ALVES, Claudênio Diógenes. Estudo dos efeitos renais do veneno da serpente Lachesis muta muta. 2010. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-09T12:58:57Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_cdalves.pdf: 4300542 bytes, checksum: de3362ca9fe623e05244ea729c64ba4e (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-12T12:12:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_cdalves.pdf: 4300542 bytes, checksum: de3362ca9fe623e05244ea729c64ba4e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-12T12:12:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_cdalves.pdf: 4300542 bytes, checksum: de3362ca9fe623e05244ea729c64ba4e (MD5) Previous issue date: 2010 / The accident caused by the snake Lachesis muta muta is serious and its venom is responsible for many systemic changes, such as hypotension. In this work, the renal effects of the total venom of this snake in the renal perfusion system and in cultured renal tubular cells of the type MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) are investigated. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250 to 300g, were perfused with previously dialysed, Krebs-Henseleit solution containing 6% w/v bovine albumin. The effects of the venom (10 mg / mL, n = 6) on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR), sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) were submitted to analysis. Lachesis muta muta venom was added to the system after 30 minutes of internal control. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% v/v fetal bovine serum and then assessed in the presence of the total venom of the snake Lachesis muta muta in the concentrations of 1μg/mL, 10μg/mL and 100μg/mL 24 hours afterwards, tests concerning viability and cellular cytotoxicity were brought about. The total venom (10μg/mL) promoted a transient reduction in perfusion pressure (C60= 108.27 ± 4.88; VT L. m. muta60= 88.17 ± 5.27#; C90= 108.69 ± 5.08; VT L. m. muta90= 78.71 ± 6.94#*) and renal vascular resistance (C60= 5.57 ± 0.49; VT L. m. muta60= 3.50 ± 0.22#; C90= 5.32 ± 0.57; VT L. m. muta90= 3.11 ± 0.26#*); increase in urinary flow (C60= 0.158 ± 0.015; VT L. m. muta60= 0.100 ± 0.012#; C120= 0.160 ± 0.020; VT L. m. muta120= 0.777± 0.157#*) and in glomerular filtration rate (C60= 0.707 ± 0.051; VT L. m. muta60= 0.232 ± 0.042#; C120= 0.697 ± 0.084; VT L. m. muta120= 1.478 ± 0.278#*). Such a concentration also reduced significantly sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) in the three periods analyzed (30, 60 and 90 minutes), with a consequent increase in the osmotic clearance (Cosm) (C90= 0.141 ± 0.011; VT L. m. muta90= 0.309 ± 0.090; C120= 0.125 ± 0.016; VT L. m. muta120= 0.839 ± 0,.184#*). Histological analysis of the kidneys perfused with the poison revealed focal areas of renal tubular cells with nuclear pyknosis. The venom also promoted a cytotoxic effect on MDCK cells at concentrations 10μg/mL and 100μg/mL, thus reducing the viability of these cells to 38.60 ± 17.9% and 10.62 ± 2.9%, respectively. These results demonstrate that the venom of Lachesis muta muta altered all the renal parameters assessed in renal perfusion, inducing transient hypotension and intense diuresis. The venom also exhibits cytotoxic activity on MDCK cells after 24 hours of incubation. / O acidente causado pela serpente Lachesis muta muta é grave e o seu veneno é responsável por uma série de alterações sistêmicas, como a hipotensão arterial. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais do veneno total desta serpente em sistema de perfusão renal e em cultura de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com Solução de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos do veneno (10 µg/mL; n=6) sobre a Pressão de Perfusão (PP), Resistência Vascular Renal (RVR), Fluxo Urinário (FU), Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa+), de Potássio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). O veneno da Lachesis muta muta foi adicionado após 30 minutos de controle interno. As células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e então avaliadas na presença