Els mitocondris són orgànuls citoplasmàtics que tenen un paper fonamental en múltiples processos biològics com l’oxidació de substrats i la producció d’ATP, la senyalització cel•lular, l’apoptosi, el control del cicle cel•lular i l’homeòstasi del calci. Els mitocondris són orgànuls dinàmics, que pateixen canvis de morfologia regulats per processos de fusió i de fissió. Existeix un equilibri entre ambdós processos que és indispensable per a la correcta funció mitocondrial. Les proteïnes que participen directament en la fusió mitocondrial en mamífers són les mitofusines (Mfn1 i Mfn2), localitzades a la membrana mitocondrial externa i OPA1, situada a la membrana mitocondrial interna. Diferents estudis han demostrat que la proteïna Mfn2, a més de promoure la fusió dels mitocondris, també està implicada en la interacció entre els mitocondris i el reticle endoplasmàtic i que participa en la regulació del cicle cel•lular i del metabolisme mitocondrial. Per altra banda, l’expressió de Mfn2 es troba disminuïda en múscul esquelètic en situacions de resistència a la insulina, com l’obesitat o la diabetis de tipus 2, que a la vegada es caracteritzen per una alterada activitat mitocondrial. En base a aquestes observacions, l’objectiu principal de la present tesi doctoral ha estat estudiar els efectes de la modulació de l’expressió de Mfn2 sobre el metabolisme i la bioenergètica mitocondrial en múscul esquelètic. Amb aquest propòsit hem expressat una forma truncada de Mfn2 (hMfn2Δ614-757) o bé hem reprimit l’expressió de Mfn2 endògena en el model cel•lular C2C12 i en múscul esquelètic de ratolí. Per dur a terme aquest objectiu hem generat 3 models de ratolí diferents: el model d’expressió transitòria de la forma hMfn2Δ614-757; el model de repressió transitòria de Mfn2 i el ratolí knockdown de Mfn2. Els dos primers models han estat generats mitjançant la tècnica de l’electrotransferència d’ADN en múscul esquelètic. La sobreexpressió de la forma hMfn2Δ614-757 en cèl•lules C2C12 diferenciades incrementa el consum d’oxigen mitocondrial en situació basal i també en desacoblar la cadena de transport d’electrons de la síntesi d’ATP, suggerint una major capacitat respiratòria dels miotubs que expressen la hMfn2Δ614-757. En múscul esquelètic de ratolí, l’expressió d’aquesta forma de Mfn2 causa una estimulació de la taxa d’oxidació de glucosa així com un increment de la Respiratory Control Ratio (RCR). La inducció del metabolisme mitocondrial observada en sobreexpressar la forma hMfn2Δ614-757 no és deguda a un augment de la massa mitocondrial, sinó a un increment en l’expressió i l’activitat d’alguns dels complexes de la cadena respiratòria mitocondrial. La repressió de Mfn2 en miotubs C2C12 produeix un increment en la respiració no associada a la producció d’ATP o proton leak i una disminució en el potencial de membrana mitocondrial. Aquests resultats indiquen que la repressió de Mfn2 provoca el desacoblament de la cadena de transport d’electrons i la síntesi d’ATP, suggerint una disminució de l’eficiència de la fosforilació oxidativa. Els músculs dels ratolins knockdown de Mfn2 presenten una reducció de la taxa d’oxidació de glucosa i de la Respiratory Control Ratio. A més, la repressió de Mfn2 disminueix l’activitat del complex IV de la cadena respiratòria. En conjunt aquests resultats suggereixen que la disminució de l’expressió de Mfn2 origina una disfunció del sistema de transport electrònic mitocondrial. També cal remarcar que els ratolins knockdown de Mfn2 presenten una major susceptibilitat a desenvolupar resistència a la insulina en resposta a l’envelliment o a una dieta rica en greixos. La disfunció mitocondrial i l’augment en la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS) observats en el múscul esquelètic d’aquests ratolins podrien explicar aquesta major susceptibilitat. / Mitochondria are cellular organelles that play a fundamental role in many cellular functions, such as substrates oxidation, ATP production, apoptosis and calcium economy. Mitochondria are dynamic organelles that can fuse and divide; the balance between both processes is crucial for a correct mitochondrial function. The most relevant proteins described to date involved in the regulation of mitochondrial fusion are mitofusins 1 and 2 (Mfn1 and Mfn2, respectively) and OPA1. Substantial data indicates that Mfn2 is also a key regulator of cell cycle and mitochondrial metabolism. On the other hand, Mfn2 expression is reduced in skeletal muscle of obese subjects and type 2 diabetic patients, situations characterized by altered mitochondrial activity. Based on these observations, the main objective of this thesis was the study of the metabolic role of Mfn2 in skeletal muscle. We have studied