Einleitung: Die Tendinopathie der Oberflächlichen Beugesehne (OBS) ist eine häufig auftretende orthopädische Erkrankung beim Pferd, die meist zu einer langfristigen oder sogar endgültigen Leistungsdepression führt. Bisher besteht kein therapeutischer Goldstandard, jedoch wird die Therapie mit multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) als aussichtsreich erachtet. Der Verbleib und der Wirkmechanismus dieser Zellen nach lokaler Applikation sind nicht hinreichend bekannt. Eine kombinierte Markierung der MSC mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (SPIO) und dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B ermöglicht die Analyse der Biodistribution mit Hilfe von Magnetresonanztomographie (MRT), histologischen und fluoreszenzbasierten Untersuchungen. Ziele: Wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der lokalen Distribution intraläsional applizierter MSC sowie die Untersuchung einer potentiellen systemischen Verteilung und gezielten Einwanderung in anderes geschädigtes Gewebe. Weiterhin sollte die Anwendung des Magic Angle- Effektes in der MRT bezüglich Durchführbarkeit an stehenden Pferden und Effektivität des Zelltrackings evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Bei 6 Pferden wurden im mittleren Teil der metakarpalen/-tarsalen OBS aller 4 Gliedmaßen Sehnenläsionen auf mechanisch-enzymatischem Wege induziert. Die für die Applikation aus Fettgewebe der Glutealregion gewonnenen, autologen MSC wurden mit Molday ION Rhodamine B (BioPAL, Inc., Worcester, USA) markiert. 3 Wochen nach Defektinduktion erfolgte die intraläsional Applikation der markierten MSC in die OBS einer Vorder- und einer Hintergliedmaße und Serum in die kontralateralen Kontrolldefekte. Im Zeitraum der Zellapplikation wurden mehrere venöse Blutproben durchflusszytometrisch auf Rhodamin B-positive Zellen hin untersucht. Insgesamt erfolgten 10 MRT-Untersuchungen der Vordergliedmaßen bis zur 24. Woche nach Zellapplikation in denen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen angefertigt wurden. Bis zur 3. Woche nach Zellapplikation erfolgten 4 Standard-MRT-Untersuchungen der Hintergliedmaßen. T1- und T2*- gewichtete Sequenzen dienten bei beiden Aufnahmetechniken der Beurteilung SPIO-bedingter hypointenser Artefakte. 3 Wochen nach der Zellapplikation wurden Biopsien aus den OBS der Hintergliedmaßen entnommen. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Entnahme von subkutanem Fett- und Muskelgewebe aus dem Bereich der Fettentnahmestelle und aus der unbeschädigten kontralateralen Glutealregion. 24 Wochen nach Zellapplikation wurden die Tiere euthanasiert und die OBS der Vordergliedmaßen entnommen. Alle Gewebeproben wurden histologisch (Preußisch Blau Färbung) und fluoreszenzbasiert (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) untersucht. Ergebnisse: SPIO-bedingte hypointense Artefakte waren über 24 Wochen in MRT-Aufnahmen der MSC-behandelten OBS vorhanden. Die Signalintensität war konstant niedrig, jedoch verringerte sich das Volumen der hypointensen Artefakte mit der Zeit. Diese ließ ein Abnehmen der Zahl markierter MSC vermuten, was in histologischen Analysen bestätigt wurde. Der Magic Angle-Effekt konnte in allen OBS der Vordergliedmaßen und zu allen Zeitpunkten erzeugt werden. Die Abgrenzbarkeit der hypointensen Artefakte gegenüber dem in Standard-MRT-Aufnahmen hypointensen gesunden Sehnengewebe erhöhte sich, jedoch gab es keine Unterschiede in der Volumenmessung der SPIO- bedingten hypointensen Artefakte zwischen Standard- und Magic Angle-Aufnahmen. Histologisch konnten intrazelluläre Preußisch Blau-positive Zellen in den MSC-behandelten und kontralateralen Sehnenläsionen sowie in anderem geschädigten Gewebe detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigten sich durch den Nachweis Rhodamin B-positiver Zellen. Durchflusszytometrische Untersuchungen von Blutproben zeigten, dass Rhodamin B-positive Zellen vor allem innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Zellapplikation im venösen Blut vorhanden waren. Die intraläsional applizierten MSC verblieben hauptsächlich in der behandelten Sehnenläsionen, welches durch das konstant niedrige Signal der Artefakte in der MRT und durch die Detektion markierter Zellen in entsprechenden histologischen Proben belegt wurde. Schlussfolgerung: Eine langfristige Verfolgung SPIO-markierter MSC ist in vivo im MRT durch beide Aufnahmetechniken möglich. Die Abgrenzbarkeit SPIO-bedingter hypointenser Artefakte kann durch den Magic Angle-Effekt erhöht werden. Allerdings ist die Sensitivität der Zellverfolgung in der MRT begrenzt und somit kann eine geringe Zellmigration nicht detektiert werden. Trotz der Hinweise auf eine systemische Verteilung und Migration der markierten Zellen in anderes geschädigtes Gewebe, verbleibt ein Großteil der markierten MSC nach der intraläsionalen Injektion in der behandelten OBS.

