Les vaccins ont été l'un des succès les plus spectaculaires de la médecine depuis les travaux révolutionnaires d'Edouard Jenner (1749-1823) et Louis Pasteur (1822-1895). L'approche traditionnelle de conception de vaccins, reposant principalement sur l'inoculation de pathogènes inactivés ou atténués, ne peut plus répondre aux besoins actuels en vaccinologie. En effet, l'émergence de nouveaux pathogènes (VIH, VHC) a poussé les scientifiques à raffiner leur approche en identifiant des nouvelles cibles immunoprotectrices (épitopes) et en inventant des nouveaux modes de présentation de ces cibles au système immunitaire. Ceux-ci ont pour objectif d'augmenter l'immunogénicité de cibles qui souvent sont peu immunogènes en raison de leur faible durée de vie dans l'organisme. Dans ce contexte, les pseudovirions (PV) constitués d'une protéine structurale capable de se multimériser et mimer l'organisation hautement répétitive d'un virus sauvage, sont des modes de présentation prometteurs. L'objectif de mon doctorat a été d'étudier et caractériser le potentiel d'un de ces pseudovirions formé à partir des nucléocapsides du virus de la Mosaïque de la Papaye (PapMV). Dans un premier temps, les résultats ont montré que les PV de PapMV sont capables d'induire in vivo une forte réponse humorale contre un épitope du VHC présenté à surface en de nombreuses copies. Cette réponse humorale est diversifiée (Th1/Th2), de longue durée, et entièrement dépendante du niveau de multimérisation de la nucléocapside. En effet, la nucléocapside mutée, présentant le même épitope et incapable de s'assembler en pseudovirion, perd toute immunogénicité. Dans un second temps, il a été démontré que les PV de PapMV présentant un épitope hautement conservé d'influenza (M2) sont capables de fournir une protection partielle in vivo contre une infection virale. Cette protection peut être améliorée de façon très importante si les PV de PapMV (PapMVCP-M2) sont adjuvantés avec des PV de PapMV sans fusion (PapMVCP). Ces résultats soulignent la nature versatile des PV de PapMV, pouvant être utilisés à la fois comme système de présentation d'épitopes mais aussi comme adjuvant. En outre, des expériences ont démontré que les modes de purification des PV pouvaient influer sur l'immunogénicité des PV de PapMVCP-M2. L'ensemble de ces résultats, associés à des études montrant l'efficacité des PV de PapMV pour induire une réponse cellulaire (LCT) protectrice, font des PV de PapMV un outil hautement attractif pour la conception des vaccins modernes.

La surface externe du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) a été caractérisée par deux approches différentes : biochimique et immunologique. Sept régions ont été identifiées. Trois régions de surface (les extrémités N- et C-terminales, ainsi que la région 117 à 136) peuvent être considérées comme étant dominantes puisqu’elles ont été ciblées par les deux approches. Les régions 141-152, 173-184, 189-200 et 205-215 ont été révélées par l’approche immunologique seulement. De plus, un criblage de l’épitope HA11 du virus de l’Influenza à plusieurs sites a permis de valider le potentiel du PapMV à présenter des épitopes en surface. Les extrémités N- et C-terminales et la position 187 supportent l’insertion du peptide HA11 à la surface. Seulement la fusion à l’extrémité N-terminal en position 12 donne des particules stables à température corporelle des animaux et permettent de lever une réponse immunitaire contre le peptide HA11. Donc, la stabilité des nanoparticules est essentielle à l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. / Surface-exposed regions of Papaya Mosaic Virus (PapMV) were evaluated by two different methods: immunoblot assay and chemical modifications followed by mass spectrometry. Three regions were targeted by both techniques: the N- and C-termini and region 125-136. These regions are therefore considered to be major surface epitopes. Four other regions were only detected by the immunological technique: regions 117-128, 141-152, 173-184 and 189-200. Sites of fusion using the Influenza virus HA11 peptide were evaluated on the PapMV vaccine platform. Fusions of HA11 at three functional sites located after amino acids 12 and 187 and at the C-terminus led to the production of PapMV particles. It was successfully demonstrated that the HA11 epitope was located at the surface of the particles. The stability and immunogenicity of the nanoparticles were evaluated, and a direct correlation was established between the stability of the particles and their ability to trigger an efficient immune response against HA11.

