Le Virus de l’Hépatite C (HCV) est un problème majeur de santé publique qui touche plus de 170 millions de personnes dans le monde. Le HCV cible essentiellement les hépatocytes où il effectue son cycle de réplication qui peut-être divisé en trois étapes majeures : l’entrée de la particule virale qui aboutit à la libération de l’ARN viral dans le cytoplasme, la traduction/réplication du génome viral et l’assemblage/sécrétion des particules néosynthétisées. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés à l’étape d’entrée qui est un processus complexe multiséquentiel faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires. Le virus se lie d’abord à la surface cellulaire via des facteurs d’attachement puis interagit avec des facteurs d’entrée spécifiques tels que la tétraspanine CD81, le récepteur scavenger B1 et les protéines de jonctions serrées CLDN-1, -6, -9 et OCLN. La particule virale est ensuite internalisée via une endocytose dépendante de la clathrine, puis sous l’action du pH acide des endosomes les enveloppes virale et cellulaire fusionnent permettant la libération de la capside virale dans le cytoplasme de la cellule infectée. Parmi les facteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du HCV, deux protéines de la famille des tétraspanines ont été identifiées, CD81 et CD63. Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires capables de former des microdomaines enrichis en tétraspanines en interagissant entre elles ainsi qu’avec des protéines dites partenaires. Nous avons testé l’implication dans l’entrée virale des tétraspanines exprimées dans les hépatocytes. Ainsi, nous avons montré que CD151 semble également important pour l’entrée du HCV. CD151 aurait un rôle indirect sur l’entrée en jouant sur l’organisation membranaire, en empêchant CD81 de former des clusters qui restreignent l’entrée du virus. Nous avons aussi étudié le rôle que pouvait jouer les polymorphismes de facteurs d’entrée sur l’entrée virale. Sur une cohorte de patients toxicomanes infectés par le HIV mais non infectés par le HCV, deux mutations ont été identifiées, R209Q dans CLDN-6 et P24A dans OCLN, qui n’étaient pas présentes dans les populations contrôles ou coinfectées par le HCV. Chez les patients toxicomanes, il est très rare que les patients infectés par le HIV ne le soient pas par le HCV, suggérant une résistance naturelle de ces patients à l’infection. Nous avons émis l’hypothèse que ces deux mutations pouvaient bloquer l’entrée du HCV. Cependant, la caractérisation de ces mutations a montré qu’elles n’avaient pas d’effet fonctionnel in vitro. Enfin, nous avons exploré l’effet de la Monensine, un ionophore polyéther, sur l’infection par le HCV. Cette molécule augmente le pH des endosomes via ses capacités de transfert d’ions à travers les membranes cellulaires. Nous avons montré qu’elle inhibe l’entrée du HCV en bloquant la fusion. De manière intéressante, la transmission cellule-cellule, un mécanisme d’entrée du virus encore mal caractérisé, était également bloquée par la Monensine, suggérant une étape de fusion dépendante du pH pour cette voie. Nous avons généré des mutants de résistance à la Monensine, notamment le clone FL-8 qui portait deux mutations dans les glycoprotéines d’enveloppe, Y297H dans E1 et I399T dans E2. Les particules virales portant ces deux mutations infectaient les cellules de manière indépendante du pH, présentaient des propriétés physicochimiques différentes et ne se transmettaient plus de cellule à cellule. En conclusion ces études soulignent l’importance de l’organisation membranaire pour l’entrée du virus via certains facteurs cellulaires tels que CD151. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la transmission cellule-cellule était dépendante du pH et que des mutations ponctuelles dans E1 et E2 permettent une fusion indépendante du pH. En revanche, des polymorphismes naturels de CLDN-6 et OCLN n’affectent pas leur capacité à supporter l’entrée virale. / Hepatitis C Virus (HCV) is a global health problem with over 170 million infected people worldwide. HCV targets mainly the hepatocytes and its lifecycle is divided into three steps. Viral particle entry leads to the release of viral genomic RNA into the cytoplasm where translation and replication take place. Then, new viral particles are assembled and secreted. During my thesis, we focused on the entry step. Indeed, HCV entry is a complex multistep process that requires numerous cellular factors. First, the virus interacts with attachment factors and then interacts with specific cellular factors including the tetraspanin CD81, the scavenger receptor B1 and the tight junction proteins CLDN-1, -6, -9 and OCLN. The viral particle is next internalized through a clathrin-dependent endocytosis. Finally, fusion at low pH occurs between viral and endosomal membranes leading to the release of the capsid into the cytoplasm. Among cellular factors involved in HCV entry, two members of the tetraspanin superfamily were identified, CD81 and CD63. Tetraspanins are transmembrane proteins able to organize themselves in tetraspanin-enriched microdomains through tetraspanin-tetraspanin interactions and interactions with partner proteins. We tested the involvement in HCV entry of tetraspanins expressed in hepatocytes. Interestingly, we showed that CD151 is also involved in HCV entry. CD151 seems to play an indirect role in HCV entry through