ALVES, Claudênio Diógenes. Estudo dos efeitos renais do veneno da serpente Lachesis muta muta. 2010. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-09T12:58:57Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_cdalves.pdf: 4300542 bytes, checksum: de3362ca9fe623e05244ea729c64ba4e (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-12T12:12:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_cdalves.pdf: 4300542 bytes, checksum: de3362ca9fe623e05244ea729c64ba4e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-12T12:12:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_cdalves.pdf: 4300542 bytes, checksum: de3362ca9fe623e05244ea729c64ba4e (MD5) Previous issue date: 2010 / The accident caused by the snake Lachesis muta muta is serious and its venom is responsible for many systemic changes, such as hypotension. In this work, the renal effects of the total venom of this snake in the renal perfusion system and in cultured renal tubular cells of the type MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) are investigated. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250 to 300g, were perfused with previously dialysed, Krebs-Henseleit solution containing 6% w/v bovine albumin. The effects of the venom (10 mg / mL, n = 6) on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR), sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) were submitted to analysis. Lachesis muta muta venom was added to the system after 30 minutes of internal control. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% v/v fetal bovine serum and then assessed in the presence of the total venom of the snake Lachesis muta muta in the concentrations of 1μg/mL, 10μg/mL and 100μg/mL 24 hours afterwards, tests concerning viability and cellular cytotoxicity were brought about. The total venom (10μg/mL) promoted a transient reduction in perfusion pressure (C60= 108.27 ± 4.88; VT L. m. muta60= 88.17 ± 5.27#; C90= 108.69 ± 5.08; VT L. m. muta90= 78.71 ± 6.94#*) and renal vascular resistance (C60= 5.57 ± 0.49; VT L. m. muta60= 3.50 ± 0.22#; C90= 5.32 ± 0.57; VT L. m. muta90= 3.11 ± 0.26#*); increase in urinary flow (C60= 0.158 ± 0.015; VT L. m. muta60= 0.100 ± 0.012#; C120= 0.160 ± 0.020; VT L. m. muta120= 0.777± 0.157#*) and in glomerular filtration rate (C60= 0.707 ± 0.051; VT L. m. muta60= 0.232 ± 0.042#; C120= 0.697 ± 0.084; VT L. m. muta120= 1.478 ± 0.278#*). Such a concentration also reduced significantly sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) in the three periods analyzed (30, 60 and 90 minutes), with a consequent increase in the osmotic clearance (Cosm) (C90= 0.141 ± 0.011; VT L. m. muta90= 0.309 ± 0.090; C120= 0.125 ± 0.016; VT L. m. muta120= 0.839 ± 0,.184#*). Histological analysis of the kidneys perfused with the poison revealed focal areas of renal tubular cells with nuclear pyknosis. The venom also promoted a cytotoxic effect on MDCK cells at concentrations 10μg/mL and 100μg/mL, thus reducing the viability of these cells to 38.60 ± 17.9% and 10.62 ± 2.9%, respectively. These results demonstrate that the venom of Lachesis muta muta altered all the renal parameters assessed in renal perfusion, inducing transient hypotension and intense diuresis. The venom also exhibits cytotoxic activity on MDCK cells after 24 hours of incubation. / O acidente causado pela serpente Lachesis muta muta é grave e o seu veneno é responsável por uma série de alterações sistêmicas, como a hipotensão arterial. