Outre leur polarité apico-basale, certaines cellules épithéliales développent une seconde polarité, appelée Polarité Planaire Cellulaire (PCP). L'axe de la PCP est orienté perpendiculairement à l'axe de polarité apico-basale et régit l'orientation uniforme de certaines structures, comme les poils ou cils, non seulement à l'échelle de la cellule mais également au sein du tissu. L'épithélium cochléaire est l'un des meilleurs modèles d'étude de PCP chez les mammifères. En effet, les cellules neuro-épitheliales qui le composent, soutenues par des cellules de soutien, présentent à leur apex, des touffes ciliaires dont l'orientation est parfaitement coordonnée par la voie de la polarité planaire. Les deux premiers gènes impliqués dans la PCP chez les mammifères, Vangl2 et Scrib1, ont été identifiés sur la base du phénotype de la cochlée chez les mutants. L'analyse de la localisation de Vangl2 dans l'organe de Corti a également révélé une localisation asymétrique proximo-distale et transitoire de la protéine, perpendiculaire à l'axe apico-basal classique. Cette asymétrie apparaît à la jonction entre deux types cellulaires : une cellule sensorielle ciliée et une cellule de soutien. J'ai pu montrer au cours de mes travaux de thèse que cette asymétrie était majoritairement due à une accumulation de Vangl2 du côté distal des cellules de soutien, et que dans une moindre mesure, Vangl2 pouvait ségréger du côté distal des cellules ciliées. Cette localisation subcellulaire très précise et limitée dans l'espace semble être indépendante de l'expression du gène Scrib1 dans les cellules ciliées. La délétion du gène Scrib1 dans les cellules ciliées m'a toutefois permis de mettre en évidence que ce gène avait un rôle autonome dans la régulation de la PCP, et que les cellules de soutien de l'organe de Corti pouvaient jouer un rôle prépondérant dans le contrôle de la PCP. Mes travaux ont également permis de mettre en évidence que GIPC1 avait un rôle dans la régulation de la PCP et le maintien de l'intégrité des touffes ciliaires des cellules sensorielles, et que le complexe GIPC1/Myosine VI pouvait réguler l'établissement de l'asymétrie de Vangl2 dans l'organe de Corti. / Several epithelia exhibit a second polarity perpendicular to the apico-basal axis, called planar polarity and that governs the orientation of structures such as stereocilia and hear. Our laboratory studies planar polarity, using mammalian cochlear sensory epithelium and we focus our studies on Vangl2, that we identified as the first mammalian planar polarity gene. Vangl2 encodes a four-transmembrane protein that contains a PDZ binding domain in its C-terminus tail. Vangl2 is asymmetrically located at the junction between mechanosensory hair cells and supporting cells, and this asymmetry appears important for planar cell polarity. I have shown in my thesis, using STED microscopy, that Vangl2 asymmetry is mainly due to an accumulation of Vangl2 to the distal side of supporting cells. I sought to dissect the molecular role of Vangl2 by analysing its trafficking within the cochlear epithelium. Deletion analysis shows that the last 12 amino acids, unlike its N-terminus tail are essential for Vangl2 endoplasmic reticulum sorting, its plasma membrane targeting and its function. Conditional mutant mice analysis show that Scrib1, which we have previously shown, interacts with Vangl2 through the PDZ binding domain of its C-terminal tail, is not the protein mediating this asymmetry. My work also highlight that GIPC1 had a role in the regulation of PCP and maintaining the integrity of hair bundles of sensory cells, and that the complex GIPC1/Myosin VI could regulate Vangl2 asymmetry in the organ of Corti.

