Bibliographical identification: Author's first name and surname: RNDr. Lucie Brulíková (nee Spáčilová) Title: Synthesis, reactivity and biological activity of C-5 substituted uracil analogues Type of thesis: Ph.D. thesis Department: Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, Palacký University Olomouc Advisor: prof. RNDr. Antonín Holý, Dr.Sc., Dr.hc. mult. Advisor-consultant: doc. RNDr. Jan Hlaváč, Ph.D. The year of presentation: 2011 Abstract: The presented thesis is focused on the synthesis of various C-5 modified uracil analogues, the study of their reactivity and biological activity, especially cytotoxic activity. In the first part, the brief survey of described results for selected 5-alkoxymethyluracil analogues is performed. The second part of the presented thesis deals with the synthesis of novel uracil analogues modified at the C-5 position, the development and optimizing of procedure leading to the desired compounds, the study of biological activity and the evaluation of structure- activity relationship (SAR). This part presents the synthesis of a series of 5-[alkoxy(4- nitrophenyl)methyl)]uracil and 5-alkoxymethyluracil analogues and extended SAR studies depending on a substitution of metylene bridge directly attached at the C-5 position as well as alkoxy chain length. The last part of...

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

202f. / Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2013-04-01T14:56:04Z No. of bitstreams: 2 Folhas pre-textuais.pdf: 503924 bytes, checksum: b9d325ed66778f4e910714d66cd05f1a (MD5) corpo da tese final.pdf: 8015036 bytes, checksum: 267d671ad10dffcd21ca5da18e1daa67 (MD5) / Rejected by Ana Hilda Fonseca(anahilda@ufba.br), reason: Pedir ao aluno para colocar em um só arquivo. on 2013-04-24T15:29:06Z (GMT) / Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2013-05-20T17:38:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Edson de Jesus Marques.pdf: 8119670 bytes, checksum: 0f527c5cdd0e076e00e338d2fc003d4c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Hilda Fonseca(anahilda@ufba.br) on 2013-05-20T17:40:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Edson de Jesus Marques.pdf: 8119670 bytes, checksum: 0f527c5cdd0e076e00e338d2fc003d4c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T17:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Edson de Jesus Marques.pdf: 8119670 bytes, checksum: 0f527c5cdd0e076e00e338d2fc003d4c (MD5) Previous issue date: 2011 / CAPES / Este trabalho teve como objetivos realizar o isolamento, identificar compostos extraídos do caule de Clusia criuva e determinar a atividade citotóxica, in vitro, para células GL-15 de glioblastoma humano. Foram utilizados extratos obtidos com hexano e com diclorometano. O fracionamento foi feito por técnicas cromatográficas de gel de sílica e em camada delgada. A identificação das moléculas foi realizada com base na análise dos dados obtidos por diferentes técnicas espectroscópicas, propriedades físicas e comparação com dados da literatura. Foram identificados vinte e cinco metabolitos, sendo sete benzofenonas, a sampsoniona B (S03), as propolonas A (S06), B (S07), C (S04) e D (S05), o criuvanol I (S01) e II (S02); quatro xantonas, a brasilixantona B (S09), a osajaxantona F (S21), a 6-deoxijacareubina (S16) e a 1,5dihidroxi-3-4-[2”-hidroxi-1-metiletil-dihidrofurano]-xantona (S08); duas bifenilas, a aucuparina (S10) e a 2,2-dimetil-5-hidroxi-7-fenilcromeno (S15); cinco triterpenos, a friedelina (S18), o friedelinol (S19), o lupeol (S25), o ácido betulínico (S12) e o ácido betulínico esterificado pelo feruloil em C-28 (S11); cinco esteróides, o ϐ-sitosterol (S23), a sitostenona (S22), o lanosterol (S20), o estigmasterol (S17) e o sitosterol esterificado por ácido graxo saturado em C-3 (S24); dois tocotrienóis, os ácidos δ-tocotrienóis cis e trans (S13 e S14). A xantona S08 e as benzofenonas, criuvanol I e criuvanol II, são compostos inéditos. Para avaliação da atividade citotóxica foi utilizado como modelo experimental células GL-15 de glioblastomas humano. As células foram cultivadas em placas de 96 poços e mantidas em estufa a 37 ºC, com 5% de CO2 por 72 h. Foram avaliadas as substâncias S01 a S05, S07, S08, S10 a S14 e S22. Nessas condições, todas apresentaram potencial citotóxico superior a temozolomida, sendo os mais potentes o ácido betulínico, o criuvanol I e a propolona D. A atividade citotóxica (EC50) apresentada por cada uma delas foi de 29,2, 18,3 e 19,3 μM, respectivamente. / Salvador