the metabolic effects caused by the manipulation of Mfn2 expression in mice skeletal muscle in vivo. By means of DNA electrotransfer technologies, we have expressed a truncated Mfn2 mutant in skeletal muscle and we have also repressed endogenous Mfn2 expression with microRNAs. We have also generated a skeletal muscle Mfn2 knockout mouse model (Mfn2 KO). The expression of truncated Mfn2 mutant in tibialis stimulated glucose oxidation and increased the Respiratory Control Ratio (RCR). It also increased the expression of subunits Cox4 of OXPHOS complex IV and Atp5a1 of complex V. We observed these metabolic effects in absence of changes in mitochondrial content. The repression of Mfn2 in mice skeletal muscle caused a marked reduction in the expression of subunit Cox4 of OXPHOS complex IV, accompanied with a 20% of decrease in COX activity. In this case we neither observed differences in mitochondrial content. Skeletal muscle from Mfn2 KO mice showed a decrease in glucose oxidation and in the RCR. In addition, Mfn2 KO mice showed a higher susceptibility to develop insulin resistance in response to aging or a high fat diet. Mitochondrial dysfunction and the increased ROS production observed in skeletal muscle of these mice could explain this higher susceptibility.

A restrição calórica (RC) estende a expectativa de vida de muitos organismos por mecanismos ainda em estudo. Entre os vários efeitos fisiológicos da RC encontra-se o aumento na biogênese mitocondrial, dependente de óxido nítrico (NO•), sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Um dos indutores fisiológicos mais potentes da eNOS é a insulina, cujos níveis plasmáticos são consideravelmente reduzidos nos organismos em RC. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos associados ao aumento da sinalização por NO• durante a RC in vivo e in vitro, e as conseqüências celulares do aumento de massa mitocondrial no que diz respeito à longevidade e capacidade respiratória celulares. Submetemos camundongos Swiss fêmeas à RC de 40% e observamos um considerável aumento tecido-específico na fosforilação basal de Akt e eNOS em músculo esquelético, tecido adiposo visceral e cérebro, os quais também apresentaram maior massa mitocondrial. A associação entre a sinalização por insulina, NO• e biogênese mitocondrial foi adicionalmente confirmada em um grupo de camundongos tratados com o desacoplador mitocondrial dinitrofenol (DNP), que também reduz a insulinemia e aumenta a longevidade em camundongos. Para o estudo mecanístico deste fenômeno, usamos soros de ratos Sprague-Dawley submetidos à RC de 40% ou alimentados ad libitum (AL) em cultura celular de células vasculares da musculatura lisa (VSMC), reproduzindo um protocolo descrito para RC in vitro. O uso do soro RC aumentou a fosforilação do receptor de insulina e Akt, a expressão de eNOS e nNOS (forma neural da NOS) e a fosforilação de eNOS, o que se refletiu em maior liberação de nitrito (NO2) no meio de cultura. Inibindo-se a Akt, todos os efeitos promovidos pela RC na sinalização por NO• foram revertidos. Ao se imunoprecipitar do soro a adiponectina, citocina conhecida por aumentar a sensibilidade à insulina, aumentada durante a RC, os efeitos do soro RC na via de sinalização de insulina foram abolidos e, conseqüentemente, os efeitos na sinalização por •NO foram prevenidos. Neurônios de células granulosas de cerebelo, que não expressam eNOS, apenas nNOS, foram cultivados com os soros AL ou RC, e também apresentaram considerável aumento na sinalização por •NO. Estas alterações induziram a biogênese mitocondrial e capacidade respiratória, e foram associadas à maior longevidade celular. Os mesmos efeitos mitocondriais foram observados em células secretoras de insulina, INS1, entretanto a secreção de insulina em resposta à glicose tornou-se inibida, por um mecanismo desconhecido, porém associado a reduzidos níveis intracelulares de espécies oxidantes, moléculas-chave para a secreção de insulina; e à alteração da morfologia mitocondrial, provavelmente devido à maior expressão de mitofusina-2 (Mfn-2). Ao se nocautear a Mfn-2, houve um aumento na geração de EROs e as células em RC passaram a secretar insulina a níveis comparáveis aos das células controle. Concluímos que durante a RC a maior sensibilidade à insulina aumenta a atividade de eNOS, via Akt, associada à maior biogênese mitocondrial. A adiponectina é uma molécula-central nestes eventos. A expressão de nNOS também é afetada, por mecanismos desconhecidos. O aumento de biogênese mitocondrial eleva a capacidade respiratória celular e impacta positivamente a longevidade in vitro. A alteração da morfologia mitocondrial associa-se a alterações na produção de oxidantes intracelulares e