A restrição calórica (RC) estende a expectativa de vida de muitos organismos por mecanismos ainda em estudo. Entre os vários efeitos fisiológicos da RC encontra-se o aumento na biogênese mitocondrial, dependente de óxido nítrico (NO•), sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Um dos indutores fisiológicos mais potentes da eNOS é a insulina, cujos níveis plasmáticos são consideravelmente reduzidos nos organismos em RC. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos associados ao aumento da sinalização por NO• durante a RC in vivo e in vitro, e as conseqüências celulares do aumento de massa mitocondrial no que diz respeito à longevidade e capacidade respiratória celulares. Submetemos camundongos Swiss fêmeas à RC de 40% e observamos um considerável aumento tecido-específico na fosforilação basal de Akt e eNOS em músculo esquelético, tecido adiposo visceral e cérebro, os quais também apresentaram maior massa mitocondrial. A associação entre a sinalização por insulina, NO• e biogênese mitocondrial foi adicionalmente confirmada em um grupo de camundongos tratados com o desacoplador mitocondrial dinitrofenol (DNP), que também reduz a insulinemia e aumenta a longevidade em camundongos. Para o estudo mecanístico deste fenômeno, usamos soros de ratos Sprague-Dawley submetidos à RC de 40% ou alimentados ad libitum (AL) em cultura celular de células vasculares da musculatura lisa (VSMC), reproduzindo um protocolo descrito para RC in vitro. O uso do soro RC aumentou a fosforilação do receptor de insulina e Akt, a expressão de eNOS e nNOS (forma neural da NOS) e a fosforilação de eNOS, o que se refletiu em maior liberação de nitrito (NO2) no meio de cultura. Inibindo-se a Akt, todos os efeitos promovidos pela RC na sinalização por NO• foram revertidos. Ao se imunoprecipitar do soro a adiponectina, citocina conhecida por aumentar a sensibilidade à insulina, aumentada durante a RC, os efeitos do soro RC na via de sinalização de insulina foram abolidos e, conseqüentemente, os efeitos na sinalização por •NO foram prevenidos. Neurônios de células granulosas de cerebelo, que não expressam eNOS, apenas nNOS, foram cultivados com os soros AL ou RC, e também apresentaram considerável aumento na sinalização por •NO. Estas alterações induziram a biogênese mitocondrial e capacidade respiratória, e foram associadas à maior longevidade celular. Os mesmos efeitos mitocondriais foram observados em células secretoras de insulina, INS1, entretanto a secreção de insulina em resposta à glicose tornou-se inibida, por um mecanismo desconhecido, porém associado a reduzidos níveis intracelulares de espécies oxidantes, moléculas-chave para a secreção de insulina; e à alteração da morfologia mitocondrial, provavelmente devido à maior expressão de mitofusina-2 (Mfn-2). Ao se nocautear a Mfn-2, houve um aumento na geração de EROs e as células em RC passaram a secretar insulina a níveis comparáveis aos das células controle. Concluímos que durante a RC a maior sensibilidade à insulina aumenta a atividade de eNOS, via Akt, associada à maior biogênese mitocondrial. A adiponectina é uma molécula-central nestes eventos. A expressão de nNOS também é afetada, por mecanismos desconhecidos. O aumento de biogênese mitocondrial eleva a capacidade respiratória celular e impacta positivamente a longevidade in vitro. A alteração da morfologia mitocondrial associa-se a alterações na produção de oxidantes intracelulares e mudanças na secreção de insulina. / Calorie restriction (RC) is known to extend the lifespan in many organisms, and its mechanisms of action are still under investigation. Enhanced mitochondrial biogenesis driven by nitric oxide (•NO), synthesized by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is proposed to be a CR central effect. Insulin is one of the most potent physiological activators of eNOS. However, plasmatic insulin levels are dramatically reduced in organisms under CR. The goal of this work was uncover the mechanisms associated with enhanced •NO signaling during CR, in vivo and in vitro, as well as the cellular consequences of increased mitochondrial mass, regarding lifespan and reserve respiratory capability. Female Swiss mice were submitted to 40% of CR. A tissue-specific (skeletal muscle, abdominal adipose tissue and brain) increment in basal Akt and eNOS phosphorylation, which was related to enhanced mitochondrial biogenesis, was observed. Indeed, this association was also verified in tissues from mice treated with low doses of a mitochondrial uncoupler, dinitrophenol (DNP). To unveil the mechanism behind the insulin signaling effects on •NO levels, serum from Sprague-Dawley rats submmited to 40% of CR was used to culture in VSMC cells, an in vitro CR protocol. CR sera enhanced insulin receptor (IR) and Akt phosphorylation, as well as nitrite (NO2-) accumulation in the culture media, the expression of eNOS and nNOS (neural NOS isoform) and eNOS phosphorylation. The effects of CR sera were reversed by Akt inhibition. The immunoprecipitation of serum adiponectin, a cytokine known to improve peripheral insulin sensitivity, also reversed the CR serum effects on insulin and •NO signaling. Cerebellar neurons, which do not express eNOS, just nNOS, were also cultured with CR or AL serum and also presented striking increments in •NO signaling, associated with mitochondrial biogenesis, increased reserve respiratory capability and lifespan extension. The mitochondrial effects promoted by CR were also observed in insulin secreting cells (INS1). However, under the CR condition, insulin secretion stimulated by glucose was impaired. The likely explanations are reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, or the alteration in mitochondrial morphology, associated, in our model, with enhanced mitofusin-2 expression (Mfn-2). In cells which the Mfn-2 was knocked down, insulin secretion in CR and AL groups was responsive to glucose at the same level, and the intracellular oxidants levels were much higher. Overall, CR improves •NO signaling due to enhanced insulin sensitivity, through Akt, and results in mitochondrial biogenesis. Adiponectin is a key molecule in this phenomenon. Increments in mitochondrial mass enhance the cellular reserve respiratory capability and lifespan. Mitochondrial morphology alterations are associated with possible decreases in ROS generation and impaired insulin release, maintained the low levels of plasmatic insulin.