Submitted by Ana Hilda Fonseca (anahilda@ufba.br) on 2013-04-09T14:23:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação corrigifa aos defesa.pdf: 1579566 bytes, checksum: 212d44a2c53e2dbbae9af296ae48959c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Hilda Fonseca(anahilda@ufba.br) on 2013-04-19T12:56:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação corrigifa aos defesa.pdf: 1579566 bytes, checksum: 212d44a2c53e2dbbae9af296ae48959c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-19T12:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação corrigifa aos defesa.pdf: 1579566 bytes, checksum: 212d44a2c53e2dbbae9af296ae48959c (MD5) Previous issue date: 2010 / CAPES / Própolis é uma mistura complexa, formada basicamente por secreções salivares das abelhas e por um material resinoso e balsâmico coletado por elas dos ramos, flores, pólen, brotos e exsudados de árvores, à qual têm sido atribuídas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatória, antiviral entre outras. Sua composição varia com a flora da região e época da colheita. Este trabalho descreve o perfil cromatográfico dos extratos hexânicos e metanólicos da própolis da Bahia obtidos por maceração, bem como o isolamento e a elucidação estrutural de algumas substâncias presentes na fase hexânica da própolis marrom clara, e avaliação da atividade antioxidante e citotóxica dos extratos. Utilizando-se métodos cromatográficos usuais (CC, CCDC e CCDP) foram isolados do extrato hexânico o trans cinamato de metila, o cinamato de sitosterila que tem seu primeiro relato na própolis, além de duas benzofenonas a hyperibona A e a clusianona, esta última também identificada pela primeira vez na própolis. As estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas através da análise dos dados obtidos pelos espectros no IV, de RMN de 1H, 13 C, DEPT, além de técnicas bidimensionais (COSY, HMBC e HMQC). Os testes de atividade antioxidante in vitro utilizando a metodologia do seqüestro do radical estável DPPH, demostraram que os extratos apresentaram moderada atividade antioxidante quando comparados com o padrão ácido gálico. Nos ensaios de atividade citotóxica frente Artemia salina os extratos apresentaram CL50 < 145 ug/mL podendo ser um indicativo de atividade antitumoral. / Salvador

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-31Bitstream added on 2014-06-13T18:41:52Z : No. of bitstreams: 1 duarte_ra_dr_arafcf.pdf: 4649782 bytes, checksum: 99bc00374a88b89ba36ff755fc732fa3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O câncer de mama é a maior causa de morbidade e mortalidade entre as mulheres no mundo. Pesquisas revelam vários fatores prognósticos e preditivos para a identificação de pacientes com alto risco de agressividade, metastases e doença recorrente na condição de combater estas estatísticas. Por esta razão, é evidente a necessidade do desenvolvimento de estratégias de tratamento mais eficazes. Estudos prévios com Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae-Caesalpinioideae), uma planta nativa do Brasil resultou o isolamento de dois alcalóides guanidínicos. Exibiram atividade seletiva direcionada a DNA deficiente de reparo, sugerindo potencial atividade anticâncer. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a citotoxicidade e apoptose induzidas pelos alcalóides pteroginina (PGN) and pteroginidina (PGD) em linhagem de adenocarcinoma (MCF-7) e carcinoma ductal invasivo (ZR-7531). Materiais e Métodos: As duas linhagens celulares foram tratadas pelos alcalóides em várias concentrações (0.25 – 10 mM) em dois tempos, t0 (24h) e t24 (24h seguido por 24h pós-tratamento). O ensaio de citotoxicidade foi determinado pelo teste de MTT; a morte celular (apoptose e necrose) foi analisada usando os métodos Hoechst 33342/iodeto propídio, Kit de Anexina V-FITC e atividade de Caspases 3/7. Resultados: Os tratamentos com os alcalóides demonstraram citotoxicidade concentração-resposta nas linhagens de câncer de mama. Para avaliação da apoptose foi observado um intense efeito concentraçãoresposta em apoptose tardia/necrose e discreto sinal para apoptose precoce em todas concentrações (p<0,01). No ensaio Hoechst/iodeto, observou diferença significante entre os estágios de apoptose precoce e tardia de ambas linhagens. A pteroginina no período t0 e t24, e pteroginidina no período t0 demonstraram possuir intenso efeito concentração... / Breast cancer is a major cause of morbidity and mortality among women worldwide. Research has elucidated several specific prognostic and predictive factors to identify patients at high risk of the aggressive disease, metastasis and recurrence of the disease in order to combat these statistics. For this reason, there is an obvious need to develop more efficacious treatment strategies. Previous studies on Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae-Caesalpinioideae), a native plant of Brazil, resulted in the isolation of two guanidine alkaloids, exhibited selective activity towards a DNA repair-deficient, suggesting potential anti-cancer activity. Objective: The aim of the present study was to evaluate the citotoxicity and apoptosis induced by alkaloids pterogynine (PGN) and pterogynidine (PGD) in human adenocarcinoma cell line (MCF-7) and human invasive ductal carcinoma cell line(ZR-7531). Material and Methods: The two cell lines were treated by both alkaloids at several concentrations (0.25 – 10 mM) and two time points, 24h (t0) and 24h followed by 24h pos-treatment (t24). The cytotoxicity assay was determined by MTT assay; the cell death (apoptosis and necrosis) were analyzed using the dye Hoechst 33342/propidium iodide, Annexin V-FITC and Caspase 3/7 activity. Results: The treatments with the alkaloids demonstrated citotoxicity effect concentrationresponse in breast cell lines. Apoptosis evaluation, pterogynine and pterogynidine has an intense effect concentration-response of late apoptosis/necrosis and a discrete signal of early apoptosis in all of the concentrations (p<0.01). Hoechst/iodide assay, it was observe significant difference among the stages of early and late apoptosis in the both cells lines. Pterogynine for the period of t0 and t24, and pterogynidine for the period of t0 demonstrated to possess an intense concentrationresponse... (Complete abstract click electronic access below)

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Annonalida, diterpeno primarano isolado das raÃzes de Humirianthera ampla, foi utilizada como molÃcula protÃtipo no preparo de sete derivados por modificaÃÃes quÃmicas. As modificaÃÃes na annonalida envolveram reaÃÃes de substituiÃÃes nucleofÃlicas na hidroxila primÃria ligada ao C-16, transformaÃÃo da carbonÃla (C-15) em oxima, oxidaÃÃo de Baeyer-Villiger e reduÃÃo com borohidreto de sÃdio. Dentre os derivados formados, apenas o acrenol, um dos dois produtos de reduÃÃo com borohidreto de sÃdio, nÃo à inÃdito na literatura. A annonalida e seus derivados semi-sintÃticos foram testados em ensaios de atividade citotÃxica contra as linhagens de cÃlulas tumorais HCT-116 (cÃlon - humano), SF295 (Glioblastoma), HL60 (LeucÃmia promielocÃtica), PC3 (Carcinoma de prÃstata) e HEPG2 (Hepatocarcinoma). Todos os compostos apresentaram IC50 <5 &#956;g/mL em quatro das cinco linhagens testadas. Os melhores resultados foram para os derivados contendo o grupamento oxima em C-15 (ANN-OXIM) e um bromo em C-16 (ANN-BROM) contra a linhagem HL60. / Annonalide, a pimarane diterpene isolated from roots of Humirianthera ampla, was used as a prototype molecule in the preparation of seven derivatives by chemical modifications. Structure modifications at annonalide involved the nucleophilic substitution reactions at the primary hydroxyl attached to C-16, conversion of the carbonyl (C-15) into an oxime, Baeyer-Villiger oxidation, and reduction with sodium borohydride.Among the derivative compounds, only acrenol, one of the compounds obtained by reduction of annonalide with sodium borohydride, is not new in the literature. Anonnalide and its derivatives were assayed against the cytotoxic cell lines HCT-116 (colon-human), SF295 (glioblastome), HL60 (leucemi), PC3 (prostate) e HEPG2 (hepatocarcinome). All compounds showed IC50 <5 &#956;g/mL against four of the five tested lines. The best results were obtained for the compounds containing the oxyme group at C-15 (ANN-OXIM) and a bromide atom at C-16 (ANN-BROM), both against HL60 cell line.