TMPRSS3 est une sérine protéase mutée dans les surdités humaines DFNB8/10. Pour déterminer le rôle de cette protéine dans la physiologie cochléaire, nous avons généré puis caractérisé le phénotype auditif d'un modèle murin mimant la pathologie humaine. Les souris mutantes homozygotes sont profondément sourdes, due à une perte rapide et complète des cellules sensorielles cochléaires au moment de leur entrée en fonction. Afin de caractériser les mécanismes moléculaires responsables de la perte de ces cellules, nous avons comparé le protéome de souris sauvages et mutantes par des gels en 2-dimensions. Nous avons ensuite analysé les spots variants par spectrométrie de masse, ce qui nous a permis de reconstruire les réseaux dans lesquels les protéines variantes interviennent. Parmi les réseaux identifiés, nous avons focalisé notre analyse sur celui du canal potassique BK, puisque sa mise en place est concomitante de la dégénérescence des cellules sensorielles. Par des expériences d'immunohistochimie et de patch-clamp, nous avons pu montrer dans les cellules sensorielles de la cochlée, une réduction de l'expression membranaire et de l'activité de ce canal en l'absence de Tmprss3 fonctionnelle. Le résultat original de notre travail est qu'une sérine protéase est capable de réguler le canal potassique BK. / TMPRSS3 is a type II serine protease mutated in human DFNB8/10 deafness. In order to determine the role of this protein in the cochlear physiology, we generated a mutant mice and phenotyped it. We found that homozygous mutant mice are profoundly deaf, due to a rapid and drastic degeneration of cochlear sensory cells at the onset of hearing. In order to decipher the molecular mechanism leading to sensory cells degeneration, we compared the cochlear proteome of wild type and homozygous mice using 2-dimensions gels. Then, we analyzed variant spots using mass spectrometry. Using bioinformatics, we clustered the protein in signaling pathways. We focused on the network centered on BK potassium channel because this channel appears at the onset of hearing, the time when sensory cells degenerate. Using immunohistochemistry and patch-clamp techniques, we were able to show that in the absence of a functional Tmprss3, membranous expression and activity of BK channel are altered in cochlear sensory cells. The original finding of our work is that a serine protease is able to modulate BK potassium channel.

La surdité est l'un des déficits sensoriels les plus fréquents dans nos sociétés industrialisées. Parmi les pathologies de l'audition, les surdités de perception ou neurosensorielles sont les plus répandues. Les surdités de perception sont dues à un dysfonctionnement de la cochlée impliquant l'homéostasie ionique, la perte des cellules sensorielles et des neurones ganglionnaires. Alors qu'une altération de l'homéostasie ou que la perte de cellules sensorielles entraine immanquablement la survenue d'une surdité, l'impact de la perte de neurones ganglionnaires est mal connu.L'objet de cette thèse était d'évaluer l'impact des pertes neuronales sur l'audition. Pour ce faire, nous avons développé un outil pharmacologique capable de créer une perte sélective de neurones auditifs primaires, sans endommager les structures pré-synaptiques telles que les cellules sensorielles et la strie vasculaire. Pour ce faire, nous avons appliqué des doses croissantes de ouabaïne sur la membrane de la fenêtre ronde chez la gerbille. Les tests électrophysiologiques (produits de distorsions acoustiques, potentiel endocochléaire et potentiel d'action composite du nerf auditif) ont été réalisés avant et 6 jours après l'application de ouabaïne. A la fin des explorations fonctionnelles, les cochlées étaient prélevées et préparées pour réaliser des évaluations morphologiques en microscopie confocale et en microscopie électronique à transmission.Jusqu'à 80 µM, la ouabaïne n'entrainait aucun changement significatif des produits de distorsions acoustiques ce qui reflétait le bon fonctionnement des cellules ciliées externes, ni du potentiel endocochléaire témoin du fonctionnement normal de la strie vasculaire. En revanche, les mêmes concentrations de ouabaïne provoquaient une diminution dose-dépendante de l'amplitude du potentiel d'action composite du nerf auditif, étroitement associée à une perte de neurones ganglionnaires et de synapses afférentes. Si l'amplitude du potentiel d'action composite du nerf auditif constitue un bon indicateur du nombre et de l'état fonctionnel des neurones ganglionnaires et des synapses afférentes, ce n'est donc pas le cas pour les seuils audiométriques. En effet, ce n'était qu'avec une perte de 75 % des synapses afférentes et supérieure à 55 % des neurones ganglionnaires, qu'une élévation des seuils audiométriques était observée, après une perfusion de 80 µM de ouabaïne. A 100 µM de ouabaïne, l'élévation des seuils auditifs résultait de la perte cumulée des cellules sensorielles et de l'altération de la strie vasculaire, se surajoutant aux dommages neuronaux et synaptiques.L'ensemble de nos résultats montrait que l'application de ouabaïne sur la membrane de la fenêtre ronde chez la gerbille constitue un excellent modèle pour étudier l'impact de la perte sélective des neurones ganglionnaires sur la fonction auditive. Il apparaît aussi nécessaire de développer des outils d'investigation plus précis que le simple audiogramme pour évaluer les pertes neuronales chez l'homme. / Deafness is one of the most frequent sensory deficits in our industrialized societies. Among the auditory pathologies, sensorineural deafness is the most wide-spread. Sensorineural deafness is due to a dysfunction of the cochlea involving the