L'acquisition et le maintien de la forme bactérienne ont été consciencieusement étudiés pendant une très longue période. Néanmoins, il reste encore beaucoup de questions sans réponse. Les bactéries Gram-positives présentent une couche externe rigide (la paroi cellulaire) qui permet de préserver la pression osmotique interne et la morphologie cellulaire. La paroi cellulaire (CW) est principalement formée par un maillage de polymères de sucres, le peptidoglycane (PG), sur lequel sont accrochés des acides téichoïques. L'absence de cette barrière essentielle provoque la perte de forme et, finalement, la lyse de la cellule. L’intégrité du CW est par conséquent d'une importance vitale pour les bactéries. La structure ainsi que la synthèse correcte du CW dépendent de supposées machineries d'élongation du peptidoglycane (PGEM) chargées d’assembler le réseau du PG. Le fonctionnement et la composition des PGEMs restent incertains, mais on sait qu’ils dépendent d’une protéine essentielle : MreB, une protéine procaryote similaire à l'actine. MreB est suspectée de contrôler l’activité et/ou l’assemblage des PGEMs, mais sa fonction exacte comme son mode de régulation sont actuellement inconnus. J’utilise Bacillus subtilis, le modèle des bactéries Gram-positives, pour mieux comprendre les fonctions de MreB via i- le développement et l’utilisation d’un criblage génétique pour l’identification de mutants de mreB non fonctionnels et ii- l'étude d'un effecteur potentiel de MreB.(i) MreB a été étudié pendant près de deux décennies et pourtant, sa (ses) fonction(s) reste(nt) mal comprise(s). Comme les approches biochimiques se sont révélées particulièrement difficiles jusqu'à présent, la plupart des études se sont concentrées sur la localisation cellulaire et la dynamique de la protéine. Au cours de mes travaux, j’ai conçu un criblage génétique au moyen duquel j’ai obtenu une collection de mutants de mreB fonctionnellement déficients, chez B. subtilis. La caractérisation de ces mutants a révélé de nombreux résidus importants pour le fonctionnement de la protéine. De façon intéressante, mes résultats indiquent que certains mutants ont conservé leurs propriétés dynamiques (suggérant une association fonctionnelle aux PGEMs) en plus d'une morphologie de type sauvage, tout en étant fortement affectés pour la croissance. Des résultats préliminaires indiquent que ces mutants sont compromis dans leur capacité à utiliser certaines sources de carbone, reliant MreB au métabolisme cellulaire. Ceci suggère l'existence soit d'un point de contrôle, soit d'un couplage entre le métabolisme du carbone et l'expansion du CW chez B. subtilis.(ii) Des résultats non publiés de notre groupe ont révélé l'existence d'un opéron non caractérisé (ydcFGH) dont l'expression est fortement induite en absence de MreB, par comparaison à la souche sauvage. J’ai 1- mis en évidence la cause probable de l’induction de cet opéron en l’absence de MreB, révélant ainsi l’existence de nombreuses mutations dans la souche MreB et 2- réalisé une caractérisation poussée de chaque gène de l'opéron ydcFGH. Bien que le lien exact entre MreB et ydcFGH soit encore inconnu, nos résultats suggèrent un rôle potentiel d’YdcH dans le contrôle du métabolisme du carbone et l'adaptation à la phase stationnaire. À la lumière de mes données issues du criblage génétique (i), ces résultats indiquent un lien fort entre MreB et le métabolisme du carbone. / Acquisition and maintenance of the bacterial shape has been conscientiously studied for a long time. Nevertheless, there are still many unanswered questions. Gram-positive bacteria present a rigid external coating (cell wall) that allows them to preserve internal osmotic pressure and cell morphology. The cell wall (CW) is mainly formed by the peptidoglycan meshwork (PG), that confers its structure to the CW, to which are connected teichoic acids. The absence of this essential barrier causes the loss of shape and, ultimately, lysis of the cells. Integrity of the CW is, therefore, a matter of vital importance for bacteria. Proper CW synthesis and structure depends on the so-called peptidoglycan elongation machineries (PGEM) in charge of building the PG meshwork. The precise composition and functioning of the PGEM is not completely understood but they rely on a key player: MreB, a conserved prokaryotic actin-like protein. MreB is suspected to control PGEM activity and/or assembly but its precise function and mode of regulation are currently unknown. I used Bacillus subtilis, the model for Gram-positive bacteria, to gain a better understanding of MreB functions via i- the development and use of a genetic screen for loss-of-function mutants of mreB and ii- the study of a potential effector of MreB.(i) MreB has been studied for almost two decades now and still, little is known about its function(s). Since biochemical approaches proved to be difficult so far, most of the studies have focused on cellular localization and dynamics of the protein. Here, I have designed a genetic screen by means of which I have obtained a collection of functionally impaired mreB mutants in B. subtilis. Characterization of these mutants revealed numerous key residues for the functioning of the protein. Interestingly, my results indicate that some mutants have kept their dynamic properties (suggesting functional association to the PGEM) together with a wild type shape, while being strongly affected for growth. Preliminary results indicate an impaired ability to use certain carbon sources linking MreB to cellular metabolism. This suggests the existence of either a checkpoint or a coupling between carbon metabolism and CW expansion in B. subtilis.(ii) Unpublished results from our group revealed the existence of an uncharacterized operon (ydcFGH), whose expression is highly induced in the absence of MreB by comparison to the wild type. I have 1- deciphered the cause of ydcFGH induction in the absence of MreB, revealing the existence of multiple mutations in the MreB strain and 2- realized a thorough characterization of each gene of the ydcFGH operon. Although the exact link between MreB and ydcFGH is yet unknown, my results suggest a potential role of YdcH in the control of carbon metabolism and adaptation to stationary phase. In light of my mutagenesis screen data (i), these results are pointing towards a strong link between MreB and carbon metabolism.

