L'apoptose spontanée des lymphocytes T entraine une lymphopénie marquée dans les rats BBDP (BioBreeding Diabetes Prone) conduisant au développement du diabète auto-immun de type I. Le phénotype de la lymphopénie dans ces rats est lié au locus lyp. L'allèle lyp contient une mutation du cadre de lecture à l'intérieur du gène qui code pour GIMAP5 (GTPase of immunity associeted nucleotide binding protein 5). Cette mutation produit une protéine tronquée de 11 Kd. Les mécanismes par lesquels, GIMAP5 assure la fonction de survie des lymphocytes T ne sont pas bien connus. Cependant, des études antérieures ont montré que l'apoptose précoce des cellules T matures était indépendante des caspases, mais est associée à la perte du potentiel de la membrane mitochondriale. D'autres études de surexpression ont montré que GIMAP5 localise dans les mitochondries et le réticulum endoplasmique. En utilisant un antisérurn de lapin contre GIMAP5, nos résultats ont montré que la protéine GIMAP5 endogène est associée à une fraction subcellulaire sédimentable distincte de la mitochondrie et du réticulum endoplasmique dans les lymphocytes T matures de rat normaux. Pour confirmer davantage ces données par la microscopie confocale, nous avons surexprimé rGIMAP5 étiqueté par myc à la partie N-terminale dans les fibroblastes Rat-2, la partie C-terminale transmembranaire étant intacte. Nos résultats suggèrent que GIMAP5 régule l'intégrité de la membrane mitochondriale dans une fraction subcellulaire différente des mitochondries.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La biogénèse des mitochondries est un processus qui implique l’importation de plus de 98% des protéines constitutives de ces organites. Les signaux protéiques impliqués dans l’importation de ces protéines dans les mitochondries sont relativement bien caractérisés. Il y a une dizaine d’année, il a été montré chez la levure et les mammifères que d’autres signaux, présents au niveau des ARNm étaient également impliqués dans l’adressage et l’importation des protéines dans les mitochondries. Ce processus d’adressage d’ARNm à la surface des mitochondries s’est montré fondamental pour la biogénèse et la fonction des mitochondries chez la levure. Au cours de cette thèse, nous avons démontré que des ARNm étaient adressés à la surface des mitochondries chez trois espèces végétales. Par la combinaison d’approches in vitro et in vivo, nous avons également identifié des éléments cis permettant l’adressage d’ARNm à la surface des mitochondries à partir d’un messager candidat : AtVDAC3. Ces éléments cis sont localisés dans une séquence de 142 nt présente dans la région 3’UTR du messager AtVDAC3. Le rôle de ce processus chez les plantes est actuellement en cours d’étude. / Mitochondria biogenesis requires the import of more than 98 % of their constitutive proteins. Proteic signals involved in mitochondrial protein import are well known today. Ten years ago, it was shown in yeast and mammals that targeting signals are also present at the level of mRNAs. Cytosolic mRNA targeting to mitochondria is an extended process concerning half of the mRNAs encoded mitochondrial proteins in yeast. Furthermore, this process is fundamental for yeast mitochondria biogenesis and functions. During this PhD, we showed that some mRNAs are also targeting to mitochondria in three different plant species. These results highlighted the conservation of this process during evolution. By using in vivo and in vitro experimental strategies, we also identified a mitochondrial cis-targeting element in one candidate mRNA: AtVDAC3. This cis-element is 142 nt long and is located in the 3’UTR of the AtVDAC3 mRNA. We are now investigating the roles of this process in mitochondria biogenesis and functions in plants.

Des mutations dans le génome mitochondrial donnent lieu à l’apparition de maladies neuro-dégénératives ou de myopathies. Pour développer des approches de thérapie génique pour prévenir de ces syndromes, nous devons mieux comprendre les mécanismes moléculaires d’import mitochondrial des ARN. Pour cela nous tentons de récapituler in vitro l’import des ARN à partir d’extraits cellulaires fractionnés par différentes méthodes telles que la chromatographie d’exclusion ou d’affinité à l’aide d’étiquettes d’ARN ou de protéines. Nos résultats affinent nos connaissances de ces mécanismes et permettent d’avancer l’idée que l’énolase, une enzyme de la glycolyse, n’agit pas seule lors de la première étape de l’import de l’ARNtLys avec anticodon CUU (tRK1). En effet nous avons montré que l’énolase ultra-purifiée ne se fixait plus à tRK1 in vitro, alors que des préparations de mitochondries de levure récapitulaient l’import lorsque diverses fractions ajoutées à l’énolase étaient testées. Les fractionnements d’extraits opérés permettent de cerner certaines protéines qui pourraient fonctionner de concert avec l’énolase pour véhiculer tRK1 vers la mitochondrie. / Mutations in the mitochondrial genome give rise to neurodegenerative diseases or myopathies. To develop gene therapy for preventing the appearance of these syndromes, we need to better understand the molecular mechanisms of mitochondrial RNA. For this purpose we try to recapitulate in vitro the import of RNA from cell extracts fractionated by different methods such as exclusion or affinity chromatography using tagged RNAs or proteins. Our results refine our knowledge of these mechanisms and allow to advance the idea that enolase, an enzyme of glycolysis, does not act alone during the first stage of import of tRNALys with anticodon CUU (tRK1). Indeed, we have shown that ultra-purified enolase no longer binds to tRK1 in vitro, while preparations of yeast mitochondria recapitulate the import when various fractions mixed with enolase were tested. The performed extracts fractionation make it possible to point to certain proteins which could work in concert with the enolase to convey tRK1 to mitochondria.