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The present work reports the chemical study related to the stem and the roots of Croton limae, collected in AndaraÃ/BA. The phytochemical investigation of ethanol extract from the stem lead to the isolation of two kaurane-type diterpenes, ent-kaur-16-en-18-oic acid and ent-kaur-16-en-15-oxo-18-oic acid, two clerodane-type diterpenes, 3,12-dioxo-15,16-epoxy-4&#945;-hydroxycleroda-13(16),14-diene and 3-oxo-4&#945;-hydroxy-13,14,15,16-tetranorclerodan-12-oic acid, and the flavonoid quercetin 3-O-&#946;-D-glucopyranoside. The investigation of the hexane extract from the roots lead to the isolation of one triterpene, acetyl aleuritolic acid, the new dimer ent-17(&#945;-pinen-10â-yl)-15-oxokauran-18-oic acid, two news clerodane diterpenes, 3-oxo-15,16-epoxy-4&#945;,12-dihydroxycleroda-13(16),14-diene and 15,16-epoxy-3&#945;,4&#945;,12-trihydroxycleroda-13(16),14-diene, one halimane-type diterpene, 15,16-epoxy-3&#945;,12-dihydroxyhalima-5(10),13(16),14-triene and the mixture of steroids &#946;-sitosterol and stigmasterol. From the ethanol extract of the roots, it was possible to isolate the flavonoids kaempferol 3-O-&#946;-glucopyranoside and ombuine 3-O-&#946;-rutinoside and the three new clerodane diterpenes 3&#945;,4&#945;,15,16-tetrahydroxyclerod-13-ene, 6-(&#946;-D-glucopyranosyl)-3,12-dioxo-15,16-epoxi-4&#945;-hydroxycleroda-13(16),14-dieno and 3-oxo-4&#945;,12-dihydroxy-14,15,16-trinorclerodan-13-oic acid. Four aromatic derivatives amides from ent-kaur-16-en-18-oic acid were prepared through nucleophilic substitutive reactions. The corresponding methyl esters from the ent-kaur-16-en-18-oic acid and ent-kaur-16-en-15-oxo-18-oic acid were also obtained. Two new derivatives from 3,12-dioxo-15,16-epoxi-4&#945;-hidroxicleroda-13(16),14-dieno were prepared through reduction reaction and another one by the biotransformation of diterpene, made by the fungus Rhizopus stolonifer. Some isolated compounds and derivatives were submited to cytotoxic activity using ovarian (OVCAR-8), glioblastoma (SF-295) and colon (HCT-116) cell lines, and the compounds ent-kaur-16-en-15-oxo-18-oic acid and ent-17(&#945;-pinen-10â-yl)-15-oxokauran-18-oic acid registered activity during preliminaries assays. The secondary metabolites were isolated through usual chromatography techniques, using thin layer chromatography, column chromatography, size exclusion chromatography and high performance liquid chromatography. The determination of the structure of the isolated compounds was performed through physical (melting point and optical rotation) and spectrometric techniques, such infrared (IR), high resolution mass spectrometry and nuclear magnetic resonance (NMR), including bidimensional experiments, and comparison with literature data. / O presente trabalho relata o estudo quÃmico do caule e das raÃzes de Croton limae, coletado no municÃpio de AndaraÃ-BA. A investigaÃÃo fitoquÃmica do extrato etanÃlico do caule levou ao isolamento de dois diterpenos do tipo caurano, Ãcido ent-caur-16-en-18-oico e Ãcido ent-caur-16-en-15-oxo-18-oico, dois diterpenos do tipo clerodano, 3,12-dioxo-15,16-epoxi-4&#945;-hidroxicleroda-13(16),14-dieno e Ãcido 3-oxo-4&#945;-hidroxi-13,14,15,16-tetranorclerodan-12-oico, e do flavonoide 3-O-&#946;-D-glicopiranosilquercetina. A investigaÃÃo do extrato hexÃnico das raÃzes levou ao isolamento de um triterpeno, Ãcido acetilaleuritÃlico, do dÃmero inÃdito Ãcido ent-17(&#945;-pinen-10â-il)-15-oxocauran-18-oico, de dois novos diterpenos clerodanos, 3-oxo-15,16-epoxi-4&#945;,12-dihidroxicleroda-13(16),14-dieno