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais do veneno total desta serpente em sistema de perfusão renal e em cultura de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com Solução de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos do veneno (10 µg/mL; n=6) sobre a Pressão de Perfusão (PP), Resistência Vascular Renal (RVR), Fluxo Urinário (FU), Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa+), de Potássio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). O veneno da Lachesis muta muta foi adicionado após 30 minutos de controle interno. As células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e então avaliadas na presença do veneno total da serpente Lachesis muta muta nas concentrações 1μg/mL, 10μg/mL e 100μg/mL. Após 24 horas de experimento, foram realizados ensaios de viabilidade e citotoxicidade celular. O veneno total, na dose de 10μg/mL, causou redução transitória na pressão de perfusão (C60= 108,27 ± 4,88 mmHg; VT L. m. muta60= 88,17 ± 5,27# mmHg; C90= 108,69 ± 5,08 mmHg; VT L. m. muta90= 78,71 ± 6,94#* mmHg) e na resistência vascular renal (C60= 5,57 ± 0,49 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 3,50 ± 0,22# mmHg/mL.g-1.min-1; C90= 5,32 ± 0,57 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta90= 3,11 ± 0,26#* mmHg/mL.g-1.min-1) além de aumento do fluxo urinário (C60= 0,158 ± 0,015 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,100 ± 0,012# mL.g-1. min-1; C120= 0,160 ± 0,020 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 0,777± 0,157#*) e do ritmo de filtração glomerular (C60= 0,707 ± 0,051 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,232 ± 0,042# mL.g-1.min-1; C120= 0,697 ± 0,084 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 1,478 ± 0,278#* mL.g-1.min-1). A dose estudada também promoveu redução significativa do percentual de transporte tubular de sódio (%TNa+), potássio (%TK+) e cloreto (%TCl-) nos três períodos analisados (30, 60 e 90 minutos), com conseqüente aumento do clearence osmótico(Cosm) (C90= 0,141 ± 0,011; VT L. m. muta90= 0,309 ± 0,090; C120= 0,125 ± 0,016; VT L. m. muta120= 0,839 ± 0,184#*). A avaliação histopatológica revelou a presença de áreas focais com células com núcleos picnóticos nos túbulos renais dos rins perfundidos com veneno. O veneno também apresentou efeito citotóxico sobre as células MDCK apenas nas concentrações de 10µg/mL e 100µg/mL reduzindo a viabilidade destas células a 38,60 ± 17,9% e 10,62 ± 2,9%, respectivamente. Estes resultados demonstram que o veneno total da Lachesis muta muta alterou todos os parâmetros renais avaliados na perfusão renal, induzindo hipotensão transitória e intensa diurese. O veneno também possui ação citotóxica sobre as células MDCK após 24 horas de incubação.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O acidente causado pela serpente Lachesis muta muta à grave e o seu veneno à responsÃvel por uma sÃrie de alteraÃÃes sistÃmicas, como a hipotensÃo arterial. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais do veneno total desta serpente em sistema de perfusÃo renal e em cultura de cÃlulas tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com SoluÃÃo de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos do veneno (10 Âg/mL; n=6) sobre a PressÃo de PerfusÃo (PP), ResistÃncia Vascular Renal (RVR), Fluxo UrinÃrio (FU), Ritmo de FiltraÃÃo Glomerular (RFG), Percentual de Transporte Tubular de SÃdio (%TNa+), de PotÃssio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). O veneno da Lachesis muta muta foi adicionado apÃs 30 minutos de controle interno. As cÃlulas MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e entÃo avaliadas na presenÃa do veneno total da serpente Lachesis muta muta nas concentraÃÃes 1μg/mL, 10μg/mL e 100μg/mL. ApÃs 24 horas de experimento, foram realizados ensaios de viabilidade e citotoxicidade celular. O veneno total, na dose de 10μg/mL, causou reduÃÃo transitÃria na pressÃo de perfusÃo (C60= 108,27  4,88 mmHg; VT L. m. muta60= 88,17  5,27# mmHg; C90= 108,69  5,08 mmHg; VT L. m. muta90= 78,71  6,94#* mmHg) e na resistÃncia vascular renal (C60= 5,57  0,49 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 3,50  0,22# mmHg/mL.g-1.min-1; C90= 5,32  0,57 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta90= 3,11  0,26#* mmHg/mL.g-1.min-1) alÃm de aumento do fluxo urinÃrio (C60= 0,158  0,015 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,100  