mudanças na secreção de insulina. / Calorie restriction (RC) is known to extend the lifespan in many organisms, and its mechanisms of action are still under investigation. Enhanced mitochondrial biogenesis driven by nitric oxide (•NO), synthesized by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is proposed to be a CR central effect. Insulin is one of the most potent physiological activators of eNOS. However, plasmatic insulin levels are dramatically reduced in organisms under CR. The goal of this work was uncover the mechanisms associated with enhanced •NO signaling during CR, in vivo and in vitro, as well as the cellular consequences of increased mitochondrial mass, regarding lifespan and reserve respiratory capability. Female Swiss mice were submitted to 40% of CR. A tissue-specific (skeletal muscle, abdominal adipose tissue and brain) increment in basal Akt and eNOS phosphorylation, which was related to enhanced mitochondrial biogenesis, was observed. Indeed, this association was also verified in tissues from mice treated with low doses of a mitochondrial uncoupler, dinitrophenol (DNP). To unveil the mechanism behind the insulin signaling effects on •NO levels, serum from Sprague-Dawley rats submmited to 40% of CR was used to culture in VSMC cells, an in vitro CR protocol. CR sera enhanced insulin receptor (IR) and Akt phosphorylation, as well as nitrite (NO2-) accumulation in the culture media, the expression of eNOS and nNOS (neural NOS isoform) and eNOS phosphorylation. The effects of CR sera were reversed by Akt inhibition. The immunoprecipitation of serum adiponectin, a cytokine known to improve peripheral insulin sensitivity, also reversed the CR serum effects on insulin and •NO signaling. Cerebellar neurons, which do not express eNOS, just nNOS, were also cultured with CR or AL serum and also presented striking increments in •NO signaling, associated with mitochondrial biogenesis, increased reserve respiratory capability and lifespan extension. The mitochondrial effects promoted by CR were also observed in insulin secreting cells (INS1). However, under the CR condition, insulin secretion stimulated by glucose was impaired. The likely explanations are reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, or the alteration in mitochondrial morphology, associated, in our model, with enhanced mitofusin-2 expression (Mfn-2). In cells which the Mfn-2 was knocked down, insulin secretion in CR and AL groups was responsive to glucose at the same level, and the intracellular oxidants levels were much higher. Overall, CR improves •NO signaling due to enhanced insulin sensitivity, through Akt, and results in mitochondrial biogenesis. Adiponectin is a key molecule in this phenomenon. Increments in mitochondrial mass enhance the cellular reserve respiratory capability and lifespan. Mitochondrial morphology alterations are associated with possible decreases in ROS generation and impaired insulin release, maintained the low levels of plasmatic insulin.

A restrição calórica (RC) estende a expectativa de vida de muitos organismos por mecanismos ainda em estudo. Entre os vários efeitos fisiológicos da RC encontra-se o aumento na biogênese mitocondrial, dependente de óxido nítrico (NO•), sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Um dos indutores fisiológicos mais potentes da eNOS é a insulina, cujos níveis plasmáticos são consideravelmente reduzidos nos organismos em RC. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos associados ao aumento da sinalização por NO• durante a RC in vivo e in vitro, e as conseqüências celulares do aumento de massa mitocondrial no que diz respeito à longevidade e capacidade respiratória celulares. Submetemos camundongos Swiss fêmeas à RC de 40% e observamos um considerável aumento tecido-específico na fosforilação basal de Akt e eNOS em músculo esquelético, tecido adiposo visceral e cérebro, os quais também apresentaram maior massa mitocondrial. A associação entre a sinalização por insulina, NO• e biogênese mitocondrial foi adicionalmente confirmada em um grupo de camundongos tratados com o desacoplador mitocondrial dinitrofenol (DNP), que também reduz a insulinemia e aumenta a longevidade em camundongos. Para o estudo mecanístico deste fenômeno, usamos soros de ratos Sprague-Dawley submetidos à RC de 40% ou alimentados ad libitum (AL) em cultura celular de células vasculares da musculatura lisa (VSMC), reproduzindo um protocolo descrito para RC in vitro. O uso do soro RC aumentou a fosforilação do receptor de insulina e Akt, a expressão de eNOS e nNOS (forma neural da NOS) e a fosforilação de eNOS, o que se refletiu em maior liberação de nitrito (NO2) no meio de cultura. Inibindo-se a Akt, todos os efeitos