La thèse présentée est centrée sur des mesures de force appliquées à des ARN seuls ou en interaction avec une protéine. L'un des plus grands défis posé par l'ARN provient de sa structure, notamment parce que les interactions de ses bases ne se limitent pas aux paires de type Watson-Crick et que les interactions tertiaires sont courantes. Les mesures de force donnent des informations complémentaires aux mesures classiques, car elles permettent de sonder directement les interactions complexes de l'ARN et fournissent des paramètres thermodynamiques inaccessibles autrement. L'étude de l'interaction protéine-ARN par mesure de force permet également d'accéder à des caractéristiques que les autres techniques ne peuvent pas offrir. Néanmoins avant d'atteindre les promesses de ce type de mesure, il faut concevoir un montage adapté et optimisé. Une première partie de la thèse a été dédiée à la conception d'une double pince optique permettant l'étude des ARN avec une résolution proche de la paire de base, en implantant notamment des améliorations techniques jusque là absentes de la littérature. La suite de la thèse s'est attachée à des études biologiques. Nous avons commencé par sonder l'interaction de la protéine ribosomique L20 avec son ARN cible dans le ribosome. Nous avons montré que cette protéine très importante dans les premiers stades de la formation du ribosome, stabilise fortement son ARN cible. Nous avons également déterminé son site de fixation à trois bases près. Nous avons ensuite débuté une étude sur des ARN synthétisés pour l'étude d'une hélicase à motif DEAD en caractérisant leurs réponses à une sollicitation mécanique.

Streptococcus pyogenes (group A streptococcus, GAS) is a major human Gram-positive pathogen that causes infections that normally occur in the respiratory tract, the skin, the wound, the lung, the bloodstream and/or muscle tissues and result in millions of deaths every year. To cause such infections, S. pyogenes produces a wide range of virulence factors. The destruction of connective tissue and the hyaluronic acid therein plays an important role in pathogenesis. S. pyogenes was propagated in hyaluronic acid rich growth media in an attempt to create a simple biological system that could reflect some elements of the pathogenesis. The growth of bacteria was analyzed in the hyaluronic acid rich media and control media and a proteomic approach was applied to identify those proteins that were differentially expressed by the streptococcal pathogens growing in the different media. The techniques of two dimensional gel electrophoresis and static nanospray mass spectrometry were optimized and proteome maps for S. pyogenes grown in both media were constructed. The differentially expressed proteins by S. pyogenes were identified and analyzed using bioinformatics. Our results showed that several recognized virulence factors of S. pyogenes were upregulated in hyaluronic acid rich media, including the Ml protein, a collagen-like surface protein and the glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, which has been shown to play important roles in streptococcal pathogenesis. Interestingly, two hypothetical proteins of unknown function were also up-regulated and detailed bioinformatics analysis showed that at least one of these hypothetical proteins is likely to be involved in GAS pathogenesis. It was therefore concluded that this simple biological system provided a valuable tool for the identification of potential streptococcal pathogens virulence factors.

Le détournement de la machinerie cellulaire par un pathogène est souvent essentiel à sa propagation dans l'organisme de l'hôte. Les voies de signalisation qui contrôlent l'homéostasie cellulaire constituent une cible stratégique de nombreux virus lors d'une infection. Le virus de la rage possède la particularité d'induire la survie des neurones qu'il infecte. Le site de fixation à des domaines PDZ (PDZ-BS) de la glycoprotéine du virus de la rage a été identifié comme étant un élément clef dans le contrôle des voies de survie et d'apoptose. Ce PDZ-BS reconnaît uniquement deux isoformes de la famille des " Microtubule Associated Serine/Threonine kinase " (MAST1 et MAST2). La kinase MAST2 possède une fonction inhibitrice de survie en contrôlant l'élongation des neurites et interagit, par ailleurs, avec le PDZ-BS de la phosphatase PTEN, autre inhibiteur essentiel de la survie neuronale. Nous avons montré in vitro que les domaines C-terminaux de PTEN (PTEN13-Cter) et de la glycoprotéine (Cyto13-vir) entrent en compétition pour la fixation domaine PDZ de MAST2. La résolution de la structure du domaine PDZ de MAST2 et PTEN13-Cter, son ligand endogène, révèle un mode d'interaction original avec une large surface d'interaction. Ce réseau d'interaction est conservé dans la structure du domaine PDZ de MAST2 complexé au ligand viral Cyto13-vir. En parallèle, nous avons démontré que le PDZ-BS de la glycoprotéine est nécessaire pour induire la survie des cellules infectées et qu'il module la distribution spatiale de PTEN in cellulo. Cette localisation est dépendante de la phosphorylation de PTEN-Cter.