0,012# mL.g-1. min-1; C120= 0,160  0,020 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 0,777 0,157#*) e do ritmo de filtraÃÃo glomerular (C60= 0,707  0,051 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,232  0,042# mL.g-1.min-1; C120= 0,697  0,084 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 1,478  0,278#* mL.g-1.min-1). A dose estudada tambÃm promoveu reduÃÃo significativa do percentual de transporte tubular de sÃdio (%TNa+), potÃssio (%TK+) e cloreto (%TCl-) nos trÃs perÃodos analisados (30, 60 e 90 minutos), com conseqÃente aumento do clearence osmÃtico(Cosm) (C90= 0,141  0,011; VT L. m. muta90= 0,309  0,090; C120= 0,125  0,016; VT L. m. muta120= 0,839  0,184#*). A avaliaÃÃo histopatolÃgica revelou a presenÃa de Ãreas focais com cÃlulas com nÃcleos picnÃticos nos tÃbulos renais dos rins perfundidos com veneno. O veneno tambÃm apresentou efeito citotÃxico sobre as cÃlulas MDCK apenas nas concentraÃÃes de 10Âg/mL e 100Âg/mL reduzindo a viabilidade destas cÃlulas a 38,60  17,9% e 10,62  2,9%, respectivamente. Estes resultados demonstram que o veneno total da Lachesis muta muta alterou todos os parÃmetros renais avaliados na perfusÃo renal, induzindo hipotensÃo transitÃria e intensa diurese. O veneno tambÃm possui aÃÃo citotÃxica sobre as cÃlulas MDCK apÃs 24 horas de incubaÃÃo. / The accident caused by the snake Lachesis muta muta is serious and its venom is responsible for many systemic changes, such as hypotension. In this work, the renal effects of the total venom of this snake in the renal perfusion system and in cultured renal tubular cells of the type MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) are investigated. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250 to 300g, were perfused with previously dialysed, Krebs-Henseleit solution containing 6% w/v bovine albumin. The effects of the venom (10 mg / mL, n = 6) on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR), sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) were submitted to analysis. Lachesis muta muta venom was added to the system after 30 minutes of internal control. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% v/v fetal bovine serum and then assessed in the presence of the total venom of the snake Lachesis muta muta in the concentrations of 1μg/mL, 10μg/mL and 100μg/mL 24 hours afterwards, tests concerning viability and cellular cytotoxicity were brought about. The total venom (10μg/mL) promoted a transient reduction in perfusion pressure (C60= 108.27  4.88; VT L. m. muta60= 88.17  5.27#; C90= 108.69  5.08; VT L. m. muta90= 78.71  6.94#*) and renal vascular resistance (C60= 5.57  0.49; VT L. m. muta60= 3.50  0.22#; C90= 5.32  0.57; VT L. m. muta90= 3.11  0.26#*); increase in urinary flow (C60= 0.158  0.015; VT L. m. muta60= 0.100  0.012#; C120= 0.160  0.020; VT L. m. muta120= 0.777 0.157#*) and in glomerular filtration rate (C60= 0.707  0.051; VT L. m. muta60= 0.232  0.042#; C120= 0.697  0.084; VT L. m. muta120= 1.478  0.278#*). Such a concentration also reduced significantly sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) in the three periods analyzed (30, 60 and 90 minutes), with a consequent increase in the osmotic clearance (Cosm) (C90= 0.141  0.011; VT L. m. muta90= 0.309  0.090; C120= 0.125  0.016; VT L. m. muta120= 0.839  0,.184#*). Histological analysis of the kidneys perfused with the poison revealed focal areas of renal tubular cells with nuclear pyknosis. The venom also promoted a cytotoxic effect on MDCK cells at concentrations 10μg/mL and 100μg/mL, thus reducing the viability of these cells to 38.60  17.9% and 10.62  2.9%, respectively. These results demonstrate that the venom of Lachesis muta muta altered all the renal parameters assessed in renal perfusion, inducing transient hypotension and intense diuresis. The venom also exhibits cytotoxic activity on MDCK cells after 24 hours of incubation.