La protéine de capside du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV CP) s’assemble autour d’un ARN simple brin pour former des nanoparticules. Nous avons montré que ces nanoparticules peuvent être fusionnées à des épitopes peptidiques permettant le développement d’une réponse immunitaire protectrice. Le C-terminal de la protéine a été utilisé comme site de fusion dans nos études précédentes. Récemment, nous avons découvert que des fusions après le résidu 12 ou 187 de la CP démontrent aussi un potentiel pour fusionner les épitopes d’intérêt. Le but de ce projet de recherche est de déterminer la capacité d’induire une réponse cellulaire en utilisant des nanoparticules PapMV CP fusionnées à un épitope cellulaire sur différents sites de fusion. L’immunisation de souris avec les particules recombinantes a permis de démontrer qu’une fusion au N-terminus était plus efficace pour induire la prolifération des lymphocytes T CD8+ spécifiques. De plus, les résultats révèlent que la multimérisation de la CP sous forme de nanoparticules est un critère requis pour induire une réponse cellulaire.

Les paysages français sont de plus en plus soumis aux pressions anthropiques. Ces pressions engendrent des modifications de la qualité et de la configuration des habitats, y compris forestiers, et ont des effets sur les plantes. Cette thèse aborde le rôle de la composition et de la configuration de la mosaïque paysagère extra- et intra-forestière sur la diversité de la flore en forêt. Il s'appuie sur 1932 relevés de l'Inventaire Forestier National répartis dans 19 départements de la moitié nord de la France. Les indices paysagers ont été calculés à partir de fonds cartographiques et d'images aériennes photo-interprétées. L'étude de terrain a été consacrée à la portée de l'effet d'un élément linéaire particulier du paysage : la route forestière. Le paysage a un effet important au-delà de la qualité de l'habitat local. La flore répond à trois principaux gradients paysagers : le premier est lié à la nature forestière ou non forestière du paysage, le second à la présence de coupes et peuplements jeunes, et le dernier reflète la composition en essences (feuillus ou résineux). L'effet des ouvertures paysagères (extra-forestière cultivée, coupe, peuplement jeune) sur la flore passe par la quantité, et surtout le nombre de taches et la longueur d'interfaces. Cet effet est positif sur la plupart des espèces, ce qui confirme le rôle des ouvertures dans le maintien de la diversité floristique. Les traits des espèces discriminés sont l'épi-zoochorie et l'anémochorie, la masse x longueur des semences et certaines stratégies de Grime. Ce travail montre qu'il est primordial d'appréhender le paysage sur un rayon de plus d'1 km. En comparaison, la route a un faible impact sur la flore, et plus souvent un effet positif que négatif. Les mécanismes sous-jacents à l'influence du paysage sont discutés à la lumière d'un effet temporel sur les plantes. Les implications pour la gestion des habitats en faveur de la biodiversité sont abordées. / French landscapes are submitted to increasing anthropogenic pressures. These pressures can affect plant species diversity by modifying the quality and spatial configuration of habitats, including forest habitats. This project addressed the role of the composition and configuration of the forest and non forest landscape mosaic on forest plant diversity. It was based on 1932 plots from the National Forest Inventory located in 19 "départements" of Northern France. Landscape indices such as fragmentation were measured or calculated from aerial photographs and existing national forest maps. A specific field study was devoted to analyse the depth of the effect of a particular linear landscape feature: the forest road. Landscape patterns had a significant impact in addition to local habitat quality. Plant composition was influenced by three main landscape gradients: (1) forest or non-forest habitat, (2) presence of fellings and young stands and (3) species composition (broadleaves or coniferous). The openings in the surrounding landscape (agricultural lands, forest felling and young stands) had an effect on plants through their quantity, number of patches and edge length. This effect was positive for most species, which confirms the role of the openings in maintaining plant diversity. The species traits discriminated were epi-zoochory and anemochory, mass x length of seeds and some Grime adaptive strategies. This work also underlined the importance to analyse landscape pattern effect within a buffer zone of more than 1 km around the plots. In contrast, we found that forest roads had a short depth of edge influence on plants (< 5 m) and road effect was more often positive than negative. The mechanisms underlying the influence of landscape mosaic are discussed in light of a temporal effect on plants. The implications for habitat and forest management to protect biodiversity are presented.