A restrição calórica (RC) estende a expectativa de vida de muitos organismos por mecanismos ainda em estudo. Entre os vários efeitos fisiológicos da RC encontra-se o aumento na biogênese mitocondrial, dependente de óxido nítrico (NO•), sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Um dos indutores fisiológicos mais potentes da eNOS é a insulina, cujos níveis plasmáticos são consideravelmente reduzidos nos organismos em RC. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos associados ao aumento da sinalização por NO• durante a RC in vivo e in vitro, e as conseqüências celulares do aumento de massa mitocondrial no que diz respeito à longevidade e capacidade respiratória celulares. Submetemos camundongos Swiss fêmeas à RC de 40% e observamos um considerável aumento tecido-específico na fosforilação basal de Akt e eNOS em músculo esquelético, tecido adiposo visceral e cérebro, os quais também apresentaram maior massa mitocondrial. A associação entre a sinalização por insulina, NO• e biogênese mitocondrial foi adicionalmente confirmada em um grupo de camundongos tratados com o desacoplador mitocondrial dinitrofenol (DNP), que também reduz a insulinemia e aumenta a longevidade em camundongos. Para o estudo mecanístico deste fenômeno, usamos soros de ratos Sprague-Dawley submetidos à RC de 40% ou alimentados ad libitum (AL) em cultura celular de células vasculares da musculatura lisa (VSMC), reproduzindo um protocolo descrito para RC in vitro. O uso do soro RC aumentou a fosforilação do receptor de insulina e Akt, a expressão de eNOS e nNOS (forma neural da NOS) e a fosforilação de eNOS, o que se refletiu em maior liberação de nitrito (NO2) no meio de cultura. Inibindo-se a Akt, todos os efeitos promovidos pela RC na sinalização por NO• foram revertidos. Ao se imunoprecipitar do soro a adiponectina, citocina conhecida por aumentar a sensibilidade à insulina, aumentada durante a RC, os efeitos do soro RC na via de sinalização de insulina foram abolidos e, conseqüentemente, os efeitos na sinalização por •NO foram prevenidos. Neurônios de células granulosas de cerebelo, que não expressam eNOS, apenas nNOS, foram cultivados com os soros AL ou RC, e também apresentaram considerável aumento na sinalização por •NO. Estas alterações induziram a biogênese mitocondrial e capacidade respiratória, e foram associadas à maior longevidade celular. Os mesmos efeitos mitocondriais foram observados em células secretoras de insulina, INS1, entretanto a secreção de insulina em resposta à glicose tornou-se inibida, por um mecanismo desconhecido, porém associado a reduzidos níveis intracelulares de espécies oxidantes, moléculas-chave para a secreção de insulina; e à alteração da morfologia mitocondrial, provavelmente devido à maior expressão de mitofusina-2 (Mfn-2). Ao se nocautear a Mfn-2, houve um aumento na geração de EROs e as células em RC passaram a secretar insulina a níveis comparáveis aos das células controle. Concluímos que durante a RC a maior sensibilidade à insulina aumenta a atividade de eNOS, via Akt, associada à maior biogênese mitocondrial. A adiponectina é uma molécula-central nestes eventos. A expressão de nNOS também é afetada, por mecanismos desconhecidos. O aumento de biogênese mitocondrial eleva a capacidade respiratória celular e impacta positivamente a longevidade in vitro. A alteração da morfologia mitocondrial associa-se a alterações na produção de oxidantes intracelulares e mudanças na secreção de insulina. / Calorie restriction (RC) is known to extend the lifespan in many organisms, and its mechanisms of action are still under investigation. Enhanced mitochondrial biogenesis driven by nitric oxide (•NO), synthesized by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is proposed to be a CR central effect. Insulin is one of the most potent physiological activators of eNOS. However, plasmatic insulin levels are dramatically reduced in organisms under CR. The goal of this work was uncover the mechanisms associated with enhanced •NO signaling during CR, in vivo and in vitro, as well as the cellular consequences of increased mitochondrial mass, regarding lifespan and reserve respiratory capability. Female Swiss mice were submitted to 40% of CR. A tissue-specific (skeletal muscle, abdominal adipose tissue and brain) increment in basal Akt and eNOS phosphorylation, which was related to enhanced mitochondrial biogenesis, was observed. Indeed, this association was also verified in tissues from mice treated with low doses of a mitochondrial uncoupler, dinitrophenol (DNP). To unveil the mechanism behind the insulin signaling effects on •NO levels, serum from Sprague-Dawley rats submmited to 40% of CR was used to culture in VSMC cells, an in vitro CR protocol. CR sera enhanced insulin receptor (IR) and Akt phosphorylation, as well as nitrite (NO2-) accumulation in the culture media, the