En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método de purificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G-100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C-50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4 veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un Km de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl- y Br-. En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados en placas de agar- sangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg. / --- In the present research some biochemical and biological characteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzyme was recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAGE-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl- and Br- ions. The biological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice. / Tesis

<p>De rubriker som funnits i media den senaste tiden om korruption gav mig idén till att skriva detta arbete. Jag sökte teori och upptäckte snart att det saknades arbeten som behandlade korruption inom den privata sektorn och fann därför det området intressant att koncentrera sig till. Mitt syfte formades efter de frågor jag ställde mig genom att granska dels teori och artiklar i media. Det jag ville ha svar på med undersökningen var om företagen använder sig av gåvor samt deras motiv bakom och att klargöra deras uppfattningar om lagstiftningen när en gåva blir en otillbörlig förmån. Jag ville även skapa mig en uppfattning om företagen arbetar för att minimera risken för korruption inom den egna organisationen.</p><p>För att uppnå mitt syfte genomförde jag sex stycken intervjuer med arbetstagare inom den privata sektorn i Sverige. Företag som har en inköpande och säljande enhet valdes ut på grun-da av att teorin har visat att de instanserna är som mest utsatta för korruptions beteende.</p><p>Undersökningen visar att det är vanligt att företag ger gåvor i affärssammanhang. De ger gåvor för att stärka samarbetet. Gåvornas karaktär är från enklare presentartiklar till mer lyxbetonad representation. Min uppfattning var att företagen hade svårt att tydligt konstatera var en gräns skall dras för när en gåva skall klassas som otillbörlig förmån. Inom vissa företag förekom även brister i deras arbete för ett positivt etiskt handlande.</p>

En el presente estudio se han evaluado algunas características bioquímicas y biológicas de una hialuronidasa previamente encontrada en el veneno de Lachesis muta, para lo cual fue necesario optimizar el método de purificación. Usando 50 mg de veneno disueltos en búfer acetato de amonio 0,05 M pH 5,0, la hialuronidasa fue separada empleando una cromatografía en Sephadex G-100 seguida de una columna de intercambio catiónico en CM Sephadex C-50, utilizando el mismo bufer como eluyente. En este sistema, la enzima se recuperó usando una gradiente de NaCl de 0 a 0,7 M, con un rendimiento de 39.02% y una purificación de 51,4 veces. El análisis de pureza por PAGE-SDS reveló una sola banda proteica con peso molecular de 65 kDa. La enzima mostró un pH óptimo de 5,0, un Km de 34,4 µg de ácido hialurónico/ml y un Vmax de 40,9 µg de ácido hialurónico hidrolizado/minuto/mg. Así mismo, la hialuronidasa demostró una dependencia absoluta por los iones Cl- y Br-. En cuanto a la actividad biológica, los ensayos realizados en placas de agar- sangre mostraron que la enzima actúa como un factor difusor que permite la hemólisis por acción de la fosfolipasa del propio veneno. Así también, se ha observado que la inyección por vía subcutánea de la enzima purificada en ratones, no causó ningún efecto hasta las 6 horas usando cantidades de 0,4 hasta 1,6 mg. / In the present research some biochemical and biological characteristics of a hyaluronidase from the venom of Lachesis muta snake were evaluated. In this way the method for purification of this enzyme was improved. 50 mg of whole venom was disolved in 0.05 M amoniun acetate buffer pH 5.0 and applied to Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by CM Sephadex C-50 exchange chromatography using the same buffer. In the last system, the enzyme was recovered after a gradient of NaCl from 0 to 0,7 M with 51,4 folds and 39,02% of yield. The hyaluronidase was achieved as homogeneus band of protein by PAGE-SDS with 65 kDa of molecular weigth. The enzyme registered 5,0 as optimus pH, Km: 34,4 µg of hyaluronic acid/ml and Vmax: 40.9 µg hidrolizade hyaluronic acid/minute/mg. The enzyme showed a total dependence for Cl- and Br- ions. The biological activity assays using agar-blood plates showed the hyaluronidase was a spreading factor, because of hemolisis by phospholipase A2 ocurred using the total venom. In addition, any biological effect was observed after inoculation of 0,4 to 1,6 mg of the hyaluronidase on mice.