Le choc septique reste grévé d'une mortalité importante malgré les efforts de recherche expérimentale et clinique. Certains protocoles thérapeutiques cependant, ont permis ces dernières années de diminuer cette mortalité. Les mécanismes précis d'amélioration de ce pronostic sont inconnus. Il est possible que ce gain de survie soit du à une atténuation du Syndrome de Défaillance Microcirculatoire et Mitochondriale du Sepsis. Les travaux réunis dans une première partie de ce volume ont permis de mieux caractériser l'effet de différentes thérapeutiques sur la microcirculation, la vasoréactivité. Thérapeutique annexe comme la sédation qui est utilisée en pratique clinique dans nos services de réanimation ou dans nos laboratoires chez nos animaux, qui perturbe la microcirculation. Thérapeutique directe comme la protéine C activée qui est déjà connue pour être bénéfique sur la microcirculation. La protéine C activée dans notre modèle de choc au LPS chez le rat a notamment un effet bénéfique microcirculatoire possiblement par une dégradation moindre du glycocalyx, le manteau endothélial. Ce produit a également un effet bénéfique sur la réponse vasculaire à la noradrénaline, restaurant cette réponse par rapport à des rats septiques. Une amélioration de la fonction vasculaire et cardiaque est constatée avec ce traitement, sans que l'on puisse affirmer que cette amélioration soit le fait d'une action directe bénéfique sur la microcirculation, la cellule musculaire lisse etc ou une amélioration globale de la réponse de l'organisme au choc : baisse concommittante de médiateurs comme le TNF-α, les dérivés nitrés, ou baisse concommitante du stress oxydatif. Dans une deuxième partie du travail, l'implication de la mitochondrie par le biais de la modulation de facteurs proapoptotiques et de la dissipation du potentiel de membrane ouvre des perspectives pour mieux caractériser cette atteinte chez l'homme dans le futur. En effet moduler la dissipation du potentiel membranaire mitochondriale module chez l'animal la mortalité dans notre modèle. Nous proposons pour l'avenir d'essayer de mieux caractériser ces anomalies chez l'homme.

La thiamine (vitamine B1) est essentielle pour toutes les formes de vie. Le diphosphate de thiamine (ThDP) est un coenzyme indispensable au métabolisme oxydatif des cellules. Dans la plupart des tissus, on trouve également le triphosphate de thiamine (ThTP), dont le rôle biologique est encore mal connu. Néanmoins, le fait quil ait été observé dans tous les organismes étudiés, depuis les bactéries jusquaux mammifères, suggère un rôle assez général comme, par exemple, une réponse à certains types de stress cellulaire (privation dacides aminés chez E. coli, flétrissement des feuilles chez A. thaliana). Lobjectif de notre travail a été de déterminer le mécanisme de synthèse du ThTP. Avant détudier son mécanisme de synthèse, nous avons étudié sa distribution dans des biopsies tissulaires et fluides corporels humains. Une telle étude systématique était intéressante car un déficit en ThTP (ou une perturbation de son métabolisme) pourrait être impliqué dans certaines pathologies, par exemple neurodégénératives ou cardiaques. Nos résultats montrent que les niveaux de diphosphate de thiamine dans les tissus humains sont relativement faibles, alors que le triphosphate de thiamine est relativement abondant. Nous avons ensuite étudié le mécanisme de synthèse du ThTP dans le cerveau de rat. Les données recueillies au cours de ces études nous ont permis de dresser plusieurs conclusions. Dans le cerveau, la synthèse du triphosphate de thiamine a lieu dans les mitochondries avec le ThDP et le phosphate inorganique (Pi) comme précurseurs. La réaction est stimulée par les substrats de la chaîne respiratoire comme le pyruvate et le succinate, et est inhibée par des agents bloquant la chaîne respiratoire, ce qui suggère que le flux délectrons à travers la chaîne respiratoire est la source dénergie pour cette réaction endergonique ThDP + Pi ↔ ThTP. La synthèse du ThTP est inhibée lorsque la Δp est dissipée par des protonophores ou par la valinomycine en présence de K+ à lextérieur. La lyse des mitochondries induit également une abolition de la formation du ThTP. La dissipation de la Δp aboutit à une hydrolyse rapide du ThTP synthétisé, suggérant que la réaction ThDP + Pi ↔ ThTP + H2O est catalysée par une ThTP synthase réversible capable de transporter des protons. Les mitochondries peuvent libérer du triphosphate de thiamine. Ce mécanisme de libération nécessite la présence de Pi et pourrait impliqué un ou plusieurs composants du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Ainsi, la synthèse et la libération du ThTP sont soumises à des régulations spécifiques. Nos résultats montrent, pour le première fois, la production dun composé hautement énergétique, autre que lATP, par un mécanisme de couplage chimiosmotique.