La stimulation de la réponse immunitaire dans les poumons est d’intérêt majeur pour la prévention des infections respiratoires. Nous avons démontré précédemment que les nanoparticules du virus de la mosaïque papaye (PapMV) augmentent les réponses immunitaires spécifiques contre des antigènes et induisent une activation systémique de l’immunité innée. Dans cette étude, l’accumulation d’IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 et IP-10 et le recrutement de neutrophiles, de monocytes/macrophages et de lymphocytes dans les poumons de souris a permis de démontrer la capacité des nanoparticules du PapMV à stimuler l'immunité innée pulmonaire. De plus, cette stimulation est suffisante pour protéger des souris contre une infection létale au virus influenza en absence d’antigènes spécifiques du virus. Ces résultats suggèrent que les nanoparticules du PapMV stimulent efficacement l'immunité innée des muqueuses en établissant un état antimicrobien, et renforcent leur potentiel comme adjuvant mucosal. / Stimulation of immune responses in the lungs is one of the most effective ways to prevent respiratory infections. We previously demonstrated that papaya mosaic virus (PapMV) nanoparticles can increase specific immune responses towards antigens and can induce systemic activation of the innate immunity. In this study, the accumulation of IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 and IP-10 followed by the recruitment of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes in the lungs of mice demonstrated the ability of PapMV nanoparticles to stimulate lung innate immunity. In addition, this stimulation was sufficient to protect mice against a lethal influenza virus challenge in the absence of specific antigens. These results suggest that PapMV nanoparticles efficiently stimulate mucosal innate immunity and therefore are promising candidates to establish a non-specific antimicrobial state at mucosal surfaces. Moreover, these data strengthen the potential of PapMV nanoparticles as a mucosal adjuvant.

Le Virus de la Mosaïque de la Papaye (PapMV) est un virus filamenteux flexible. Sa protéine structurale, la capside (CP), est composée de 215 acides aminés. Le but du projet est de déterminer les domaines de la CP du PapMV impliqués dans l'assemblage viral. En utilisant un système d'auto-assemblage dans E. coli, nous avons confirmé que l'extrémité C-terminale de la CP est exposée à la surface des pseudo nucléocapsides virales (PNVs) et que la partie N-terminale est impliquée dans la multimérisation de la protéine. De plus, nous avons identifié les acides aminés importants dans l'interaction avec l'ARN. Les résidus cystéine de la CP sont importants à la stabilité de la protéine et à sa capacité à former des PNVs. La mutation de la Glu128 en alanine a permis d'augmenter l'efficacité de l'auto-assemblage en PNVs. Il s'agit d'un travail original et unique chez les virus filamenteux du genre potexvirus.

La vaccination demeure à ce jour le moyen le plus efficace dans la prévention et le contrôle de maladies infectieuses. Les nanoparticules du PapMV ont été efficacement utilisées comme plateforme vaccinale permettant l’augmentation de l’immunogénicité d’antigènes. Bien que ces nanoparticules aient démontré un grand potentiel, la fusion d’antigène directement dans l’ORF de la protéine de capside (CP) peut nuire à sa capacité d’autoassemblage en nanoparticules. Nous avons développé une nouvelle méthode de modification du PapMV basé sur l’utilisation de la transpeptidase bactérienne sortase A (SrtA) permettant la conjugaison d’antigènes directement sur les nanoparticules post-assemblage. La SrtA a permis la conjugaison de longs antigènes (M2e et T20) sans affecter l’intégrité structurale et immunologique des nanoparticules. Ces nanoparticules ont induit de fortes réponses humorales spécifiques aux antigènes et ont induit une protection complète contre une infection à l’influenza chez les souris vaccinées avec PapMV-SrtA-M2e. La plateforme PapMV-SrtA permet l’ingénierie facile et rapide de nouveaux vaccins. / Vaccination remains to date the most effective intervention in the prevention and control of infectious diseases. PapMV nanoparticles have shown to be an efficient vaccine platform to increase antigens immunogenicity. While they have shown great potential, the insertion of antigens in the open reading frame (ORF) of the coat protein (CP) can affect its capacity to assemble into nanoparticles. We developed a new method to modify PapMV nanoparticles based on the use of bacterial transpeptidase sortase A (SrtA) to attach antigens directly onto assembled nanoparticles. SrtA attached long antigenic peptides (M2e and T20) onto PapMV nanoparticles without affecting their structural of immunological integrity. These nanoparticles induced strong antigen specific antibodies and fully protected PapMV-SrtA-M2e vaccinated mice against an influenza challenge. The use of the PapMV-SrtA platform will enable the faster and easier development of new vaccines.