Belastungsinduzierte Sehnen- und Bandschäden, besonders die der Oberflächlichen Beugesehne, sind eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen bei Sportpferden. Die intraläsionale Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine vielversprechende Therapieoption zur Reduktion der Rezidivraten dar. Der Verbleib der applizierten Zellen und ihre Wirkungsmechanismen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die Magnetresonanztomografie (MRT) ist ein hervorragendes Werkzeug zur Erkennung von Sehnengewebsabnormalitäten im distalen Gliedmaßenbereich sowie zum Verfolgen injizierter Zellen. Mit superparamagnetischen Eisenoxid-Partikeln (Spio) markierte MSC werden in der MRT als hypointense Artefakte sichtbar. Gesunde Sehnen zeigen jedoch auch ein hypointenses Signal, wodurch es nicht möglich ist, markierte Zellen von physiologischem Sehnengewebe zu unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war die magnetresonanztomografische Darstellung Spio-markierter equiner MSC in unterschiedlichen Zellzahlen in equinem physiologischen Sehnengewebe mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes. In der vorliegenden Arbeit wurden equine MSC mit Spio-Partikeln (BioPal Molday ION Rhodamine B, Inc., Worcester, USA) markiert und in präparierte Schnittinzisionen, in zuvor entnommenen Oberflächlichen Beugesehnen von Kadaverbeinen,in unterschiedlichen Zellzahlen von 106, 105, 104 MSC injiziert. Anschließend erfolgte eine magnetresonanztomografische Untersuchung der Sehnenkonstrukte jeweils in einem 90° sowie 55° Winkel zum Hauptmagnetfeld B0 in drei Magnetresonanztomografen unterschiedlicher Feldstärken (0,27 T (Tesla), 3 T, 7 T). Dabei wurden jeweils T1- und T2*- gewichtete 3D-Gradientenechosequenzen genutzt. Im Anschluss erfolgte eine histologische Validierung der magnetresonanztomografischen Ergebnisse mittels Preußischblau-, Diamino-2-Phenylindol-Färbung (DAPI) und Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T konnte eine signifikante Zunahme der Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes (Konstruktwinkelung von 55° zum Hauptmagnetfeld B0) im Vergleich zur 90° Standardwinkelung verzeichnet werden (p < 0,05). Des Weiteren konnte die Ausprägung des Magic-Angle-Effektes im 3 T-Hochfeldsystem in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz als deutlicher beurteilt werden als im Niederfeldsystem (p < 0,05). Im 7 THochfeldsystem konnten keine signifikanten Unterschiede der Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in den unterschiedlichen Sequenzen und Winkelungen der Sehnenkonstrukte zum Hauptmagnetfeld B0 gefunden werden. Die Detektion einer Zellzahl von 106 markierten MSC war sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem und sowohl in der T1- als auch in der T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes sicher möglich (p < 0,05). Darüber hinaus konnte im Hochfeld-MRT 7 T ebenfalls eine Zellzahl von 104 markierten MSC visuell detektiert werden. Des Weiteren konnte im Nieder- sowie 3 THochfeldsystem bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein höheres Kontrast-Rausch-Verhältnis der T1-gewichteten Sequenzen beider Winkeltechniken gegenüber der T2*-gewichteten Sequenzen festgestellt werden. Darüber hinaus stellte sich das Kontrast-Rausch-Verhältnis beider Sequenzen mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes höher gegenüber der Standardwinkelung von 90° zum Hauptmagnetfeld B0 dar. Außerdem konnte mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein erhöhtes Kontrast-Rausch-Verhältnis in den T1- und T2*-gewichteten Sequenzen des 3 T-Hochfeldsystems gegenüber der Standardwinkelung und des Niederfeldsystems ermittelt werden. Des Weiteren konnte in beiden Systemen eine Erhöhung des Kontrast-Rausch-Verhältnisses mit steigender Zellzahl beobachtet werden. Außerdem zeigte die T1-gewichtete Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle- Effektes sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem das höchste Kontrast-Rausch-Verhältnis. Bei der qualitativen lichtmikroskopischen Auswertung der Preußischblau-gefärbten Proben konnte in allen Zellzahlen der Nachweis Preußischblau-positiver Strukturen erbracht werden. Der Großteil dieser positiven Strukturen war innerhalb spindelförmiger Zellen lokalisiert. Darüber hinaus konnte ein signifikant höheres Volumen Preußischblau-positiver MSC bei einer Zellzahl von 106 im Vergleich zu einer Zellzahl von 104 ermittelt werden (p <0,05). Des Weiteren konnte Fluoreszenzmikroskopisch in allen markierten Proben die Präsenz Rhodamin B-positiver Zellen entlang der Schnittinzisionen nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: Spio-markierte MSC sind in Abhängigkeit von ihrer Zellzahl im Nieder- und Hochfeld-MRT nachweisbar. Es ist eine Detektion ab einer Zellzahl von 105 im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T möglich. Des Weiteren ist die Visualisierung markierter MSC in einer Zellzahl von 104 in einem Hochfeld-MRT 7 T realisierbar. Darüber hinaus ist es mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes möglich Spio-markierte MSC in gesundem Sehnengewebe im Nieder- und Hochfeldsystem zu detektieren. Als besonders geeignet konnte aufgrund des höheren Kontrast-Rausch-Verhältnisses die T1-gewichtete Sequenz ermittelt werden. Die Technik dieser Studie kann für zukünftige in-vivo-Studien zur Biodistribution von MSC und dem longitudinalen Zelltracking im Organismus von großem Nutzen sein.:1 EINLEITUNG ................