do veneno total da serpente Lachesis muta muta nas concentrações 1μg/mL, 10μg/mL e 100μg/mL. Após 24 horas de experimento, foram realizados ensaios de viabilidade e citotoxicidade celular. O veneno total, na dose de 10μg/mL, causou redução transitória na pressão de perfusão (C60= 108,27 ± 4,88 mmHg; VT L. m. muta60= 88,17 ± 5,27# mmHg; C90= 108,69 ± 5,08 mmHg; VT L. m. muta90= 78,71 ± 6,94#* mmHg) e na resistência vascular renal (C60= 5,57 ± 0,49 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 3,50 ± 0,22# mmHg/mL.g-1.min-1; C90= 5,32 ± 0,57 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta90= 3,11 ± 0,26#* mmHg/mL.g-1.min-1) além de aumento do fluxo urinário (C60= 0,158 ± 0,015 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,100 ± 0,012# mL.g-1. min-1; C120= 0,160 ± 0,020 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 0,777± 0,157#*) e do ritmo de filtração glomerular (C60= 0,707 ± 0,051 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,232 ± 0,042# mL.g-1.min-1; C120= 0,697 ± 0,084 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 1,478 ± 0,278#* mL.g-1.min-1). A dose estudada também promoveu redução significativa do percentual de transporte tubular de sódio (%TNa+), potássio (%TK+) e cloreto (%TCl-) nos três períodos analisados (30, 60 e 90 minutos), com conseqüente aumento do clearence osmótico(Cosm) (C90= 0,141 ± 0,011; VT L. m. muta90= 0,309 ± 0,090; C120= 0,125 ± 0,016; VT L. m. muta120= 0,839 ± 0,184#*). A avaliação histopatológica revelou a presença de áreas focais com células com núcleos picnóticos nos túbulos renais dos rins perfundidos com veneno. O veneno também apresentou efeito citotóxico sobre as células MDCK apenas nas concentrações de 10µg/mL e 100µg/mL reduzindo a viabilidade destas células a 38,60 ± 17,9% e 10,62 ± 2,9%, respectivamente. Estes resultados demonstram que o veneno total da Lachesis muta muta alterou todos os parâmetros renais avaliados na perfusão renal, induzindo hipotensão transitória e intensa diurese. O veneno também possui ação citotóxica sobre as células MDCK após 24 horas de incubação.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O acidente causado pela serpente Lachesis muta muta à grave e o seu veneno à responsÃvel por uma sÃrie de alteraÃÃes sistÃmicas, como a hipotensÃo arterial. Neste trabalho, foram investigados os efeitos renais do veneno total desta serpente em sistema de perfusÃo renal e em cultura de cÃlulas tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram isolados e perfundidos com SoluÃÃo de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos do veneno (10 Âg/mL; n=6) sobre a PressÃo de PerfusÃo (PP), ResistÃncia Vascular Renal (RVR), Fluxo UrinÃrio (FU), Ritmo de FiltraÃÃo Glomerular (RFG), Percentual de Transporte Tubular de SÃdio (%TNa+), de PotÃssio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). O veneno da Lachesis muta muta foi adicionado apÃs 30 minutos de controle interno. As cÃlulas MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e entÃo avaliadas na presenÃa do veneno total da serpente Lachesis muta muta nas concentraÃÃes 1μg/mL, 10μg/mL e 100μg/mL. ApÃs 24 horas de experimento, foram realizados ensaios de viabilidade e citotoxicidade celular. O veneno total, na dose de 10μg/mL, causou reduÃÃo transitÃria na pressÃo de perfusÃo (C60= 108,27  4,88 mmHg; VT L. m. muta60= 88,17  5,27# mmHg; C90= 108,69  5,08 mmHg; VT L. m. muta90= 78,71  6,94#* mmHg) e na resistÃncia vascular renal (C60= 5,57  0,49 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 3,50  0,22# mmHg/mL.g-1.min-1; C90= 5,32  0,57 mmHg/mL.g-1.min-1; VT L. m. muta90= 3,11  0,26#* mmHg/mL.g-1.min-1) alÃm de aumento do fluxo urinÃrio (C60= 0,158  0,015 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,100  0,012# mL.g-1. min-1; C120= 0,160  0,020 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 0,777 0,157#*) e do ritmo de filtraÃÃo glomerular (C60= 0,707  0,051 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta60= 0,232  0,042# mL.g-1.min-1; C120= 0,697  0,084 mL.g-1.min-1; VT L. m. muta120= 1,478  0,278#* mL.g-1.min-1). A dose estudada tambÃm promoveu reduÃÃo