ionic homeostasis, loss of sensory cells and spiral ganglion neurons. While an alteration of the homeostasis or the loss of sensory cells induce inevitably the appearance of deafness, the impact of spiral ganglion neuron loss is unknown.The object of this thesis was to estimate the impact of spiral ganglion neuron losses on the auditory function. We developed a pharmacological tool capable of creating a selective loss of spiral ganglion neurons, without damaging the presynaptic structures such as the sensory cells and the stria vascularis. To do this, we applied increasing doses of ouabain to the round window membrane in the gerbil. Electrophysiological evaluations such as the distortion product otoacoustic emissions, the endocochlear potential and the compound action potentials of the cochlear nerve were recorded before and 6 days after application of ouabain. At the end of the functional evaluations, the cochlea were removed and prepared for morphological evaluations using confocal microscopy and transmission electron microscopy.Our results showed that up to a concentration of 80 µM, ouabain did not induce any significant change of the amplitude of the distortion product otoacoustic emissions, which indicated a normal functional state of the outer hair cells, nor of the endocochlear potential which reflected an intact stria vascularis. On the other hand, the same concentrations of ouabain led to a dose-dependent decrease of the amplitude of the compound action potentials, which was strictly associated with a loss of spiral ganglion neurons and afferent synapses, as assessed by morpho-anatomical analyses. If the amplitude of the compound action potentials constitutes a good indicator of the number and the functional state of the spiral ganglion neurons and the afferent synapses, it is not the case for the audiometric thresholds. Indeed, a loss of 75 % of afferent synapses and more than 55 % loss of the ganglion neurons was necessary before an elevation of the audiometric thresholds was observed in the cochleae perfused with 80 µM ouabain. At 100 µM ouabain, the elevation of the auditory thresholds may result from the accumulated loss of sensory cells, damage to the stria vascularis, in addition to the loss of the spiral ganglion neurons and afferent synapses. All these results indicate that the application of ouabain onto the round window membrane in the gerbil is an excellent model to study the impact of the selective loss of the spiral ganglion neurons on hearing function. More generally, this study points towards the necessity of developing more precise tools, beyond the simple audiogram, for the investigation of auditory neuron loss in humans.

Dans la cochlée, la réponse couplée de sa structure et de son fluide interne peut être représentée sous la forme d’une onde dont les caractéristiques varient en fonction de la position longitudinale. La méthode asymptotique Wentzel-Kramers-Brillouin est adaptée à la modélisation de ce type d’onde. Dans un premier temps, cette méthode est reprise. Un modèle numérique est également développé et les résultats des deux méthodes sont comparés. Dans un deuxième temps, la métohde Wentzel-Kramers-Brillouin est améliorée afin de prendre en compte le couplage entre plusieurs ondes. Le couplage d’un mode propagatif avec des modes évanescents est réalisé et validé. Dans la cochlée, la stimulation des cellules cillées résulte d’un mouvement de cisaillement de la membrane tectoriale et de flexion de la membrane basilaire. Le couplage entre ces deux modes de déformation est encore peu connu et offre une perspective intéressante. Dans un troisième temps, une nouvelle méthode couplant la méthode Wentzel-Kramesr Brillouin et une méthode numérique est développée et validée afin de déterminer des modes transverses de propagation. Cette méthode est appliquée à la mécanique cochléaire et un mode de flexion de la membrane basilaire et un mode relatif à un mouvement de cisaillement de la membrane tectoriale sont déterminés. Enfin, une expérience inspirée des cochlées artificielles est conçue et réalisée. La propagation d’ondes est observée et la tonotopie est mesurée et comparée aux modèles. Afin de limiter la réflexion des ondes et de faciliter la mesure, une combinaison originale du trou noir acoustique avec une lame de largeur variable est utilisée. / The cochlea is the organ of hearing for humans and mammals. It is often modelled as an inhomogeneous waveguide. A travelling wave propagates along the fluid structure coupled waveguide. The mechanical impedance of the structure is varying and provides a frequency place relation. The asymptotic method Wentzel-Kramers-Brillouin allows to solve for the basilar membrane vibration. The evanescents modes are taken into account to provide a better representation compared to the numerical models. As a second step, the finite elements method is used to solve for the transversal modes while the WKB Approximation deals with the longitudinal propagation. The first flexural mode of the basilar membrane is shown. The second propagative mode reveals a shearing motion of the tectorial membrane which can help stimulating the hair cells. An over-size artificial cochlea is designed and built. Thanks to an acoustic black hole, used as a anechoic end, travelling waves are observed on this device. Reflected waves are attenuated and the interferences with incident waves reduced. Mode coupling could be applied not only to evanescent modes but also to propagatives ones. Perspectives for the adaptation of the WKB method to fluid structure inhomogeneous waveguides, and particularly to the immersed acoustic black hole, seem to be very promising.