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT .............................................................................................. 3 2.1 Anatomie und Physiologie der Sehne am Beispiel der Oberflächlichen Beugesehne des Pferdes ......................................................................................... 3 2.1.1 Makroskopische Anatomie der Oberflächlichen Beugesehne .................................. 3 2.1.2 Struktureller Aufbau und mikroskopische Anatomie ................................................ 6 2.2 Sehnenerkrankungen ............................................................................................... 7 2.2.1 Allgemeines und Definition ...................................................................................... 7 2.2.2 Pathophysiologie ..................................................................................................... 9 2.2.3 Sehnenheilung .......................................................................................................12 2.2.4 Diagnostik von Sehnenerkrankungen .....................................................................14 2.2.5 Therapie .................................................................................................................17 2.3 Multipotente Mesenchymale Stromazellen ............................................................21 2.3.1 Allgemeines ...........................................................................................................21 2.3.2 Einsatz von MSC bei Erkrankungen der equinen Oberflächlichen Beugesehne .....23 2.3.3 Wirkmechanismus ..................................................................................................24 2.3.4 Longitudinales Zelltracking .....................................................................................25 2.4 Magnetresonanztomografie ....................................................................................28 2.4.1 Allgemeines ...........................................................................................................28 2.4.2 Physikalische Prinzipien .........................................................................................28 2.4.3 Relaxation ..............................................................................................................30 2.4.4 Bildkontrast ............................................................................................................31 2.4.5 Repetitionszeit ........................................................................................................32 2.4.6 Echozeit .................................................................................................................32 2.4.7 Darstellung von Sehnen und Bändern ....................................................................33 2.4.8 Magic-Angle-Effekt .................................................................................................34 2.4.9 Suszeptibilitätsartefakte .........................................................................................35 3 ZIELSTELLUNG UND HYPOTHESEN .........................................................................38 4 MATERIAL UND METHODEN ......................................................................................39 4.1 Übersicht Versuchsaufbau......................................................................................39 4.2 Isolation der MSC ....................................................................................................39 4.3 Zellaufbereitung .......................................................................................................40 4.3.1 Expansion der MSC ...............................................................................................41 4.3.2 Markierung der MSC ..............................................................................................41 5.6 Histologie .................................................................................................................77 5.6.1 Preußischblau-Färbung ..........................................................................................77 5.6.2 Vergleich der Volumen der Preußischblau-positiven Strukturen zum Volumen der hypointensen Artefakte im MR-Bild ........................................................................79 5.6.