Due to the inherent problems with their structural elucidation in the laboratory, the computational prediction of membrane protein structure is an essential step toward understanding the function of these leading targets for drug discovery. In this work, the development of a genetic algorithm technique is described that is able to generate predictive 3D structures of membrane proteins in an ab initio fashion that possess high stability and similarity to the native structure. This is accomplished through optimisation of the distances between TM regions and the end-on rotation of each TM helix. The starting point for the genetic algorithm is from the model of general TM region arrangement predicted using the TMRelate program. From these approximate starting coordinates, the TMBuilder program is used to generate the helical backbone 3D coordinates. The amino acid side chains are constructed using the MaxSprout algorithm. The genetic algorithm is designed to represent a TM protein structure by encoding each alpha carbon atom starting position, the starting atom of the initial residue of each helix, and operates by manipulating these starting positions. To evaluate each predicted structure, the SwissPDBViewer software (incorporating the GROMOS force field software) is employed to calculate the free potential energy. For the first time, a GA has been successfully applied to the problem of predicting membrane protein structure. Comparison between newly predicted structures (tests) and the native structure (control) indicate that the developed GA approach represents an efficient and fast method for refinement of predicted TM protein structures. Further enhancement of the performance of the GA allows the TMGA system to generate predictive structures with comparable energetic stability and reasonable structural similarity to the native structure.

This thesis describes the development of a computer controlled on-line system for fermentation monitoring and control. The entire system consists of a laboratory fermenter, flow injection system (four channels), a newly designed on-line filter, biomass analysis channel, pH and oxygen controllers as well as a spectrophotometer. A new design of gas driven flow injection analysis (FIA) allows a large number of reagents to be handled. The computer-controlled four channel PIA system is well suited for sequential analysis, which is important for fermentation on-line mOnitoring. The system can change the wavelength of the spectrophotometer automatically for each PIA channel, which makes the system powerful and flexible. A high frequency, low energy ultrasonic filter was modified and applied to the system for on-line mammalian cell culture sampling without breaking the sterile barrier. The results show that this novel application of ultrasonic filter technology results in higher efficiency and reliability and a longer life cycle than other types of filter. All the operations of the analytical system are controlled by a Macintosh computer (Quadra 950). The control program was written in LabVIEW which is a graphical programming language and well applicable to fermentation control. The software communicates with detectors, data acquisition, data analysis and presentation. The system can programmatically control up to 50 devices. Mammalian cell batch culture was used as an example of the application of the system. The system consists of a laboratory fermenter with a continuous sample withdrawal filter and an analysis system where glucose, lactate and ammonia, lactate dehydrogenase and biomass were measured. Cell viability was estimated by microscopic assay with trypan blue. pH and Oxygen were also measured. The system response was fast and yields a large number of reliable and precise analytical results which can be of great importance in the monitoring and control of mammalian cell culture conditions.