significativa do percentual de transporte tubular de sÃdio (%TNa+), potÃssio (%TK+) e cloreto (%TCl-) nos trÃs perÃodos analisados (30, 60 e 90 minutos), com conseqÃente aumento do clearence osmÃtico(Cosm) (C90= 0,141  0,011; VT L. m. muta90= 0,309  0,090; C120= 0,125  0,016; VT L. m. muta120= 0,839  0,184#*). A avaliaÃÃo histopatolÃgica revelou a presenÃa de Ãreas focais com cÃlulas com nÃcleos picnÃticos nos tÃbulos renais dos rins perfundidos com veneno. O veneno tambÃm apresentou efeito citotÃxico sobre as cÃlulas MDCK apenas nas concentraÃÃes de 10Âg/mL e 100Âg/mL reduzindo a viabilidade destas cÃlulas a 38,60  17,9% e 10,62  2,9%, respectivamente. Estes resultados demonstram que o veneno total da Lachesis muta muta alterou todos os parÃmetros renais avaliados na perfusÃo renal, induzindo hipotensÃo transitÃria e intensa diurese. O veneno tambÃm possui aÃÃo citotÃxica sobre as cÃlulas MDCK apÃs 24 horas de incubaÃÃo. / The accident caused by the snake Lachesis muta muta is serious and its venom is responsible for many systemic changes, such as hypotension. In this work, the renal effects of the total venom of this snake in the renal perfusion system and in cultured renal tubular cells of the type MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) are investigated. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250 to 300g, were perfused with previously dialysed, Krebs-Henseleit solution containing 6% w/v bovine albumin. The effects of the venom (10 mg / mL, n = 6) on the perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR), sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) were submitted to analysis. Lachesis muta muta venom was added to the system after 30 minutes of internal control. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% v/v fetal bovine serum and then assessed in the presence of the total venom of the snake Lachesis muta muta in the concentrations of 1μg/mL, 10μg/mL and 100μg/mL 24 hours afterwards, tests concerning viability and cellular cytotoxicity were brought about. The total venom (10μg/mL) promoted a transient reduction in perfusion pressure (C60= 108.27  4.88; VT L. m. muta60= 88.17  5.27#; C90= 108.69  5.08; VT L. m. muta90= 78.71  6.94#*) and renal vascular resistance (C60= 5.57  0.49; VT L. m. muta60= 3.50  0.22#; C90= 5.32  0.57; VT L. m. muta90= 3.11  0.26#*); increase in urinary flow (C60= 0.158  0.015; VT L. m. muta60= 0.100  0.012#; C120= 0.160  0.020; VT L. m. muta120= 0.777 0.157#*) and in glomerular filtration rate (C60= 0.707  0.051; VT L. m. muta60= 0.232  0.042#; C120= 0.697  0.084; VT L. m. muta120= 1.478  0.278#*). Such a concentration also reduced significantly sodium tubular transport (%TNa+), potassium tubular transport (%TK+) and chloride tubular transport (%TCl-) in the three periods analyzed (30, 60 and 90 minutes), with a consequent increase in the osmotic clearance (Cosm) (C90= 0.141  0.011; VT L. m. muta90= 0.309  0.090; C120= 0.125  0.016; VT L. m. muta120= 0.839  0,.184#*). Histological analysis of the kidneys perfused with the poison revealed focal areas of renal tubular cells with nuclear pyknosis. The venom also promoted a cytotoxic effect on MDCK cells at concentrations 10μg/mL and 100μg/mL, thus reducing the viability of these cells to 38.60  17.9% and 10.62  2.9%, respectively. These results demonstrate that the venom of Lachesis muta muta altered all the renal parameters assessed in renal perfusion, inducing transient hypotension and intense diuresis. The venom also exhibits cytotoxic activity on MDCK cells after 24 hours of incubation.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