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................................84 5.6.4 Diamino-2-Phenylindol- (DAPI) -Färbung ...............................................................85 6 DISKUSSION ................................................................................................................87 6.1 Diskussion Material und Methodik .........................................................................87 6.1.1 Equine Oberflächliche Beugesehne .......................................................................87 6.1.2 Zellmarkierung und Zellviabilität .............................................................................87 6.1.3 Magnetresonanztomografie ....................................................................................88 6.1.4 Histologie ...............................................................................................................89 6.2 Diskussion Ergebnisse ...........................................................................................90 6.2.1 Magnetresonanztomografie ....................................................................................90 6.2.2 Histologie ...............................................................................................................95 6.3 Schlussfolgerung aus den Ergebnissen ................................................................95 7 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................96 8 SUMMARY....................................................................................................................98 9 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................ 100 ANHANG ........................................................................................................................... 115 DANKSAGUNG ................................................................................................................. 120

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Pluripotenz wird durch viele Stammzell-spezifische Transkriptionsfaktoren wie Oct3/4, Nanog und Sox2 sowie deren Funktion in ihrem regulatorischen Netzwerk etabliert und aufrechterhalten. Viele Studien haben gezeigt, wie diese Pluripotenz-assoziierten Faktoren ihre Zielgene regulieren. Dies geschieht durch die Interaktion mit bekannten und unbekannten Interaktionspartnern. In der vorliegenden Arbeit haben wir Zfp819 als einen neuen Pluripotenz-assoziierten Faktor beschrieben und dessen Funktion in pluripotenten Stammzellen untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit haben wir zwei cDNA-Banken für Yeast two Hybdrid (Y2H)-Assays aus unterschiedlichen pluripotenten Stammzelltypen generiert. Dies hatte zum Ziel, potentielle Interaktionspartner eines Kandidatenproteins zu identifizieren um dadurch Eindrücke über die Funktion des Proteins zu gewinnen. Für die Identifizierung von potentiellen Interaktionspartnern von Zfp819 haben wir die cDNA-Bank aus embryonalen Stammzellen benutzt. Wir konnten 17 putative Interaktionspartner identifizieren und daraus ein hypothetisches „Interaktom“ von Zfp819 generieren. Die Einordnung der putativen Interaktionspartner nach ihrer Gen-Ontologie (GO) ließ vermuten, dass Zfp819 eine Rolle in der Regulation der Transkription, der Aufrechterhaltung der genetischen Integrität und im Zellzyklus bzw. bei der Apoptose spielt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die sehr intensive Expression von Zfp819 in undifferenzierten pluripotenten Zelllinien gezeigt. Desweiteren konnte die Promotorregion von Zfp819 identifiziert werden, und es wurde gezeigt, dass diese mit epigenetischen Mustern ausgestattet ist. Zusätzlich konnten wir Regionen im Zfp819-Gen identifizieren, die für die nukleäre Lokalisation von Zfp819 verantwortlich sind. Desweiteren konnten wir zeigen, dass Zfp819 in der transkriptionellen Repression von spezifischen endogenen, retroviralen Elementen (ERVs) in pluripotenten Zellen eine Rolle spielt. Durch zelluläre und biochemische Studien konnten wir zeigen, dass Zfp819 mit vielen Proteinen interagiert (z.B. Kap1 und Chd4), welche für die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität von Bedeutung sind. Tatsächlich resultierte der Verlust von Zfp819 in embryonalen Stammzellen in einer erhöhten Anfälligkeit für DNA-Schäden und in einer verminderten DNA-Reparatur. Zusammenfassend lassen die Identifizierung der Interaktionspartner sowie die Ergebnisse der molekularen und der funktionellen Studien vermuten, dass Zfp819 durch die Unterdrückung von ausgewählten ERVs eine Rolle in der Regulation der genomischen Stabilität von pluripotenten Zellen spielt.