De rubriker som funnits i media den senaste tiden om korruption gav mig idén till att skriva detta arbete. Jag sökte teori och upptäckte snart att det saknades arbeten som behandlade korruption inom den privata sektorn och fann därför det området intressant att koncentrera sig till. Mitt syfte formades efter de frågor jag ställde mig genom att granska dels teori och artiklar i media. Det jag ville ha svar på med undersökningen var om företagen använder sig av gåvor samt deras motiv bakom och att klargöra deras uppfattningar om lagstiftningen när en gåva blir en otillbörlig förmån. Jag ville även skapa mig en uppfattning om företagen arbetar för att minimera risken för korruption inom den egna organisationen. För att uppnå mitt syfte genomförde jag sex stycken intervjuer med arbetstagare inom den privata sektorn i Sverige. Företag som har en inköpande och säljande enhet valdes ut på grun-da av att teorin har visat att de instanserna är som mest utsatta för korruptions beteende. Undersökningen visar att det är vanligt att företag ger gåvor i affärssammanhang. De ger gåvor för att stärka samarbetet. Gåvornas karaktär är från enklare presentartiklar till mer lyxbetonad representation. Min uppfattning var att företagen hade svårt att tydligt konstatera var en gräns skall dras för när en gåva skall klassas som otillbörlig förmån. Inom vissa företag förekom även brister i deras arbete för ett positivt etiskt handlande.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

Orientador: Jose Camillo Novello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:19:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Damico_DanielaCarladaSilva_D.pdf: 13168744 bytes, checksum: facecc40bd94614d80c42d399206b237 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A subespécie Lachesis m. muta vive em florestas tropicais úmidas de difícil acesso, dificultando sua captura e/ou manutenção em cativeiro (obtenção do veneno). Uma revisão de 20 casos de acidentes ofídicos com humanos ocorridos na Costa Rica, Guiana Francesa, Brasil, Colômbia e Venezuela, confidentemente atribuídos a este gênero de serpente, descrevem sintomas locais de dor, edema, equimose, coagulopatia, sintomas semelhantes aos observados no envenenamento bothrópico. Entretanto, náusea, cólica abdominal, vômito constante, diarréia e sudorese foram sintomas exclusivos, não reportados em vítimas de outros viperídeos do Brasil. Um dos objetivos deste trabalho foi estudar os efeitos neurotóxico e miotóxico do veneno de L. m. muta em preparações neuromusculares isoladas de ave (biventer cervicis de pintainho) e mamífero (nervo frênico diafragma de camundongo). Em baixa concentração (2 mg/ml), o veneno exibiu potente neurotoxicidade, entretanto, nesta concentração, nenhum efeito miotóxico significativo foi observado em preparação biventer cervicis de pintainho, a miotoxicidade foi observada somente a concentrações superiores, a partir de 10 mg/ml. Ficou claro que o veneno possui componentes ativos farmacologicamente que atuam na junção neuromuscular e nas fibras musculares, o qual a intensidade de ação depende da concentração do veneno e do tipo da preparação neuromuscular (ave ou mamífero) usada. O veneno bruto de L. m. muta também foi estudado quanto a sua ação citotóxica. O veneno mostrou um efeito citotóxico frente à célula tubular epitelial renal (MDCK), induziu a uma diminuição da viabilidade celular, alterou significantemente a resistência elétrica transepitelial através da monocamada e induziu alterações morfológicas e nucleares. Foram purificadas duas novas toxinas (LmTX-I e LmTX-II) a partir do veneno total de L. m. muta, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. Estas novas toxinas foram caracterizadas como isoformas de PLA2s básicas Asp49, em função das características físico-químicas evidenciadas. Frente a diferentes concentrações de substrato, LmTX-I mostrou um comportamento tipo alostérico. Na ausência de Ca2+ (1 mM) e na presença de íons divalentes como Zn2+ e Cu2+, a atividade PLA2 foi inibida. Foi utilizada preparação biventer cervicis de pintainho para estudar a atividade neurotóxica e miotóxica in vitro da PLA2 (LmTX-I). A toxina produziu um bloqueio irreversível da transmissão neuromuscular em concentrações baixas como 1 mg/ml. Entretanto, nesta concentração, nenhum efeito miotóxico significativo foi produzido pela toxina. O bloqueio neuromuscular não foi acompanhado da inibição da resposta contrátil à adição da