promovidos pela RC na sinalização por NO• foram revertidos. Ao se imunoprecipitar do soro a adiponectina, citocina conhecida por aumentar a sensibilidade à insulina, aumentada durante a RC, os efeitos do soro RC na via de sinalização de insulina foram abolidos e, conseqüentemente, os efeitos na sinalização por •NO foram prevenidos. Neurônios de células granulosas de cerebelo, que não expressam eNOS, apenas nNOS, foram cultivados com os soros AL ou RC, e também apresentaram considerável aumento na sinalização por •NO. Estas alterações induziram a biogênese mitocondrial e capacidade respiratória, e foram associadas à maior longevidade celular. Os mesmos efeitos mitocondriais foram observados em células secretoras de insulina, INS1, entretanto a secreção de insulina em resposta à glicose tornou-se inibida, por um mecanismo desconhecido, porém associado a reduzidos níveis intracelulares de espécies oxidantes, moléculas-chave para a secreção de insulina; e à alteração da morfologia mitocondrial, provavelmente devido à maior expressão de mitofusina-2 (Mfn-2). Ao se nocautear a Mfn-2, houve um aumento na geração de EROs e as células em RC passaram a secretar insulina a níveis comparáveis aos das células controle. Concluímos que durante a RC a maior sensibilidade à insulina aumenta a atividade de eNOS, via Akt, associada à maior biogênese mitocondrial. A adiponectina é uma molécula-central nestes eventos. A expressão de nNOS também é afetada, por mecanismos desconhecidos. O aumento de biogênese mitocondrial eleva a capacidade respiratória celular e impacta positivamente a longevidade in vitro. A alteração da morfologia mitocondrial associa-se a alterações na produção de oxidantes intracelulares e mudanças na secreção de insulina. / Calorie restriction (RC) is known to extend the lifespan in many organisms, and its mechanisms of action are still under investigation. Enhanced mitochondrial biogenesis driven by nitric oxide (•NO), synthesized by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is proposed to be a CR central effect. Insulin is one of the most potent physiological activators of eNOS. However, plasmatic insulin levels are dramatically reduced in organisms under CR. The goal of this work was uncover the mechanisms associated with enhanced •NO signaling during CR, in vivo and in vitro, as well as the cellular consequences of increased mitochondrial mass, regarding lifespan and reserve respiratory capability. Female Swiss mice were submitted to 40% of CR. A tissue-specific (skeletal muscle, abdominal adipose tissue and brain) increment in basal Akt and eNOS phosphorylation, which was related to enhanced mitochondrial biogenesis, was observed. Indeed, this association was also verified in tissues from mice treated with low doses of a mitochondrial uncoupler, dinitrophenol (DNP). To unveil the mechanism behind the insulin signaling effects on •NO levels, serum from Sprague-Dawley rats submmited to 40% of CR was used to culture in VSMC cells, an in vitro CR protocol. CR sera enhanced insulin receptor (IR) and Akt phosphorylation, as well as nitrite (NO2-) accumulation in the culture media, the expression of eNOS and nNOS (neural NOS isoform) and eNOS phosphorylation. The effects of CR sera were reversed by Akt inhibition. The immunoprecipitation of serum adiponectin, a cytokine known to improve peripheral insulin sensitivity, also reversed the CR serum effects on insulin and •NO signaling. Cerebellar neurons, which do not express eNOS, just nNOS, were also cultured with CR or AL serum and also presented striking increments in •NO signaling, associated with mitochondrial biogenesis, increased reserve respiratory capability and lifespan extension. The mitochondrial effects promoted by CR were also observed in insulin secreting cells (INS1). However, under the CR condition, insulin secretion stimulated by glucose was impaired. The likely explanations are reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation, or the alteration in mitochondrial morphology, associated, in our model, with enhanced mitofusin-2 expression (Mfn-2). In cells which the Mfn-2 was knocked down, insulin secretion in CR and AL groups was responsive to glucose at the same level, and the intracellular oxidants levels were much higher. Overall, CR improves •NO signaling due to enhanced insulin sensitivity, through Akt, and results in mitochondrial biogenesis. Adiponectin is a key molecule in this phenomenon. Increments in mitochondrial mass enhance the cellular reserve respiratory capability and lifespan. Mitochondrial morphology alterations are associated with possible decreases in ROS generation and impaired insulin release, maintained the low levels of plasmatic insulin.