Les connexions entre les cellules sensorielles et les neurones primaires de l’oreille interne, appelées synapses sont essentielles à l’encodage et la transmission des informations auditives et vestibulaires vers le cerveau. C’est aussi une zone extrêmement exposée et fragile qui semble impliquée dans de nombreuses atteintes de l’audition et de l’équilibration, mais également au cours du vieillissement. Des récupérations spontanées de l’audition et de l’équilibre ont été observées suite à ces différentes atteintes chez l’Homme. Dans le cadre de ma thèse, j’ai étudié d’une part, comment des atteintes sélectives de ces synapses pouvaient générer des troubles de l’oreille interne chez l’animal, et d’autre part, comment des mécanismes de réparation spontanée de ces synapses supportent la récupération des fonctions auditives et vestibulaires. Nous avons constaté qu’il existe une hétérogénéité dans les capacités de réparations synaptiques entre la cochlée et le vestibule. L’étude des mécanismes moléculaires mis en jeu dans cette réparation synaptique pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les atteintes de l’oreille interne. / Inner ear connections between primary neurons and sensory cells, called synapses are essential for encoding and transmitting auditory and vestibular information to the brain. It is also an extremely exposed and fragile area that is involved in many hearing and balance disorders, but also during aging. Spontaneous hearing and balance recoveries have been observed following these different injuries in humans. In the context of my thesis, I studied, on the one hand, how selective lesions of these synapses could generate inner ear disorders in animals, and on the other hand, how spontaneous repair mechanisms of these synapses support auditory and vestibular functions recovery. We found that there is heterogeneity in synaptic repair capabilities between the cochlea and the vestibule. The study of the molecular mechanisms involved in this synaptic repair could pave the way for the development of new therapeutic strategies against various inner ear disorders.

La perte auditive est le trouble sensoriel le plus commun avec 40 % des personnes de plus de 65 ans affectées, entraînant, chez ces patients une dégradation de leur qualité de vie et un isolement sociale. Les principales causes sont le vieillissement ou l'exposition au bruit, mais les mutations génétiques sont aussi à l'origine de déficits auditifs. Parmi ces surdités, le Syndrome de Chudley McCullough (CMCS) est une maladie rare caractérisée par une surdité sévère et précoce associée à des anomalies cérébrales (Chudley et al., 1997). Récemment, des mutations du gène GPSM2 (G protein signaling modulator 2) ont été décrites comme étant responsables de cette pathologie sans que l'on en connaisse les mécanismes (Walsh et al., 2010). A l'aide d'un modèle d'étude murin de cette pathologie, nous avons identifié les bases moléculaires de la pathologie ainsi qu’une nouvelle fonction moléculaire pour Gpsm2 sur la modulation du cytosquelette d’actine. La perturbation de cette fonction affect à la fois la maturation des cellules auditives et la croissance des jeunes neurones, pouvant expliquer les surdités et l’hypoplasie du corps calleux décrits chez ces patients (Mauriac et al., 2017). De plus, nous avons identifié les partenaires de Gpsm2, les protéines Gαi, comme indispensables à la fonction auditive (Beer-Hammer et al., 2018). Au niveau moléculaire, nous avons découvert une nouvelle interaction de Gpsm2 avec une protéine essentielle à la maturation des cellules auditives et impliquées dans les surdités de type Usher, la Whirlin.Par conséquent, notre étude a permis de clarifier l’étiologie du CMCS et de montrer que sa complexité et son aspect multisyndromique sont dus au rôle multifonctionnel du complexe Gpsm2/G⍺i non seulement sur la dynamique de la tubuline dans des cellules en prolifération et en post-mitotiques (Ezan et al., 2013), mais aussi sur la dynamique d’actine (Mauriac et al., 2017). / Hearing loss is the most common sensory disorder, affecting 40% of people over 65 years old, leading for these patients, to the deterioration of their quality of life and to their social isolation. The main causes are aging or exposure to noise. However, many genes can also cause deafness. Among these deafnesses, the Chudley McCullough Syndrome (CMCS) is a rare disease characterized by severe and early deafness associated with brain abnormalities (Chudley et al., 1997). Recently, mutations in the GPSM2 (G protein signaling modulator 2) gene were found to be causative of this pathology, but the molecular basis were unknown (Walsh et al., 2010). Using a murine model of this pathology, we identified the molecular basis of this pathology as well as a new molecular function for Gpsm2 on the modulation of actin cytoskeleton. The disruption of this function leads to defect of the maturation of auditory hair cells and the reduction of the outgrowth of young neurons which may explain the deafness and the hypoplasia of the corpus callosum described in these patients (Mauriac et al., 2017). In addition, we identified partners of Gpsm2, Gαi proteins, as essential for auditory function (Beer-Hammer et al., 2018). At the molecular level, we have discovered a new interaction of Gpsm2 with a protein essential for the maturation of auditory cells and involved in Usher type deafness, Whirlin.Therefore, our study clarified the etiology of CMCS and show that the complexity and multisyndromic aspect of this pathology is due to the multifunctional role of the complex Gpsm2/G⍺i not only on tubulin dynamics in proliferating cells and post-mitotic cells (Ezan et al., 2013), but also on actin dynamics (Mauriac et al., 2017).