acetilcolina (ACh), desta maneira, o bloqueio neuromuscular produzido pela LmTX-I pode ser atribuído preferencialmente por um efeito inibitório na liberação de ACh, sugerindo uma ação présináptica da toxina. Com uma maior concentração (30 mg/ml), LmTX-I afetou a resposta ao KCl (30% de inibição), uma concentração no qual foi observado alterações morfológicas significativas (15% de fibras danificadas), como células com tamanhos heterogêneos, vacuolizadas, ou células com miofibrilas compactadas. Entretanto, nenhum efeito citotóxico significativo, como alteração morfológica e nuclear, redução da viabilidade celular ou indução da liberação de lactato desidrogenase, usando célula tubular epitelial renal (MDCK) e celular muscular esquelética (mioblastos e miotubos) foi observado / Abstract: The subspecies Lachesis m. muta lives in tropical forests of hard access, hindering its capture and/or maintenance in captivity (obtaining of the venom). A review on 20 case-reports that occurred in Costa Rica, French Guiana, Brazil, Colombia and Venezuela, of bites in humans, reliably attributed to this snake genus, described the local symptoms of pain, swelling, blistering, and mild coagulopathy, and as similar to those caused by snakebites of the genus Bothrops and other Latin American pit vipers genera, however, early nausea, abdominal colic, repeated vomiting, watery diarrhea and profuse sweating were distinctive symptoms, not reported in victims of other viperids. The venom of L. m. muta was studied with relationship to the neurotoxic and myotoxic effects in neuromuscular preparations isolated from avian (chick biventer cervicis muscle) and mammalian (mouse phrenic nerve-diaphragm muscle). The venom, in low concentrations (2 mg/ml) exhibited potent neurotoxicity, however, in this concentration, no significant myotoxic effect was observed in avian preparation, the myotoxicity was only observed to high concentrations, up to 10 mg/ml. It became clear that the venom has pharmacologically active components that act on neuromuscular junction and muscle fibers, whose intensity of action will depend on the venom concentration and on the type of nerve-muscle preparation (mouse or chick). The whole venom of L. m. muta also showed a cytotoxic effect in MDCK epithelial cell. The venom induced to a decrease of the cellular viability, altered significant the transepithelial electrical resistance through the monolayer and induced morphologic and nuclear alterations. Through optimized methodologies of purification in HPLC, two new toxins were purified (LmTX-I and LmTX-II) from the venom of L. m. muta, with a high degree of purity and molecular homogeneity, without loss of the biological activity. These new toxins were characterized as basic isoforms of PLA2s Asp49, because they share several chemical and physical characteristics: molecular mass, retention time in re-purification on reverse phase HPLC, content of disulfide bonds, isoelectric point and primary structure. In the presence of different substratum concentrations, LmTX-I showed a behavior type allosteric under our experimental conditions. In the absence of Ca2+ (1 mM) and in the presence of divalent ions as Zn2+ and Cu2+, the PLA2 activity was inhibited. Avian muscle preparation was used to study in vitro neurotoxic and myotoxic activity of PLA2 (LmTX-I). The toxin produced an irreversible blockade of the neuromuscular transmission in low concentrations as 1 mg/ml. However, in this concentration, the toxin produced no significant myotoxic effect. The complete neuromuscular blockade of the twitch tension was not accompanied of the inhibition of the response to ACh, this way, the neuromuscular blockade produced by the LmTX-I can be preferentially attributed by an inhibitor effect in the ACh release, suggesting a pre-synaptic action of the toxin. With a high concentration (30 mg/ml), LmTX-I affected the response to KCl (30% of inhibition) after the neuromuscular blockade have been completed, a concentration that was observed significant morphologic alterations (15% of damaged fibers), as cells with heterogeneous sizes, vacuolated, or cells with compacted myofibrils. However, any significant cytotoxic effect, as morphologic and nuclear alteration, reduction of the cellular viability or induction of the release of lactic dehydrogenase was observed using tubular epithelial renal and murine skeletal muscle cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.