regulating membrane organization, especially by preventing CD81 clustering, which is unfavourable to HCV entry. We also studied the effect of some entry factors polymorphisms on viral entry. In a cohort of drug users infected by HIV but not by HCV, we identified two mutations, R209Q in CLDN-6 and P24A in OCLN, not found in control or coinfected patients. It is very rare for drug users patients infected by HIV not to be infected by HCV, suggesting a natural resistance of these patients to HCV infection. We hypothesized that the two mutations identified might impair HCV entry. However, the characterization of these mutations showed that they did not have a functional effect in vitro. Finally, we investigated the effect of Monensin, a polyether ionophore, on viral entry. This molecule increases endosomal pH through its ions transfer properties across cell membranes. We showed that Monensin inhibits HCV entry through impairing the fusion step. Interestingly, HCV cell-to-cell transmission, another poorly characterized entry pathway, was also blocked by Monensin, suggesting that a pH-dependent fusion step is also required for this transmission route. We generated resistant mutants to Monensin, notably the FL-8 mutant carrying two mutations in envelope glycoproteins, namely Y297H in E1 and I399T in E2. Viral particles expressing these two mutations infected cells in a pH-independent manner, displayed different biophysical properties and were not cell-to-cell transmitted. To conclude, these studies highlight the importance of membrane organization for viral entry through cell factors like CD151. We also pointed out that cell-to-cell transmission is a pH-dependent process. In addition, point mutations in E1 and E2 are sufficient to enable HCV to be pH-independent for its entry. However, polymorphisms in CLDN-6 and OCLN seem to have no effect on viral entry.

L'objectif de cette thèse, réalisée en collaboration avec la société Mérial, concerne la santé animale et s'oriente vers la synthèse de molécules actives à visée préventive ou thérapeutique. Deux sujets distincts sont abordés. Dans un premier temps, le but recherché est la synthèse d'une série de molécules présentant une activité anti-coccidienne pour le traitement préventif des poulets. Quarante-trois composés originaux, issus d'une synthèse courte à deux ou trois étapes, ont été préparés par hémi-synthèse de la monensine. Quinze molécules ont été testées in vitro et trois d'entre elles montrent une activité importante vis-à-vis du parasite Eimeria tenella. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la synthèse de nouveaux répulsifs pour un large panel d'insectes. Après avoir fait une étude bibliographique approfondie, nos recherches se sont concentrées sur la réactivité de la coumarine. Environ soixante-dix molécules ont été synthétisées par modifications fonctionnelles des 4-, 6- et 7- hydroxycoumarines et de la coumarine. La grande majorité a été testée en présence de drosophiles. Six molécules présentant une activité répulsive équivalente à celle du DEET, produit de référence, ont été identifiées

L’objectif de cette thèse, réalisée en collaboration avec la société Mérial, concerne la santé animale et s’oriente vers la synthèse de molécules actives à visée préventive ou thérapeutique. Deux sujets distincts sont abordés. Dans un premier temps, le but recherché est la synthèse d’une série de molécules présentant une activité anti-coccidienne pour le traitement préventif des poulets. Quarante-trois composés originaux, issus d’une synthèse courte à deux ou trois étapes, ont été préparés par hémi-synthèse de la monensine. Quinze molécules ont été testées in vitro et trois d’entre elles montrent une activité importante vis-à-vis du parasite Eimeria tenella. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la synthèse de nouveaux répulsifs pour un large panel d’insectes. Après avoir fait une étude bibliographique approfondie, nos recherches se sont concentrées sur la réactivité de la coumarine. Environ soixante-dix molécules ont été synthétisées par modifications fonctionnelles des 4-, 6- et 7- hydroxycoumarines et de la coumarine. La grande majorité a été testée en présence de drosophiles. Six molécules présentant une activité répulsive équivalente à celle du DEET, produit de référence, ont été identifiées / This thesis was completed in collaboration with the Animal Health Company Merial. The objective of the thesis is the synthesis of preventive and therapeutic bioactive molecules. Two separate subjects were treated. First, the aim was the synthesis of a series of molecules having an anticoccidial activity for the preventive treatment of chickens. Forty-three original compounds, issued from a short synthesis with two or three steps, were prepared from monensin by hemi-synthesis. Among them, fifteen were tested in vitro and three of them showed a significant activity against Eimeria tenella. Thereafter, we have worked on the synthesis of new repellents for a wide range of insects. After a comprehensive bibliographic study, our research was focused on the coumarin reactivity. More than seventy molecules were synthesized by structural modifications of 4-, 6- and 7-hydroxycoumarins and of coumarin. Almost all the compounds were tested in the presence of drosophila. Six molecules showing a repellent activity equivalent to DEET, used as a reference product, were identified