Les cellules ciliées sont les cellules sensorielles de la cochlée, l’organe de l’audition, et assurent la transduction des stimulations acoustiques en message nerveux compréhensible par le système nerveux central. Nous avons étudié le rôle du cytosquelette dans le transfert synaptique et dans le cadre d’une neuropathie auditive.La première partie de cette thèse a consisté à déterminer le rôle des filaments d’actine dans l’exocytose des cellules ciliées. Pour ce faire, nous avons infusé des toxines connues pour dépolymériser les filaments d’actine directement dans les cellules ciliées internes. Après 10 minutes d’infusion, nous avons mesuré l’exocytose des cellules ciliées à partir de l’enregistrement de la capacité membranaire, indice de la fusion vésiculaire. Dans nos expériences, la dépolymérisation de l’actine provoquait une augmentation de l’exocytose. De plus nos résultats suggèrent qu’une fraction des vésicules éloignées des canaux calciques se rapproche des sites de libération après dépolymérisation du réseau d’actine. Ces travaux ont donc permis d’identifier une sous-population de vésicules synaptiques dont la disponibilité aux sites de fusion est dépendante des filaments d’actine. La seconde partie de cette thèse porte sur les mécanismes à l’origine d’une neuropathie auditive, la surdité AUNA1. Cette dernière se caractérise par la surexpression cytoplasmique de la protéine Diaph3, dont la fonction est de réguler la nucléation de l'actine et des microtubules. Pour étudier AUNA1, nous avons montré que les souris transgéniques qui surexpriment la protéine Diap3 (protéine murine) développent une surdité progressive, similaire à la neuropathie auditive AUNA1 : soit une élévation des seuils auditifs et des otoémissions normales, témoins de l’activité des cellules ciliées externes (qui ont pour rôle d’amplifier les stimulations sonores). En outre, le potentiel de sommation, qui reflète l’activité in vivo des cellules ciliées internes est altéré chez les souris transgéniques. L’observation des cellules ciliées internes en microscopie électronique à balayage montre un gonflement de la plaque cuticulaire, qui est une plateforme dense en actine servant à ancrer les stétéocils. L’observation en microscopie confocale du réseau de microtubules montre que ce dernier entoure la plaque cuticulaire chez les souris sauvages. A l’inverse, les microtubules envahissent la plaque cuticulaire chez les souris transgéniques. L’ensemble de ces résultats a donc permis de montrer un défaut d’adressage des microtubules à l’origine de la surdité AUNA1. / Inner hair cells transduce sound stimulation into neurotransmitter release onto the afferent auditory nerve fibers. Here, we studied how cytoskeleton modulates the transduction capabilities of the inner hair cells. Exocytosis at the inner hair cell ribbon synapse is achieved through the coupling between calcium channels and glutamate-filled synaptic vesicles. Using membrane capacitance measurements, we probed whether the actin filament network regulates the exocytosis of synaptic vesicles at the auditory hair cell. Our results suggest that actin network disruption increases exocytosis and that actin filaments may spatially organize a sub-fraction of synaptic vesicles with respect to the calcium channel.The auditory neuropathy 1 (AUNA1) is a form of human deafness, which results from a point mutation in the 5’untranslated region of the Diaphanous homolog 3 (DIAPH3) gene. Strikingly, the DIAPH3 mutation leads to the overexpression of the Diaph3 protein, a formin family member involved in the cytoskeleton nucleation and stabilization. Here, we examined in further details the anatomical, functional and molecular mechanisms that account for AUNA1. We found out that the Diap3-overexpressing transgenic mice show a progressive threshold shift associated to a defect in the inner hair cells. While synaptic function was not affected, Diap3-overexpression results into a selective and early-onset alteration of the inner hair cells cuticular plate, a dense plateform anchoring the stereocilia bundle. Molecular dissection of the apical components revealed that the microtubule meshwork undergoes an aberrant targeting into the cuticular plate of the transgenics’ inner hair cells at early onset, leading to the inabilities of these sensory cells to transduce incoming sound stimulation at later stages.