e 15,16-epoxi-3&#945;,4&#945;,12-trihidroxicleroda-13(16),14-dieno, um diterpeno do tipo halimano, 15,16-epoxi-3&#945;,12-dihidroxihalima-5(10),13(16),14-trieno, e da mistura dos esteroides &#946;-sitosterol e estigmasterol. Do extrato etanÃlico das raÃzes foram isolados dois flavonoides, 3-O-&#946;-D-glicopiranosilcanferol e ombuina-3-O-&#946;-rutinosÃdeo, e trÃs diterpenos clerodanos inÃditos, 3&#945;,4&#945;,15,16-tetrahidroxicleroda-13-eno, 6-(&#946;-D-glicopiranosil)-3,12-dioxo-15,16-epoxi-4&#945;-hidroxicleroda-13(16),14-dieno e Ãcido 3-oxo-4&#945;,12-dihidroxi-14,15,16-trinorclerodan-13-oico. Foram preparadas quatro amidas aromÃticas derivadas do Ãcido ent-caur-16-en-18-oico e os respectivos Ãsteres metÃlicos dos Ãcidos ent-caur-16-en-18-oico e ent-caur-16-en-15-oxo-18-oico. Foram preparados dois derivados reacionais obtidos atravÃs de reaÃÃes de reduÃÃo do diterpeno clerodano 3,12-dioxo-15,16-epoxi-4&#945;-hidroxicleroda-13(16),14-dieno e outro atravÃs da biotransformaÃÃo deste diterpeno pelo fungo Rhizopus stolonifer. Alguns compostos isolados e derivados foram submetidos a testes de atividade citotÃxica, utilizando linhagens de cÃlulas tumorais de ovÃrio (OVCAR-8), glioblastoma (SF-295) e colÃn (HCT-116), onde testes preliminares indicaram que os compostos ent-caur-16-en-15-oxo-18-oico e Ãcido ent-17(&#945;-pinen-10â-il)-15-oxocauran-18-oico apresentaram atividade. Os metabÃlitos secundÃrios foram isolados atravÃs de tÃcnicas cromatogrÃficas usuais, utilizando cromatografia em camada delgada, cromatografia em coluna, cromatografia por exclusÃo molecular e cromatografia lÃquida de alta eficiÃncia. A determinaÃÃo estrutural foi realizada atravÃs de mÃtodos fÃsicos (ponto de fusÃo e rotaÃÃo Ãptica) e do uso de tÃcnicas espectroscÃpicas e espectromÃtricas como infravermelho (IV), espectrometria de massas de alta resoluÃÃo e ressonÃncia magnÃtica nuclear de hidrogÃnio (RMN 1H) e carbono-13 (RMN 13C), incluindo experimentos bidimensionais, alÃm de comparaÃÃo com dados da literatura.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / TriterpenÃides sÃo compostos que nos Ãltimos anos tÃm despertados grande interesse em razÃo de sua diversidade estrutural e da descoberta de um amplo espectro de atividades farmacolÃgicas. O presente estudo avaliou o potencial citotÃxico de quatro derivados de uma mistura de &#945;-,&#946;-amirina em linhagens tumorais humanas. Dentre estes, apenas o composto 3-O-Carboximaleinato de &#945;-, &#946;-amirina (3a/3b) foi ativo, especialmente na linhagem leucÃmica HL-60, com valores de IC50 variando entre 1,8 e 3,0 ÂM. Este derivado foi avaliado, tambÃm frente à outra linhagem leucÃmica, K562, com IC50 variando entre 1,76 e 2,96 ÂM, sugerindo uma especificidade desta substÃncia para leucemias. E sua especificidade para cÃlulas tumorais foi confirmada em ensaios de citotoxicidade em cÃlulas nÃo transformadas, sendo testada em uma linhagem de macrÃfagos, J774 (IC50 entre 3,10 e 3,60 ÂM) e em cÃlulas mononucleares do sangue perifÃrico humano (CMSPH), cuja proliferaÃÃo nÃo foi impedida e nÃo houve dano ao DNA destas cÃlulas. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolÃtica contra eritrÃcitos de camundongos (EC50 > 200 Âg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos de aÃÃo mais especÃficos. Desta forma, a fim de determinar o mecanismo de aÃÃo envolvido, uma sequÃncia de experimentos in vitro foram realizados na linhagem HL-60. As cÃlulas foram tratadas em diferentes concentraÃÃes da amostra 3a/3b (1,5, 3,0 e 6,0 ÂM) por 24h. A viabilidade das cÃlulas HL-60 (teste azul de tripan e citometria de fluxo) foi reduzida nas concentraÃÃes de 3,0 e 6,0 ÂM, apÃs o tratamento. A anÃlise morfolÃgica das alteraÃÃes celulares realizada por mÃtodos de coloraÃÃo (May-GrÃnwald-Giemsa e laranja de acridina/brometo de etÃdio (LA/BE)) e por citometria de fluxo (integridade de membrana) revelaram caracterÃsticas tÃpicas de cÃlulas apoptÃticas (membrana Ãntegra, reduÃÃo do volume celular, nÃcleo picnÃtico e cromatÃlise), tambÃm nas concentraÃÃes de 3,0 e 6,0 ÂM. Outros testes por citometria de fluxo revelaram que houve