En la presente investigación se estudian las propiedades, bioquímicas, biológicas, inmunológicas y moleculares de una isoforma básica de Fosfolipasa A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta(PLA2básicaL.muta). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, filtración y de alta performance; la enzima fue purificada 41,2 veces con un rendimiento de 64%. Se obtuvo una única banda proteica de 14,7 kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrando ser una proteína monomérica. Su pH óptimo es de 7,8 y es fuertemente inhibida por el PMSF, EDTA y glutatión. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo la dosis hemolítica media (DH50) en 4,35µg, la dosis miotóxica mínima (DMM) en 18,96µg/ml y la dosis edemática mínima (DEM) 23,56μg. La enzima no mostró actividad hemorrágica ni acción anticoagulante. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2básicaL.muta es reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilachésico (INSPerú). Empleando la metodología de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa del cDNA de PLA2básicaL.muta, con 445 pb; análisis bioinformáticos indican que la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleótidos que codifica un péptido señal de 16 aminoácidos y una proteína madura de 122 residuos, el peso molecular fue de 13,86 kDa y un pI de 8,316. La secuencia aminoacídica, contiene residuos conservados para el sitio catalítico, His48, Asp49, Tyr52 así como para unión al Ca+2, Tyr18, Gly30 y Gly32. El modelaje tridimensional de la PLA2, muestra que está formada por tres hélices-, una lámina- y un lazo de unión al Ca+2. PLA2básicaL.muta mostró alta homología estructural con otras sPLA2 de venenos de serpientes. Finalmente, los estudios revelan que la PLA2básicaL.muta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] básicas de bajo peso molecular. Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y función de una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana. Palabras claves: Fosfolipasa A2, Isoenzima, Lachesis muta, sitio farmacológico, transcrito. / --- In the present research the biochemical, biological, immunological, as well as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicL.muta), were studied. This enzyme was purified using ion exchange, filtration and high performance chromatographical steps, respectively. The enzyme was purified 41,2 times with a yield of 64%. SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 14,7 kDa under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single polypeptide chain. Furthermore, the enzyme had a optimal pH of 7,8 and was inhibited by PMSF, EDTA and glutation. In relation to its biologic activity, a Medium Hemolytic Doses (DH50) of 4,35µg/tube, Minimum Miotoxic Doses (MMD) of 18,96µg/ml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 91,5μg were obtained. For another hand, the PLA2 didn´t show either hemorrhagic or anticoagulant activities, and was recognized and partially inhibited by monovalent antilachesic serum (INS-Perú) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Using RT-PCR methodology and bioinformátics analysis the complete cDNA sequence of PLA2basicL.muta with 445 bp and an open reading frames of 414 nucleotides, were obtained, which encodes a peptide signal of 16 amino acids and a matured protein of 122 residues with 13, 86 kDa and a pI value of 8,3, calculated by in silico analysis. The amino acidic sequence contains conserved residues of His48, Asp49, Tyr52 in the catalytic site, as well as Tyr18, Gly30 y Gly32 in the Ca+2 -binding site. Three-dimensional model of PLA2basicL.muta showed that was conformed by three α-helix, one β-sheet and one Ca+2 -binding ribbon. PLA2basicL.muta shows a high structural homology with other snake venom phospholipases. Finally, studies reveal that PLA2basicL.muta belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49]. This work is the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom enzyme. Key words: Phospholipase A2, Isoenzyme, Lachesis muta, pharmacologic site, transcript. / Tesis