La neuropathie auditive est une forme de surdité caractérisée par une atteinte des cellules ciliées internes (qui détectent les ondes sonores et les transforment en message nerveux) et/ou des neurones afférents primaires (qui véhiculent les messages nerveux jusqu'au noyau cochléaire), associée à une activité normale des cellules ciliées externes (qui amplifient les ondes sonores). AUNA1 est la première neuropathie auditive héréditaire à avoir été décrite. Elle est causée par une mutation ponctuelle située dans le promoteur du gène DIAPH3, résultant en une surexpression de DIAPH3. La protéine DIAPH3, un membre de la famille des formines, est connue pour promouvoir la nucléation et l’élongation des filaments d’actine ainsi que la stabilisation des microtubules. Nous avons étudié les mécanismes d’AUNA1 à partir d’un modèle murin transgénique surexprimant le gène diap3, l’orthologue murin de DIAPH3. Les souris transgéniques développent une surdité dont les caractéristiques sont semblables à celles d’AUNA1. Cette surdité est due à une perte d’activité des cellules ciliées internes. L’activité synaptique et les courants potassiques de ces cellules ne sont pas altérés. En revanche, la microscopie électronique révèle une fusion des stéréocils (expansions cytoplasmiques qui permettent la détection des ondes sonores) et une déformation de la plaque cuticulaire (plateforme qui assure l’ancrage des stéréocils). Par la technique d’immunomarquage, nous avons mis en évidence une invasion de la plaque cuticulaire par des microtubules. Enfin, nous avons démontré que la protéine Diap3 est localisée dans la plaque cuticulaire des cellules ciliées internes, suggérant ainsi que la surexpression de diap3 provoque un remodelage du réseau de microtubule des cellules ciliées internes, à l’origine de la surdité AUNA1. / Auditory neuropathy is a type of deafness characterized by an alteration of the inner hair cells (which detect the acoustic waves and transform them into neural messages) and/or of the primary afferent neurons (which conduct the neural messages to the cochlear nucleus), associated with a normal activity of the outer hair cells (which amplify the acoustic waves).AUNA1 is the first hereditary auditory neuropathy which has been described. It is caused by a point mutation in the promoter of the DIAPH3 gene, resulting in an overexpression of DIAPH3. The DIAPH3 protein, a formin family member, is known to promote the actin filament nucleation and elongation and to stabilize the microtubules.We studied the AUNA1 mechanisms using a transgenic mouse model which overexpresses the diap3 gene, the mouse homologue of DIAPH3. Transgenic mice develop a deafness whose characteristics are similar to the ones of AUNA1. The hearing loss is due to a defect in the inner hair cell activity. The synaptic activity and the potassium currents of these cells are not altered. However, electron microscopy reveals a fusion of the stereocilia (cytoplasmic expansions which detect the acoustic waves) and a disruption of the cuticular plate (plateform which maintains stereocilia). By immunolabeling, we showed an invasion of the cuticular plate by microtubules. Eventually, we demonstrated that Diap3 is located in the inner hair cell cuticular plate, suggesting that the overexpression of diap3 provokes a remodeling of the inner hair cell microtubule network, underlying the AUNA1 deafness.