The aim of this work was to establish an analytical method for the simultaneous detection of five major opium alkaloids in poppy seeds by liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry (LC-ESI-MS). Once opium alkaloids were detected in poppy seeds, toxicological studies were carried out to establish if these compounds were detected in oral fluid (OF) of participants who ingested muffins containing poppy seeds. It is known that the ingestion of poppy seeds has caused positive opiate drug test results and much work has been reported in the scientific literature in the last 20 years. Researchers in the field have investigated alternatives to differentiate between heroin administration and that of other opiate drugs versus poppy seed ingestion. Most of the work which has been carried out relates to establishing illicit heroin use by examining biological matrices for the presence of acetylcodeine, thebaine, papaverine, noscapine and their associated metabolites. The research methodology consisted of establishing an LC-ESI-MS method for the simultaneous detection of five major opium alkaloids (morphine, codeine, thebaine, papaverine and noscapine). A deuterated internal standard (morphine-d3) was used for the quantitation of alkaloids in harvested poppy seeds and oral fluid samples. Due to technical difficulties, 3 LC-MS instruments were employed in this work. Electrospray ionisation was employed in all mass spectrometers but the analysers included an ion trap with octopole, a triple quadrupole and a hybrid quadrupole Orbitrap. Suitable extraction procedures were determined and harvested seeds purchased from a number of supermarkets were analysed for the presence of five alkaloid compounds using the LC-MS method. A small scale pilot study with 6 participants was carried out to establish if it was possible to fail an OF drug test for opiates after consuming poppy seed muffins. OF samples were collected post ingestion using Quantisal™ kits and the level of each of the opiates was monitored. The findings were that an LC-ESI-MS method was established for the simultaneous detection and quantitation of five major alkaloids. However, the method development process involved finding a solution to co-elution of morphine and codeine. The process also included resolving the issue of thebaine producing two peaks with identical mass spectra and separated by a difference of 6 minutes in retention time. Varying levels of alkaloids were identified in harvested poppy seeds: levels of these compounds differed considerably within and between batches of poppy seeds. These findings could be attributed to a number of factors, for example, where and how the plants were grown and methods of harvesting. Two poppy seed muffins were consumed as part of a toxicology study. Morphine was detected in the 5 minute sample in 5 out of the 6 participants with concentrations in OF of 0.5-0.8 ng mL-1; codeine was detected in 2 of the 6 participants at 1.5 and 2.6 ng mL-1. Thebaine, noscapine and papaverine were also detected in OF of a number of participants, which has not been previously reported in the literature. However, it should be noted that the values calculated are only estimated since the peak area ratios obtained were found to be less than the lowest concentration (10 ng mL-1) in the linear calibration range. In conclusion, an LC-ESI-MS method for the simultaneous detection and quantitation of five major opium alkaloids has been established and has been used to detect alkaloids in harvested poppy seeds and oral fluid samples. From a small pilot toxicology study, oral fluid results indicate that levels of morphine and codeine do not exceed the SAMSHA 40 ng mL-1 cut-off after ingestion of a realistic amount of poppy seeds contained within bakery products.

La perméabilisation de la membrane lipidique est actuellement un domaine de recherche important, puisque l'optimisation du transport des petites molécules (comme l'ADN ou les protéines) dans les cellules est nécessaire. Dans ce travail, nous tentons une contribution dans ce domaine en proposant une méthode de perméabilisation contrôlée à l'aide des Azobenzene Modified Polymers (AMP). Des copolymères avec un taux d'hydrophobicité modéré ont été montrés dans le passé comme perméabilisant la membrane. Les AMP nous permettraient alors de contrôler cette perméabilisation via le contrôle de leur taux d'hydrophobicité (selon la longueur d'onde de la lumière à laquelle ils sont illuminés). Cette hypothèse a été vérifiée à l'aide des vésicules géantes unilamellaires (GUV) encapsulant des sondes fluorescentes solubles. La cinétique de la fuite de ces sondes en combinaison avec des expériences d'électrophysiologie sur des films noirs (BLM) nous donne accès à une meilleure caractérisation des structures de perméation créées par l'interaction entre l'AMP et les lipides. En outre, des expériences ont été réalisées sur des cellules CHO (Chinese Hamster Overy). La possibilité de faire rentrer dans les cellules des molécules qui a priori n'y sont pas internalisées a été étudiée. Par ailleurs, la fuite de molécules encapsulées dans les cellules et sa cinétique ont été examinées