expression of eNOS and nNOS (neural NOS isoform) and eNOS phosphorylation. The effects of CR sera were reversed by Akt inhibition. The immunoprecipitation of serum adiponectin, a cytokine known to improve peripheral insulin sensitivity, also reversed the CR serum effects on insulin and •NO signaling. Cerebellar neurons, which do not express eNOS, just nNOS, were also cultured with CR or AL serum and also presented striking increments in •NO signaling, associated with mitochondrial biogenesis, increased reserve respiratory capability and lifespan extension. The mitochondrial effects promoted by CR were also observed in insulin secreting cells (INS1). However, under the CR condition, insulin secretion stimulated by glucose was impaired. The likely explanations are reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, or the alteration in mitochondrial morphology, associated, in our model, with enhanced mitofusin-2 expression (Mfn-2). In cells which the Mfn-2 was knocked down, insulin secretion in CR and AL groups was responsive to glucose at the same level, and the intracellular oxidants levels were much higher. Overall, CR improves •NO signaling due to enhanced insulin sensitivity, through Akt, and results in mitochondrial biogenesis. Adiponectin is a key molecule in this phenomenon. Increments in mitochondrial mass enhance the cellular reserve respiratory capability and lifespan. Mitochondrial morphology alterations are associated with possible decreases in ROS generation and impaired insulin release, maintained the low levels of plasmatic insulin.

Les mitochondries sont des organites dynamiques dont la morphologie dépend de l’équilibre fusion/fission de leurs membranes. Ce processus essentiel à la survie cellulaire est nommé dynamique mitochondriale et sa dérégulation est associée à des troubles neurologiques. Cependant les mécanismes précis régissant la dynamique mitochondriale ne sont pas élucidés. Cette thèse porte sur la protéine Fzo1p, une grande GTPase de la superfamille des Dynamin-related-Protein. C’est un élément clé impliqué dans la fusion mitochondriale de la membrane externe de la levure. Sa structure et sa dynamique ont été étudiées par modélisation et simulations de dynamiques moléculaires tout-atome dans une bicouche lipidique solvatée. Le modèle structural obtenu tient compte de données expérimentales, de template structuraux, et de modèles ab initio du domaine transmembranaire de Fzo1p. Ce modèle a été validé expérimentalement par mutagenèse dirigée. Des permutations de charges ont confirmé des ponts salins à longue distance prédits dans le modèle. En outre, des mutations ont montré que les domaines coiled-coil de Fzo1p, contrairement à sa partie N-terminale, sont indispensables à sa fonction. L’ensemble des résultats expérimentaux et in silico met en évidence l’implication des domaines charnières dans le changement conformationnel de Fzo1p, ainsi que des résidus critiques affectant sa stabilité. Les précisions atomiques obtenues sur l’interaction de Fzo1p avec le GDP permet de formuler des hypothèses sur le mécanisme moléculaire de la catalyse du GTP pour la fusion membranaire; voire à la compréhension de la dynamique mitochondriale. / Mitochondria are dynamic organelles whose morphology is determined by fusion and fission of their membranes. This essential process is known as mitochondrial dynamics. Defects in mitochondrial dynamics are associated with neurological disorders making the investigation of physiological relevance. However, the precise sequence of events that lead mitochondrial dynamics are still not well characterised. Fzo1p, a large GTPase of the Dynamin-Related Proteins superfamily, is a key component in mitochondrial outer membrane fusion in yeast. During this PhD project I built a model of the protein Fzo1p. The structure and dynamics of the model was investigated through molecular modelling and all-atom molecular dynamics simulation in a fully hydrated lipid bilayer environment. The Fzo1p structural model integrates information from several template structures, experimental knowledge, as well as ab initio models of the transmembrane segments. The model is validated experimentally through directed mutagenesis, for instance charge-swap mutations confirm predicted long-distance salt bridges. A series of mutants indicate that coiled-coil domains are required for protein function at variance with its N-terminal region. Overall, the experimental and in silico approaches pinpoint the hinge domains involved in the putative conformational change and identifies critical residues affecting protein stability. Finally, key Fzo1p-GDP interactions provide insights about the molecular mechanism of membrane fusion catalysis. The model provides insight on atomic level and proposes a structure that will be instructional to understanding mitochondrial membrane fusion.