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Deux souches parmi 338 rhizobactéries isolées à partir d'un substrat de bagasse de sisal, un résidu dérivé de l'extraction de la fibre des feuilles de sisal (une plante textile), ont été capables de réduire les dommages causés par le virus de la mosaïque du tabac (TMV) et le virus de la mosaïque de la tomate (ToMV) en favorisant la croissance de la partie aérienne chez les plants infectés de tabac et de la tomate cultivés en serre. Les racines des plants de tabac et tomate inoculés avec un mélange de Bacillus benzoevorans 17B2BAC101 et Ralstonia sp. 18B2BAC101 ont augmenté de 11 à 19 % le poids de la matière sèche de la partie aérienne (MSPA) des plants un mois après l'inoculation. Le traitement a augmenté aussi le contenu du tissu végétal en N, P, K, Ca et Mg dans l'essai en serre. Le test DASELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) pratiqué un mois après l'inoculation du virus chez la tomate a montré que le mouvement systémique du virus se produisait chez les plantes inoculées ou non inoculées avec des bactéries, ce qui a exclu la possibilité d'une induction de résistance systémique (1RS) comme étant le mécanisme qui favorise la croissance des plantes. Chez la tomate saine (sans virus) l'inoculation avec B. benzoevorans a augmenté de 36% le rendement de la matière sèche de la partie aérienne (MSPA) dans un essai en pot. En sachets de croissance, l'augmentation de la matière fraîche de la partie aérienne (MFPA) des plants variait de 48 à 86% lors des deux essais effectués. Dans l'essai en pot (sans virus), le contenu en K, Ca et Fe du tissu végétal a augmenté significativement en présence de B. benzoevorans. Le traitement avec Ralstonia sp. a augmenté aussi de 32% la MSPA dans l'essai en pots et de 96 et 7% la MFPA dans les essais en sachets. Lorsque ces deux bactéries ont été mélangées et inoculées sur la tomate en absence de virus, la biomasse aérienne a diminué par rapport au traitement avec B. benzoevorans. Des études microscopiques du système racinaire ont permis observer une augmentation de 24 et 70% de la densité et de la longueur des poils racinaires respectivement, des plantes traitées avec B. benzoevorans et avec un mélange de cette bactérie et de Ralstonia sp. Cette dernière bactérie inoculée a augmenté de 10% la densité des poils absorbants, mais ce résultat n'a pas été significatif. Bacillus benzoevorans produit de l'acide indole-acétique (AIA) et de l'isopentenyladenosine (IPA) in vitro aux concentrations de 3,92 ug mL-1 et 5 picomoles mL-1 respectivement. Ralstonia sp. produit 0,52 ug mL"1 et 3,5 picomoles mL"1 des mêmes phytohormones, respectivement Ces régulateurs de croissance végétale produits par les bactéries dans la rhizosphère ont probablement favorisé la croissance des plantes traitées avec ces microorganismes. L'AIA aurait vraisemblablement favorisé le développement des poils racinaires, en augmentant de cette manière l'absorption d'eau et de nutriments par les plantes. En général, B. benzoevorans favorise davantage que Ralstonia sp. la croissance des plantes probablement à cause de sa capacité à produire plus des phytohormones. Les densités d'inoculation les plus favorables à la plante étaient de 106 - 107 cfu mL"1 chez B. benzoevorans et de 107 - 108 cfu mL pour Ralstonia sp. Une autre rhizobactérie isolée à partir du même type de sol, Rhizobium sp. 12B4PEN78 a produit 15,34 \xg mL"1 d'AIA en favorisant la croissance de la tomate lorsque la densité de l'inoculum est de 107 - 108 cfu mL"1 . / Two strains among 338 rhizobacteria isolated from a substrate originated from sisal bagasse, a by-product of the extraction process of the fibre from leaves of sisal (Agave fourcroydes), a textile plant, reduced damages caused by tobacco mosaic virus (TMV) and tomato mosaic virus (ToMV) by enhancing plant growth in greenhouse pot cultures. Bacillus benzoevorans 17B2BAC101 and Ralstonia sp. 18B2BAC101 inoculated as a mixture increased shoot dry weight (SDW) between 