En réponse à une stimulation sonore, la cellule ciliée interne libère du glutamate qui va activer des récepteurs distribués sur le bouton post-synaptique. Les courants post-synaptiques vont ensuite dépolariser la terminaison périphérique des neurones auditifs primaires, et initier le déclenchement d'un potentiel d'action. Tandis que la connaissance des mécanismes pré-synaptiques a considérablement progressé ces 10 dernières années, les mécanismes responsables de l'initiation des potentiels d'action sont encore méconnus. Dans cette étude, nous avons déterminé les conductances ioniques nécessaires au déclenchement des potentiels d'action. Les paramètres biophysiques des conductances (Na et K) ont été identifiés (algorithme d'identification trace entière) à partir d'enregistrements de patch clamp acquis sur les corps cellulaires. Un modèle mathématique de nœud de Ranvier a ensuite été développé en faisant l'hypothèse que les canaux présents sur le corps cellulaire et sur un nœud de Ranvier étaient de même nature mais en densités différentes. Les paramètres de ce modèle ont été identifiés pour reproduire les potentiels d'action extracellulaire au moyen d'un algorithme de descente du gradient. Nous avons identifié i) un courant Na entrant rapide (GNa activation: V1/2=-33 mV, act< 0.5 ms; inactivation: V1/2=-61 mV, inact < 2 ms) et deux courants K sortants, un rectifiant retardé activé à haut seuil (GKH, activation: V1/2=-41 mV; act < 2.5 ms) et un activé à bas seuil (GKL, activation: V1/2=-56 mV; act < 5 ms). Le modèle de nœud de Ranvier génère des potentiels d'action extracellulaire similaires à ceux enregistrés in vivo. La différence de durée du potentiel d'action observée le long de l'axe tonotopique (i.e. 450 µs de durée pic à pic à 1 kHz contre 250 µs à 20 kHz) s'explique parfaitement par un gradient de densité en canaux ioniques le long de la cochlée (GNa~78 nS, GKL~9 nS, GKH~3 nS à 1 kHz contre GNa~90 nS, GKL~12 nS, GKH ~6 nS à 20 kHz). Cette étude a permis d'identifier les conductances ioniques et les densités de canaux responsables de l'initiation des potentiels d'action dans les neurones auditifs primaires. Elle suggère que la coopération entre le courant Na et des 2 courants K est probablement à l'origine de la haute fréquence de décharge de ces neurones. Le modèle de nœud de Ranvier permet en outre de tester de nouvelles stratégies de stimulation électrique dans le contexte de l'implant cochléaire.

Les cellules ont développé plusieurs voies de signalisation et de réponses transcriptionnelles pour réguler leur taille et coordonner leur croissance et leurs divisions cellulaires. L'intérieur des cellules est naturellement surchargé par des macromolécules. Cet encombrement macromoléculaire, appelé crowding, a été intensément étudié in vitro et est connu pour affecter la cinétique des réactions. Cependant, l'étude des effets d'encombrement in vivo est plus difficile en raison du haut niveau de complexité et d'hétérogénéité à l'intérieur d'une cellule. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux effets de changement du volume cellulaire sur la cinétique de réactions biochimiques chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour cela, nous avons induit des stress osmotiques pour comprimer la cellule et étudier l'impact du crowding sur les cinétiques de signalisation. La réduction du volume cellulaire augmente la viscosité interne et peut retarder le fonctionnement de plusieurs voies de signalisation et de processus cellulaires. En augmentant progressivement le niveau de compression, on observe un ralentissement des processus biologiques jusqu'à un point où l'adaptation cellulaire est abolie. Ceci a été observé pour la translocation nucléaire de facteurs de transcription (Hog1, Msn2, Crz1, Mig1 et Yap1) ainsi que pour la mobilité des protéines Abp1 et Sec7. Nous montrons aussi que la compression altère la capacité de plusieurs protéines à diffuser dans le cytoplasme de différents types cellulaires. Nous proposons que ces altérations cinétiques induites par l'augmentation de la viscosité intracellulaire ne soient pas sans rappeler une transition vitreuse. Ces résultats suggèrent l'importance d'un encombrement macromoléculaire optimal permettant aux cellules de fonctionner correctement.

Cette thèse a pour but l'analyse de la dynamique de facteurs de transcription dans le noyau. Les interactions entre molécules nucléaires dans des cellules vivantes ont été décrites comme étant suffisamment transitoires pour que la dynamique de ces molécules puisse être considérée comme étant de la diffusion effective [MISTELI2001, PHAIR]. Etant donné la géométrie des chemins possibles dans le noyau et la haute densité de ce compartiment en molécules diverses, il a été démontré par de nombreux calculs que la diffusion est non seulement le moyen de transport la moins gourmande en énergie, mais également la plus efficace. Ceci nous mène à nous demander comment la cellule permet de contrôler son état transcriptionnel global au vu de la nature stochastique du déplacement de ces facteurs de transcription. Jusqu'à présent, la recherche de cible a été souvent étudiée en utilisant le " temps de premier passage ", c'est-à-dire le temps que met une particule diffusant librement pour atteindre sa cible. Dans le cas d'un compartiment aussi complexe que le noyau, où de nombreuses interactions non spécifiques peuvent avoir lieu, et avec une quantité limitée de protéines distribuées de façon homogène, le temps nécessaire pour qu'une protéine trouve sa cible est en complet décalage avec l'efficacité à laquelle fonctionnent les systèmes biologiques.