La protéine de fonction inconnue, YvcK, est vitale chez Staphylococcus aureus mais non essentielle chez les bactéries modèles Bacillus subtilis ou Escherichia coli. Chez B. subtilis, les bactéries délétées du gène yvcK, sont sérieusement affectées dans leur croissance et leur morphologie dans des conditions de croissance gluconéogéniques. Les défauts observés peuvent être compensés par l’ajout de fortes concentrations de magnésium ou par l’inactivation de gènes impliqués dans le métabolisme. Ceci suggère que, les mutants yvcK présentent des altérations au niveau de la paroi bactérienne qui sont probablement dues à un désordre du métabolisme. Le phénotype lié à l’absence d’YvcK est similaire à celui observé chez des souches mutées au niveau de gènes impliqués dans la synthèse du peptidoglycane ou constituant le cytosquelette. La protéine MreB, composant majeur du cytosquelette bactérien, forme une structure hélicoïdale sous la membrane cytoplasmique pour positionner les enzymes de synthèse et la maturation du peptidoglycane. In vivo, la protéine YvcK est également localisée sous la forme d’une hélice. Par ailleurs, la surexpression de YvcK supprime le défaut de morphologie du mutant mreB et vice versa. Il a été montré que, chez B. subtilis, la localisation de la protéine membranaire PBP1 était dépendante de MreB. Une délétion de ponA, gène codant pour PBP1, rétablit la viabilité d’un mutant mreB et celle du mutant yvcK dans des conditions de croissance gluconéogéniques. La protéine de fusion GFP-PBP1 dans une souche délétée du gène yvcK, cultivée en milieu liquide CE-gluconate est délocalisée expliquant le gonflement des cellules. Ce résultat suggère que la localisation normale de PBP1 au septum due à la surproduction de YvcK dans un mutant mreB (et réciproquement) permet la restauration de la croissance et de la morphologie. De plus, nous avons montré que, comme son homologue présent chez Mycobacterium tuberculosis, YvcK est phosphorylée in vitro. Nous avons caractérisé la phosphorylation d’YvcK par la protéine kinase PrkC et nous avons identifié la Thr 304 comme site unique de phosphorylation. Cette phosphorylation semblerait jouer un rôle important dans la complémentation du mutant mreB et du repositionnement de la PBP1. / The YvcK protein is a bacterial conserved protein of unknown function. It is essential in Staphylococcus aureus but not essential in both Bacillus subtilis and Escherichia coli. In B. subtilis, inactivation of the yvcK gene seriously affects growth and morphology on neoglucogenic carbon sources. The defects observed in a yvcK mutant can be offset by the addition of high concentrations of magnesium or by inactivation of genes involved in metabolism. This suggests that, when grown on some carbon sources, yvcK mutants display alterations in their cell wall probably due to a disorder in this metabolism. The phenotype associated with the absence of YvcK is similar to that observed with strains mutated in genes involved in peptidoglycan synthesis or encoding proteins of the cytoskeleton. The major component of cytoskeleton, MreB, an actin-like protein, together with other proteins, forms a helical structure at the cell membrane that participates in the organization and positioning of the enzymes of peptidoglycan synthesis and maturation. We showed that YvcK is organized as a helical like pattern localized near the inner surface of the membrane, independently of the presence of MreB. Surprisingly and despite that these two proteins do not harbour any similarity of sequence or structure, an overproduction of YvcK restored a normal morphology in an mreB mutant strain and vice versa. Furthermore, as already observed for the mreB mutant, in a yvcK mutant strain, the penicillin-binding protein PBP1 is delocalized and deletion of its gene restores growth of a yvcK mutant on gluconate medium. All these results suggest that YvcK is not only involved in the synthesis of cell wall from gluconeogenic carbon sources but also plays a role in cell morphogenesis. In addition, we have shown that similarily to its Mycobacterium tuberculosis homolog, YvcK is phosphorylated in vitro. We have characterized the phosphorylation of YvcK by the protein kinase PrkC and we identified the Thr 304 as the single phosphorylation site. Furthermore, this phosphorylation appears to play an important role in the complementation of the mreB mutant and repositioning of PBP1.