11 and 19% one month after virus inoculation. They also increased tomato plant tissue content in N, P, K, Ca and Mg. DASELISA tests performed one month after virus inoculation on tomato, showed systemic movement of ToMV in the plant, ruling out induced systemic resistance (ISR) as the mechanism by which these bacteria enhance plant growth. When applied individually and in the absence of the virus, B. benzoevorans increased SDW by 36% in a pot assay and shoot fresh weight (SFW) by 48 and 86% in two growth pouch assays. This rhizobacterium also increased the K, Ca and Fe content in plant tissue in the pot assay without virus. Ralstonia sp. increased SDW by 32% in the pot assay, and 96 and 7% SFW in the growth pouch assays. When these two rhizobacteria were co-inoculated in absence of the virus in a growth pouch assay, the shoot biomass decreased when compared with plants inoculated with only B. benzoevorans. Microscopic studies of the root Systems showed an increase of 24 and 70% in the root hair density and root length respectively, on tomato plants treated either with B. benzoevorans or with a mixture of B. benzoevorans and Ralstonia sp. This last bacterium inoculated alone increased the root hair density by only 10% (which was not statistically significant). B. benzoevorans produced indole-acetic acid (IAA) and isopentenyl adenosine (IPA) in vitro at concentrations of 3.92 \ag mL"1 and 5 picomoles mL"1 respectively. Ralstonia sp. produced 0.52 ug mL"1 and 3.5 picomoles mL"1 of these two plant growth regulators. It is possible that bacterial phytohormones are responsible for the enhanced plant growth observed in our experiments. It is also likely that IAA in the rhizosphere has stimulated root hair development, thus increasing the uptake of water and nutrients by the plants. In general, B. benzoevorans enhanced plant growth to a greater extent than Ralstonia sp. which correlated with the observed higher levels of phytohormones production by the former strain. The better plant growth stimulation effects were observed at inoculum densities of 106 - 107 cfu mL"1 for B. benzoevorans and 107 - 108 cfu mL for Ralstonia sp. Another bacterium isolated from the same type of soil, Rhizobium sp. 12B4PEN78 produced 15.34 ^ig mL"1 of IAA and increased shoot growth on tomato when inoculated at 107 - 108 cfu mL.

Cette thèse traite de trois modèles de géométrie aléatoire: les mosaïques de Poisson-Voronoi, les mosaïques poissoniennes d'hyperplans et le modèle de fissuration unidirectionnel de Rényi-Widom. Nous montrons tout d'abord l'équivalence entre les deux approches historiques pour l'étude statistique des mosaïques: la convergence des moyennes ergodiques et la définition au sens de Palm de la cellule typique. Nous donnons ensuite en dimension deux la loi du nombre de sommets de la cellule typique et conditionnellement à ce nombre, les lois des positions des frontières, de l'aire et du périmètre. De plus, nous explicitons la loi conjointe des rayons des disques centrés en l'origine inscrit dans (resp. circonscrit à) la cellule typique et nous en déduisons le caractère circulaire des "grandes cellules". Dans le cas Poisson-Voronoi, nous relions en toute dimension la fonction spectrale de la cellule typique au pont brownien, ce qui permet en particulier d'estimer asymptotiquement la loi de la première valeur propre en dimension deux. Dans le cas des mosaïques poissoniennes d'hyperplans, nous exploitons les techniques de Palm pour en déduire une construction explicite en toute dimension de la cellule typique à partir de sa boule inscrite et de son simplexe circonscrit. Une preuve rigoureuse d'un résultat de R. E. Miles lorsqu'on épaissit les hyperplans est également donnée. Par ailleurs, nous modélisons un phénomène de fissuration par un processus unidimensionnel stationnaire dont nous calculons la loi de la distance inter-fissures typique. Nous montrons en outre que les points successifs sont ceux d'un processus de renouvellement conditionné explicite.