Résumé Le complexe V mitochondrial (F1FO-ATP synthétase) catalyse la phosphorylation de lADP par le phosphate inorganique en utilisant la force proton-motrice générée par la chaîne de transport délectrons. Ce complexe protéique possède deux domaines : un secteur associé à la membrane, FO, impliqué dans la translocation des protons, et un domaine extrinsèque, F1, qui catalyse la synthèse dATP. Les deux secteurs sont connectés par deux bras : un bras central qui couple la translocation des protons à la région catalytique, et un bras latéral qui est considéré comme faisant partie du stabilisateur (stator) de lenzyme. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à lenzyme de deux algues appartenant à la classe des Chlorophyceae, Chlamydomonas reinhardtii et Polytomella sp.. L'enzyme des deux algues présente une composition sous-unitaire atypique, les sous-unités classiquement retrouvées chez les eucaryotes et impliquées dans larchitecture du bras périphérique ou dans la dimérisation du complexe en étant absentes. En contrepartie, 9 sous-unités dorigine évolutive inconnue sont associées à lenzyme. Elles ont été appelées Asa1 à 9 pour ATP Synthase Associated protein. Chez C. reinhardtii et Polytomella sp., lATP synthétase présente une stabilité accrue de sa forme dimérique in vitro, et, in vivo, les cellules de C. reinhardtii sont insensibles à loligomycine, un puissant inhibiteur de la translocation de protons au travers de FO. Nous avons dans un premier temps tenté détablir la composition sous-unitaire du complexe V chez des espèces appartenant aux différentes classes de Chlorophytes (Chlorophyceae, Trebouxiophyceae, Prasinophyceae et Ulvophyceae) en combinant analyses génomiques et protéomiques. Plusieurs sous-unités Asa ont ainsi pu être détectées chez des algues appartenant à divers ordres de Chlorophyceae. Au contraire, les analyses de séquences disponibles chez les autres classes de Chlorophytes (Trebouxiophyceae, Prasinophyceae et Ulvophyceae) indiquent une composition canonique de lenzyme. Lanalyse de la stabilité de la forme dimérique du complexe de différentes espèces d'algues vertes sur BN PAGE (Blue Native PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) suggère également que la présence dun dimère stable est caractéristique aux Chlorophyceae. Par ailleurs, leur croissance, respiration, et niveaux d'ATP sont à peine affectés par la présence d'oligomycine à des concentrations inhibitrices chez les représentants des autres classes de Chlorophytes. Les nombreuses particularités communes aux algues appartenant à cette classe suggèrent que la perte d'éléments canoniques du stator est apparue lors de la séparation des Chlorophyceae et a été accompagnée du recrutement de nouvelles sous-unités. Ce réarrangement drastique de la composition de stator et du module de dimérisation pourrait avoir conféré de nouvelles propriétés à lenzyme, notamment une meilleure stabilité et une plus grande résistance à loligomycine. Nous avons également étudié la fonction de la sous-unité atypique Asa7 en inactivant son expression chez C. reinhardtii. Bien que la perte de la sous-unité Asa7 n'aie aucun impact sur la bioénergétique des cellules ou sur la structure mitochondriale, elle déstabilise lenzyme in vitro et rend la croissance, la respiration, et de le niveau d'ATP sensible à oligomycine. L'impact de la perte de l'activité ATP synthétase mitochondriale chez un organisme photosynthétique a été étudié chez C. reinhardtii par linactivation de l'expression du gène ATP2, codant pour la sous-unité catalytique beta. Les résultats démontrent que, en l'absence de beta, l'ATP synthétase ne peut plus être assemblée et les cellules deviennent dépendantes de la photosynthèse. La respiration en présence ou en absence du découpleur CCCP suggère que le passage des protons à travers la membrane interne mitochondriale est bloqué chez la souche mutante. Enfin, la morphologie des mitochondries est affectée, et les chloroplastes montrent un réaménagement massif de l'appareil photosynthétique, suggérant des répercussions importantes sur la synthèse dATP par les chloroplastes. Ces résultats contribuent à la compréhension des interactions entre organites bioénergétiques chez les organismes photosynthétiques.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 227-261.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 225-249.

Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 12 p.