El envenenamiento por la serpiente Lachesis muta presenta una fisiopatología compleja debido a la presencia de un numeroso grupo de enzimas como la fosfolipasa A2 (FLA2). Por ello, en el presente estudio se ha investigado algunas propiedades bioquímicas de la FLA2 y sus efectos biológicos in vitro e in vivo. Inicialmente la enzima fue purificada mediante dos pasos cromatográficos un CM-Sephadex C-50 seguido por un Sephadex G-50, obteniéndose un factor de purificación de 55.3 veces con un rendimiento de 34.1% y se obtuvo una única banda proteica de 18749 Da, empleando la técnica de PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrándose que la FLA2 es una proteína monomérica. La enzima es termoestable manteniendo su actividad total a 100°C por 10 minutos, es además una enzima dependiente del ion calcio y es fuertemente inhibida por glutation, cisteína, EDTA y PMSF reduciendo su actividad hasta más del 50%. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo que la Dosis hemolítica media (DH50) es 4.35µg y de 67.6µg para la enzima pura y el veneno respectivamente por lo que FLA2 es 15.5 veces más hemolítica que el veneno total. Así mismo se ha demostrado que la dosis miotóxica mínima (DMM) fue muy baja con un valor de 125, 89 μg/ml mientras que para el veneno crudo fue de 144,21 μg/ml. Además, la dosis edemática mínima (DEM) de la enzima fue 91.5 μg. Por otra parte la enzima no mostró actividad hemorrágica usando hasta 30 μg pero en cambio, si mostró tener acción anticoagulante retardando el tiempo de coagulación del plasma citratado a medida que se incremento la concentración de FLA2. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que FLA2 tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú), así como una neutralización parcial de la actividad enzimática y hemolítica por acción de dicho suero antiofídico. / The Lachesis muta’s envenomations induce a complex physiopathology due to the presence of numerous enzymes group such as Phospholipase A2 (PLA2). For this reason, in the present study have been investigated some biochemistries’ properties of PLA2 and its in vitro and in vivo biologics effect. Initially, the enzyme was purified in two chromatographics steps, CM-Sephadex C-50 followed by Sephadex G-50, obtaining a purification factor of 55.3 times and with a yield of 34.1% and a unique protein band of 18749 Da was obtained by SDS-PAGE analysis under reducing and non-reducing conditions, indicating that PLA2 is a monomeric protein. The protein is thermostable maintaining its total activity until 100ºC per 10 minutes, so, it is a Calcium ion depending protein and the activity was strongly inhibited by glutation, cistein, ESTA and PMSF which reduce until more 50% of PLA2 activity. As far as its biologic activity was obtain that Media Hemolytic Doses (DH50) was 4.35µg and 67.6µg to pure enzyme and crude venom respectively, this indicate that PLA2 is 15,5 times more hemolytic than crude venom. Likewise, had demonstrated that Minimum Miotoxic Doses (MMD) is very low to PLA2 (125. 89 μg/ml) while to crude venom was 144,21 μg/ml. The enzyme’s Minimum Edematic Doses (MED) was 91.5 μg. For another hand, the PLA2 didn´t show any hemorrhagic activity until 30 μg but it showed has anticoagulant activity on citrated plasma when the PLA2 concentration was increasing. Additionally, the inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis probes showed PLA2 had inmunogenic reactivity against anti lachesic nonovalent serum (INS-Perú), as well as a partial enzymatic activity and hemolytic neutralization. / Tesis

El envenenamiento por la serpiente Lachesis muta presenta una fisiopatología compleja debido a la presencia de un numeroso grupo de enzimas como la fosfolipasa A2 (FLA2). Por ello, en el presente estudio se ha investigado algunas propiedades bioquímicas de la FLA2 y sus efectos biológicos in vitro e in vivo. Inicialmente la enzima fue purificada mediante dos pasos cromatográficos un CM-Sephadex C-50 seguido por un Sephadex G-50, obteniéndose un factor de purificación de 55.3 veces con un rendimiento de 34.1% y se obtuvo una única banda proteica de 18749 Da, empleando la técnica de PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrándose que la FLA2 es una proteína monomérica. La enzima es termoestable manteniendo su actividad total a 100°C por 10 minutos, es además una enzima dependiente del ion calcio y es fuertemente inhibida por glutation, cisteína, EDTA y PMSF reduciendo su actividad hasta más del 50%. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo que la Dosis hemolítica media (DH50) es 4.35µg y de 67.6µg para la enzima pura y el veneno respectivamente por lo que FLA2 es 15.5 veces más hemolítica que el veneno total. Así mismo se ha demostrado que la dosis miotóxica mínima (DMM) fue muy baja con un valor de 125, 89 μg/ml mientras que para el veneno crudo fue de 144,21 μg/ml. Además, la dosis edemática mínima (DEM) de la enzima fue 91.5 μg. Por otra parte la enzima no mostró actividad hemorrágica usando hasta 30 μg pero en cambio, si mostró tener acción anticoagulante retardando el tiempo de coagulación del plasma citratado a medida que se incremento la concentración de FLA2. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que FLA2 tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú), así como una neutralización parcial de la actividad enzimática y hemolítica por acción de dicho suero antiofídico. / The Lachesis muta’s envenomations induce a complex physiopathology due to the presence of numerous enzymes group such as Phospholipase A2 (PLA2). For this reason, in the present study have been investigated some biochemistries’ properties of PLA2 and its in vitro and in vivo biologics effect. Initially, the enzyme was purified in two chromatographics steps, CM-Sephadex C-50 followed by Sephadex G-50, obtaining a purification factor of 55.3 times and with a yield of 34.1% and a unique protein band of 18749 Da was obtained by SDS-PAGE analysis under reducing and non-reducing conditions, indicating that PLA2 is a monomeric protein. The protein is thermostable maintaining its total activity until 100ºC per 10 minutes, so, it is a Calcium ion depending protein and the activity was strongly inhibited by glutation, cistein, ESTA and PMSF which reduce until more 50% of PLA2 activity. As far as its biologic activity was obtain that Media Hemolytic Doses (DH50) was 4.35µg and 67.6µg to pure enzyme and crude venom respectively, this indicate that PLA2 is 15,5 times more hemolytic than crude venom. Likewise, had demonstrated that Minimum Miotoxic Doses (MMD) is very low to PLA2 (125. 89 μg/ml) while to crude venom was 144,21 μg/ml. The enzyme’s Minimum Edematic Doses (MED) was 91.5 μg. For another hand, the PLA2 didn´t show any hemorrhagic activity until 30 μg but it showed has anticoagulant activity on citrated plasma when the PLA2 concentration was increasing. Additionally, the inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis probes showed PLA2 had inmunogenic reactivity against anti lachesic nonovalent serum (INS-Perú), as well as a partial enzymatic activity and hemolytic neutralization.

O envenenamento humano por Lachesis, embora pouco freqüente, é bastante severo, caracterizado por pronunciado dano tecidual local e efeitos sistêmicos, como hipotensão e bradicardia, tonturas, náuseas, cólicas abdominais e diarréia. A soroterapia é única terapia específica disponível. Entretanto, para muitas plantas é atribuída ação antiofídica. No Norte e Nordeste brasileiro, o suco da fruta (SAm) e o extrato aquoso de folhas (EFAm) de graviola (Annona muricata) são freqüentemente usados pela população local para tratar o envenenamento por Lachesis muta rhombeata. O objetivo deste estudo foi avaliar a letalidade, as alterações de parâmetros hematológicos, bioquímicos, de pressão arterial e processo inflamatório induzidos pela peçonha de L. m. rhombeata (PLmr), bem como a relevância do tratamento com EFAm e SAm no envenenamento. O perfil hematológico mostra uma hemoconcentração inicial seguida de extensa hemólise, evidenciada pela redução do hematócrito, hemoglobina total e contagem global de eritrócitos, não alterado pelos tratamentos. A contagem diferencial de leucócitos revela neutrofilia nas primeiras horas de envenenamento e aumento de linfócitos 24h após a injeção da peçonha, características de processo inflamatório agudo, não influenciado pelos tratamentos. Houve diminuição de albumina e proteínas totais e aumento de uréia, decorrentes do envenenamento. Os valores de AST foram ainda maiores nos animais tratados, mas os aumentos de CK foram reduzidos pelos tratamentos com EFAm e SAm. Houve aumento de TP e TTPA na primeira hora, e diminuição da pressão arterial tempo dependente no envenenamento. O suco intensificou a queda da pressão. Foi observado