Les cellules sensorielles auditives, les cellules ciliées internes (CCI), transforment les ondes sonores en message nerveux. Les synapses des CCI se distinguent de celles du système nerveux par leur anatomie. En effet, les synapses des CCI sont dotées d'un organite appelé ruban synaptique. Ce dernier a pour fonction de concentrer les vésicules synaptiques à proximité des zones actives. Il est important de souligner qu'un déficit de la libération synaptique à la première synapse auditive est à l'origine de surdités chez l'homme. Si la physiologie des synapses à rubans des cellules ciliées a été intensivement étudiée, la composition moléculaire des ces synapses reste en grande partie inconnue. L'objectif de cette thèse était donc d'isoler les protéines clefs de la machinerie synaptique. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique du double hybride à partir d'une banque d'ADN complémentaire de cochlée et de la protéine Ribeye, composant majeur des rubans, comme appât. La difficulté majeure de notre étude provient de la structure de Ribeye, qui est constitué par deux domaines A et B. Tandis que le domaine A est dirigé vers le cœur du ruban synaptique et aurait une fonction structurale, le domaine B est fortement homologue au facteur de transcription Ctbp2. Ainsi, nous avons identifié plusieurs candidats comme étant des facteurs de transcription. Ces derniers interagissent probablement avec Ctbp2 dans le noyau. Nos résultats obtenus soulignent la difficulté d'identifier des protéines d'interactions, inhérente à l'utilisation de Ribeye comme appât. Parmi les autres candidats, nous avons isolés des composants du système de l'ubiquitine, suggérant une régulation ubiquitine-dépendante de l'activité ou de la structure des rubans synaptiques. / Inner hair cells (IHCs) are the sensory cells of the cochlea, the organ of hearing. IHCs transduce sound stimulation into the release of glutamate onto the afferent auditory nerve fibers. To achieve this task, IHCs harbor at their presynaptic side a large organelle, the so-called synaptic ribbon, surrounded by a monolayer of glutamate-filled synaptic vesicles. Exocytosis of glutamate at the hair cell ribbon synapse seems to be unconventional as the synaptic machinery, depicted so far, differs from most of the nervous system synapses. The goal of this work was to identify new members of the synaptic machinery of the hair cell ribbon synapse. To do so, we took advantage of the yeast two-hybrid system using a cochlea cDNA library as the prey and Ribeye (the major ribbon component) as the bait. Transcription factors were highly represented in our screening assay, most probably because Ribeye is highly homologous to the transcription factor Ctbp2. They probably interact with Ctbp2 in the nucleus. Our results underlined the difficulty to identify protein interactions because of the nature of Ribeye itself. However, we found ubiquitin system components among the other candidates, suggesting an ubiquitin-dependent regulation of the activity and/or structure of synaptic ribbons.

L'implantation cochléaire reste à ce jour le seul moyen capable de restaurer la perception auditive chez les personnes présentant une surdité sévère ou profonde en échec d'appareillage conventionnel. Son principe repose sur la stimulation électrique directe des neurones auditifs de la cochlée par un faisceau d'électrode inséré dans l'oreille interne. Malgré les progrès réalisés dans le manufacturage des électrodes et dans la technique chirurgicale, le geste d'insertion du faisceau d'électrode demeure traumatique. Ce traumatisme est souvent responsable de la perte de l'audition résiduelle sur les fréquences graves et d'une réaction inflammatoire conduisant à une cicatrisation fibreuse. Cette réaction fibreuse est délétère à la fois pour le fonctionnement de l'implant, car augmentant l'impédance des électrodes, mais aussi pour l'audition résiduelle lorsqu'elle est préservée, limitant ainsi les possibilités de stimulation hybride électro-acoustique. Aussi les recherches actuelles tendent à réduire cette fibrose par des moyens pharmacologiques limités, utilisant un corticoïde (dexaméthasone), sans pour autant que son efficacité n'ait été démontrée de manière formelle in vitro ou in vivo. En outre, les cibles moléculaires visées lors de la réaction inflammatoire et fibrotique dans la cochlée n'étant pas clairement identifiées, il est difficile de savoir si cette approche thérapeutique est la plus adaptée. Dans ce travail nous avons donc mis au point des modèles in vitro de culture de tranche de cochlée et d'explant cochléaire de rat pour tester l'efficacité antifibrotique et la toxicité de plusieurs drogues, dont la dexaméthasone, mais aussi l'aracytine, antimitotique non ototoxique et d'utilisation sûre au contact du système nerveux central. Entre nos mains, il apparaît que la stratégie antimitotique par application d'aracytine était plus efficace contre la fibrose et moins toxique pour les cellules sensorielles que la dexamethasone. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons utilisé deux modèles in vivo de fibrose cochléaire, à savoir : l'induction d'une labyrinthite immune à Keyhole Limpet Hemocyanin et l'implantation chronique d'un corps étranger intra-cochléaire. A nouveau, l'aracytine délivrée par pompe osmotique intracochléaire permettait de réduire significativement la fibrose dans le modèle de labyrinthite alors que l'effet de la dexamethasone n'était pas significatif. De même la préservation de l'audition était statistiquement meilleure dans le groupe des animaux traités par antimitotiques. Aussi seule l'aracytine a été testée dans l'autre modèle de corps étranger intracochléaire. Elle permettait également de réduire la fibrose observée dans la cochlée, sans effet toxique sur les neurones auditifs. Si la préservation de l'audition était impossible dans le groupe contrôle, l'audition sur les basses fréquences était conservée chez les animaux traités par aracytine. Enfin, les seuils de stimulation électrique capables de provoquer une réponse électrophysiologique par le potentiel évoqué auditif étaient significativement inférieurs dans le groupe traité par aracytine. Ainsi, nous avons pu montrer qu'une stratégie antimitotique était capable d'inhiber efficacement la fibrose dans la cochlée in vitro et in vivo, et ce avec une efficacité supérieure à la dexaméthasone. Nous recommandons donc d'envisager en pratique clinique l'utilisation de l'aracytine pour prévenir la fibrose cochléaire. De plus, ce travail souligne l'intérêt de mieux décortiquer les voies cellulaires conduisant à l'inflammation et à la fibrose cochléaire, de sorte à déterminer les meilleures cibles et molécules candidates. Ces mêmes molécules pourront être testées sur les modèles que nous avons mis au point afin de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques à la prévention de la fibrose cochléaire. / Cochlear implantation is the only treatment capable of restoring the auditory pathways in patient suffering from severe to profound hearing loss with poor benefit from hearing aids. Its functioning relies on direct electric stimulation of primary auditory neurons through an electrode array inserted into the cochlea.Despite the advances in electrode design and surgical technique, the act of inserting the electrode array is still traumatic. These traumas result in the loss of residual hearing in low frequencies and provoke an inflammatory reaction leading to fibrous scarring. This fibrous reaction is deleterious to not only the implant performance by increasing the impedance of the electrodes, but also the preserved residual hearing which limit the possibilities of hybrid electro-acoustic stimulation.Current researches aim at limiting this fibrosis by drug application, such as corticosteroids. Therefore dexamethasone is frequently used, but its effectiveness has been only demonstrated formally in vitro or in vivo. Furthermore, the molecular targets set in the fibrotic and inflammatory reaction in the cochlea are not clearly identified, and it is unclear whether this therapeutic approach is best suited.In this study we have developed in vitro models of rat cochlear slice and cochlear explants culture to test the antifibrotic efficacy and toxicity of various drugs, including dexamethasone, but also aracytine, an antimitotic drug with very low ototoxicity which is safely used in contact with the central nervous system. In our hands, it appears that antimitotic aracytine is more effective against fibrosis and less toxic to the sensory cells than the anti-inflammatory drug dexamethasone.In the second part of this study, we used two in vivo models of cochlear fibrosis namely the KLH(keyhole limpet hemocyanin)-induced sterile labyrinthitis and the foreign-body-induced chronic labyrinthitis. Again, the intracochlear fibrosis in the model of KLH-induced labyrinthitis was signticantly reduced by the osmotic pump with aracytine, while the effect of dexamethasone was not significant. Also the preservation of the hearing was statistically better in the group of animals treated with this antimitotic drug. Consequently, aracytine was the only drug tested in the other model of foreign-body-induced labyrinthitis. Again, aracytine reduced fibrosis in the cochlea, without any toxic effects on auditory neurons. While the preservation of the hearing was not achieved in the control group, the low frequencies hearing was preserved in animals treated with aracytine. Finally, the thresholds of electrical stimulation eliciting auditory brainstem response recordings were significantly lower in the treated group by aracytine.Thus, we have shown that an antimitotic strategy was able to inhibit fibrosis effectively in the cochlea in vitro and in vivo, and this with a greater efficiency than dexamethasone. We therefore recommend considering in clinical practice the use of aracytine to prevent cochlear fibrosis. In addition, this study stresses the importance of analyzing the cellular pathways of cochlear inflammation and fibrosis, in order to determine the best targets and candidate molecules. These molecules could be tested on the models that we have developed in order to offer new therapeutic options to prevent cochlear fibrosis.