynthase is a soubgroup of mitochondrial diseases caused by mutations in nuclear and mitochondrial-encoded structural subunits, or nuclear-encoded assembly factors of F1FO-ATPsynthase. The most often mutations are found in a MTATP6 gene localized in the mitochondrial DNA and a TMEM70 gene, localized in the nuclear DNA. A MTATP6 gene encodes subunit a of F1FO-ATPsynthase and its mutation usually leads to reduced phosphorylation activity of F1FO-ATPsynthase. A TMEM70 gene encodes a 21 kDa mitochondrial protein of the inner mitochondrial membrane of not completely explained function and its mutation results in the decrease in a content of fully assembled F1FO- ATPsynthase. The aim of this thesis was to investigate the impact of isolated F1FO- ATPsynthase deficiency on the oxidative phosphorylation system (complex I-IV), other selected mitochondrial proteins, and mitochondrial network in two cell lines of primary human skin fibroblasts with an isolated deficiency of F1FO-ATPsynthase (mutation m.8851T>C in MTATP6 and mutation c.317-2A>G in TMEM70) during the first days of their cultivation in media containing galactose or glucose as a carbohydrate source with a presence or absence of L-glutamine. The control cell line was found to have higher amounts of respiratory chain...

Aim of this thesis was to observe changes in oxidative metabolism and expression of important neuroenergetic proteins in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y due to inhibition of FTO. FTO is a RNA demethylase that uses N6-methyladenosine as substrate. Differences in enzyme expression are connected to broad area of effects involving energy homeostasis. Mitochondria are cellular powerhouses, a key elements in production of energy and metabolic substrates, yet a source of potentially dangerous reactive oxygen species (ROS) and analogous reactive molecules. In order to better understand FTO purpose in neuronal energetic metabolism, we examined mitochondrial respiratory chain. Using high-resolution respirometry we were capable of observing impairment in mitochondrial respiration after FTO inhibition. There was considerable decline in endogenous respiration, maximal respiration rate and reserve capacity. In order to obtain more detailed view into mitochondrial respiration, expression levels of electron-transport complexes were quantified by Western blot technique. Slight reduction was identified in subunits of complex I and IV. However, the most prominent alteration was seen in complex II subunit. There were no differences in expression of complex III and ATP synthase subunits. Beside disrupted activity...

Inhibitory factor 1 (IF1) is one of the major regulators of mitochondrial ATP synthase activity, a key enzyme of energy metabolism. Its inhibitory effects are known in conditions such as hypoxia or starvation, but the hypothesis that IF1 inhibits ATP synthase activity even under physiological conditions is still not entirely accepted. Disorders of ATP synthase regulation can be fatal to the cell and have been described, for example, in carcinogenesis and ischemia. It has also been found that silencing of the IF1 gene in pancreatic β-cells increases insulin secretion, and thus, IF1 may be important in the pathogenesis of type 2 diabetes. The goal of this work is to summarize the current knowledge about the IF1 protein and to obtain new results that will help elucidate the mechanism by which this protein regulates mitochondrial ATP synthase. Specifically, this work deals with the ratio of IF1 protein to ATP synthase in pancreatic β-cells, depending on different culture conditions. It further investigates the occurrence of post-translational modifications of the IF1 protein in pancreatic β-cells (INS- 1E model cells), which may play a role in the regulation of IF1 activity. It also deals with the cellular ATP/ADP ratio, which is one of the key factors for insulin secretion by pancreatic β-cells. An...