externalizaÃÃo da fosfatidilserina, que nÃo houve formaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROS) e que a molÃcula 3a/3b induziu apenas a via extrÃnseca da apoptose, pela ativaÃÃo da caspase iniciadora 8 e a consequente ativaÃÃo das caspases efetoras 3 e 7. Estes dados indicam um mecanismo citotÃxico por induÃÃo de uma via apoptÃtica, envolvendo receptores de morte. Por conseguinte, estes resultados apontam o potencial citotÃxico do anÃlogo 3a/3b. / Triterpenoids are compounds that in recent years have aroused considerable interest because of their structural diversity and the discovery of a broad spectrum of pharmacological activities. This study evaluated the cytotoxic potential of four derivatives of a mixture of &#945;-, &#946;-amyrin in human tumor cell lines. Among these, only compound 3-O-&#945;-Carboximaleinato of, &#946;-amyrin (3a/3b) was active, especially in the leukemic cell line HL-60, with IC50 values ranging from 1.8 to 3.0 ÂM. This derivative had its cytotoxic evaluated, also at the other leukemia cell line, K562, with IC50 values ranging between 1.76 and 2.96 ÂM, suggesting a specificity of this substance for leukemia. And their specificity for tumor cells was confirmed in cytotoxicity assays in a strain of macrophages, J774 (IC50 between 3.10 and 3.60 ÂM) and mononuclear cells in human peripheral blood mononuclear cells, whose proliferation was not prevented, and there wasnât damage in the DNA of these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50> 200 mg / mL), suggesting a cytotoxic mechanism more specific. Thus, to determine the mechanism of action involved, sequences of in vitro experiments were performed in HL-60 cell line. Cells were treated at different concentrations of the sample 3a/3b (1.5, 3.0 and 6.0 ÂM) during 24h. The viability of HL-60 cells (trypan blue test and flow cytometry) was reduced at concentrations of 3.0 and 6.0 ÂM after treatment. Morphological analysis of cellular changes performed by staining methods (May-GrÃnwald-Giemsa and acridine orange / ethidium bromide (LA / BE)) and by flow cytometry (membrane integrity) showed typical features of apoptotic cells (intact membrane , reduction of cell volume, picnotic nucleus and chromatolysis), also at concentrations of 3.0 and 6.0 ÂM. Further testing by flow cytometry revealed that there was externalization of phosphatidylserine, there was no formation of reactive oxygen species (ROS) and that the molecule 3a/3b only induced the extrinsic pathway of apoptosis by activation of initiator caspase 8 and subsequent activation of caspases 3 and 7. These data indicate a cytotoxic mechanism induced by an apoptotic pathway, involving death receptors. Therefore, these results indicate the cytotoxic potential of 3a/3b analogue.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

Marathon runners (N = 22) who had completed at least seven marathons (X ± SEM = 23.6 ± 5.7) and had been training for marathon race events for at least 4 yr (12.3 ± 1.3) were compared with sedentary controls (N = 18). Although the two groups were of similar age (38.7 ± 1.5 and 43.9 ± 2.2 yr, respectively) and height, the marathon runners were significantly leaner and possessed a VO2max 60% higher than that of the controls. Neutrophil counts tended to be lower in the group of marathoners, while other leukocyte and lymphocyte subsets were similar to controls. Mitogen-induced lymphocyte proliferation did not differ between groups. Natural killer cell cyto-toxic activity (NKCA) was significantly higher in the marathoners versus controls (373 ± 38 vs 237 ± 41 total lytic units, respectively, a 57% difference, P = 0.02). For all subjects combined (N = 40) and within the group of marathon runners (N — 22), percent body fat was negatively correlated with NKCA (r = -0.48, P = 0.002; r = -0.49, P = 0.019, respectively), and age was negatively correlated with Con A-induccd lymphocyte proliferation (r = -0.41, P = 0.009; r = -0.53, P = 0.011, respectively). These data indicate that NKCA but not mitogen-induced lymphocyte proliferation is higher in marathon runners relative to sedentary controls.