aumento de IL-6 nas primeiras horas de envenenamento e alterações das proteínas plasmáticas características de processo inflamatório agudo, como esperado em casos de envenenamento. O ensaio de letalidade revela DL50 de 51,0 ± 6,3 mg/kg, para o grupo injetados com a peçonha e sem tratamento; de 56,3 ± 8,5 mg/kg, para o grupo injetado com a peçonha e tratado com SAm e de 62,2 ± 6,8 mg/kg, para o grupo injetado com a peçonha e tratado com EFAm. Concluindo, o quadro clínico do envenenamento laquético foi bem analisado, que era o objetivo principal do trabalho. Avaliou-se também a eficiência do uso popular da graviola (A. muricata) nos acidentes ofídicos com a serpente L. m. rhombeata. De forma geral, os tratamentos com EFAm e com SAm não alteram de forma relevante o quadro clínico do envenenamento, como observado pelos valores semelhantes de DL50. Entretanto, o tratamento com suco parece agravar a hipotensão causada pelo envenenamento e provocar um aumento significativo das transaminases hepáticas. Por outro lado, é possível notar nos animais tratados menores alterações da hemostasia, bem como uma possível proteção contra a miotoxicidade da peçonha. / The human envenomation by Lachesis, although rare, is quite severe, characterized by pronounced local tissue damage and systemic effects, such as hypotension and bradycardia, dizziness, nausea, abdominal cramps and diarrhea. The only specific therapy available is the serum therapy. However, for many plants is attributed antiophidic action. In North and Northeast Brazil, the fruit juice and the aqueous extract of leaves of soursop (Annona muricata) are often used by local population to treat Lachesis muta rhombeata envenomation. The aim of this study was evaluate the lethality, hematological, biochemical, blood pressure, and inflammation parameters induced by L. m. rhombeata snake venom, as well as the relevance of treatment with fruit juice and the aqueous extract of leaves of soursop. The hematological parameters shows an initial hemoconcentration followed by extensive hemolysis, as evidenced by decreased hematocrit, total hemoglobin and total red blood cells count, which were not altered by the treatments. The leukocytes differential count revealed neutrophilia in the early hours after the envenomation and increased lymphocytes 24h after the injection of L. m. rhombeata venom, characteristics of acute inflammatory process, which were not influenced by treatments. There was a decrease of albumin and total proteins and urea increased as a result of the envenomation. The AST concentration were still higher in treated animals, although the increases in CK values were reduced by treatments with leaves extract and soursop juice. There was an increase of prothrombin time and activated partial thromboplastin time during the first hour, and there were time dependent decrease of the blood pressure after the envenomation. The juice intensified the pressure decrease. An increase of IL-6 was observed in the early hours after the envenomation, as well as changes in the profile of plasmatic proteins, characteristic of acute inflammatory process, as expected in cases of snake bite. The lethality assay reveals LD50 of 51,0 ± 6,3 mg / kg for the group injected with venom without treatment; 48,3 ± 8,6 mg /kg for the group injected with venom and treated with juice of A. muricata; and 62,2 ± 6,8 mg/kg for the group injected with venom and treated with leaves extract of A. muricata. In conclusion, the clinical profile of L. m. rhmobeata envenomation was well analyzed, the main goal of this work. The efficiency of the popular use of soursop on envenomation by L. m. rhombeata snakes was also evaluated. In general, treatments with extracts of leaves and soursop juice do not significantly modify the clinical profile of the envenomation, as observed by similar LD50 values. However, treatment with juice seems to worsen the hypotension caused by envenomation and induce a significant increase in AST levels. On the other hand, there are lower changes in hemostasis on treated animals, as well as a possible protection against the myotoxicity of the venom.