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The discovery of the prokaryotic cytoskeleton has revolutionized our thinking about spatial organisation in prokaryotes. However, the roles different bacterial cytoskeletal proteins play in the localisations of diverse biomolecules are controversial. Bacterial chemotaxis depends on signalling through large protein clusters and each cell must inherit a cluster on cytokinesis. In Escherichia coli the membrane chemosensory clusters are polar and new static clusters form at pre-cytokinetic sites, ensuring positioning at new poles after cytokinesis and suggesting a role for the bacterial FtsZ and MreB cytoskeletons. Rhodobacter sphaeroides has both polar, membrane-associated and cytoplasmic, chromosome-associated chemosensory clusters. This study sought to investigate the roles of FtsZ and MreB in the partitioning of the two chemosensory clusters in R. sphaeroides. The relative positioning between the two chemosensory systems, FtsZ and MreB in R. sphaeroides cells during the cell cycle was monitored using fluorescence microscopy. FtsZ forms polar spots after cytokinesis, which redistribute to the midcell forming nodes from which gradients of FtsZ extend circumferentially to form the Z-ring. The proposed node-precursor model might represent a common mechanism for the formation of cytokinetic rings. The MreB cytoskeleton continuously reorganizes between patchy and filamentous structures, and colocalises with FtsZ at midcell. Membrane chemosensory proteins form individual dynamic unit-clusters with mature clusters containing about 1000 CheW₃ proteins. These unit-clusters diffuse randomly within the membrane but have a higher propensity for curved regions like cell poles. Membrane clusters do not colocalise with FtsZ and MreB and appear excluded from the Z-ring vicinity. The bipolar localisation of membrane clusters is established after cell division via random diffusion and polar trapping of clusters. The cytoplasmic chemosensory clusters colocalise with FtsZ at midcell in new-born cells. Before cytokinesis one cluster moves to a daughter cell, followed by the second moving to the other cell. FtsZ and MreB do not participate in the positioning of cytoplasmic clusters. Therefore the two homologous chemosensory clusters use different mechanisms to ensure partitioning, and neither system utilizes FtsZ or MreB for positioning.

Myxococcus Xanthus possède un cycle developpemental multicellulaire entièrement sous la dépendance de la capacité des cellules à se déplacer sur des surfaces solides. M. xanthus possède deux systèmes de motilité génétiquement séparé, une motilité Sociale dépendant des pili de Type IV et une motilité Aventurière dont le mécanisme est encore peu compris. Notre hypothèse de travail est que la motilité Aventurière est qu’en des points régulièrement répartis le long du corps cellulaire soient couplés adhésion et traction de ce corps par une interaction entre des moteurs moléculaire et le cytosquelette d’Actine bactérienne MreB. Mon projet est de caractériser la relation qu’il pourrait y avoir entre le cytosquelette et les points d’adhésion durant la motilité. Pour étudier l’implication du cytosquelette MreB durant le mouvement, nous avons utilisé une approche pharmaceutique utilisant l’A22, une drogue permettant la dépolymérisation rapide et spécifique du cytosquelette sans affecter la viabilité des cellules à court terme. De plus j’ai aussi étudier les interactions possible entre MreB et différentes protéines de motilité comme la petite GTPase MglA, qui est connue pour est essentielle au recrutement des machineries de motilité. / Myxococcus xanthus has a multicellular developmental cycle which is dependent on the capacity of the cells to move accross solid surfaces. M. xanthus uses two motility systems: Social motility system is dependent on Type-IV pili, and the Adventurous motility system, the mechanism of which is poorly understood. Our working hypothesis is that Adventurous motility is performed by adhesion points localized along the cell body where a molecular machinery pulls the cell body by interacting with the MreB cytoskeleton. My project aims to characterize the relationship between the adhesion points and the cytoskeleton during movement. To study the involvement of MreB during motility we use A22, a drug known to rapidly and specifically depolymerise in live microscopy assays. Furthermore, I have study also the interactions between MreB and differents proteins like MglA a small GTPase, which we belive is essential for the recruitment of the machineries.