As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

O envenenamento humano por Lachesis, embora pouco freqüente, é bastante severo, caracterizado por pronunciado dano tecidual local e efeitos sistêmicos, como hipotensão e bradicardia, tonturas, náuseas, cólicas abdominais e diarréia. A soroterapia é única terapia específica disponível. Entretanto, para muitas plantas é atribuída ação antiofídica. No Norte e Nordeste brasileiro, o suco da fruta (SAm) e o extrato aquoso de folhas (EFAm) de graviola (Annona muricata) são freqüentemente usados pela população local para tratar o envenenamento por Lachesis muta rhombeata. O objetivo deste estudo foi avaliar a letalidade, as alterações de parâmetros hematológicos, bioquímicos, de pressão arterial e processo inflamatório induzidos pela peçonha de L. m. rhombeata (PLmr), bem como a relevância do tratamento com EFAm e SAm no envenenamento. O perfil hematológico mostra uma hemoconcentração inicial seguida de extensa hemólise, evidenciada pela redução do hematócrito, hemoglobina total e contagem global de eritrócitos, não alterado pelos tratamentos. A contagem diferencial de leucócitos revela neutrofilia nas primeiras horas de envenenamento e aumento de linfócitos 24h após a injeção da peçonha, características de processo inflamatório agudo, não influenciado pelos tratamentos. Houve diminuição de albumina e proteínas totais e aumento de uréia, decorrentes do envenenamento. Os valores de AST foram ainda maiores nos animais tratados, mas os aumentos de CK foram reduzidos pelos tratamentos com EFAm e SAm. Houve aumento de TP e TTPA na primeira hora, e diminuição da pressão arterial tempo dependente no envenenamento. O suco intensificou a queda da pressão. Foi observado aumento de IL-6 nas primeiras horas de envenenamento e alterações das proteínas plasmáticas características de processo inflamatório agudo, como esperado em casos de envenenamento. O ensaio de letalidade revela DL50 de 51,0 ± 6,3 mg/kg, para o grupo injetados com a peçonha e sem tratamento; de 56,3 ± 8,5 mg/kg, para o grupo injetado com a peçonha e tratado com SAm e de 62,2 ± 6,8 mg/kg, para o grupo injetado com a peçonha e tratado com EFAm. Concluindo, o quadro clínico do envenenamento laquético foi bem analisado, que era o objetivo principal do trabalho. Avaliou-se também a eficiência do uso popular da graviola (A. muricata) nos acidentes ofídicos com a serpente L. m. rhombeata. De forma geral, os tratamentos com EFAm e com SAm não alteram de forma relevante o quadro clínico do envenenamento, como observado pelos valores semelhantes de DL50. Entretanto, o tratamento com suco parece agravar a hipotensão causada pelo envenenamento e provocar um aumento significativo das transaminases hepáticas. Por outro lado, é possível notar nos animais tratados menores alterações da hemostasia, bem como uma possível proteção contra a miotoxicidade da peçonha. / The human envenomation by Lachesis, although rare, is quite severe, characterized by pronounced local tissue damage and systemic effects, such as hypotension and bradycardia, dizziness, nausea, abdominal cramps and diarrhea. The only specific therapy available is the serum therapy. However, for many plants is attributed antiophidic action. In North and Northeast Brazil, the fruit juice and the aqueous extract of leaves of soursop (Annona muricata) are often used by local population to treat Lachesis muta rhombeata envenomation. The aim of this study was evaluate the lethality, hematological, biochemical, blood pressure, and inflammation parameters induced by L. m. rhombeata snake venom, as well as the relevance of treatment with fruit juice and the aqueous extract of leaves of soursop. The hematological parameters shows an initial hemoconcentration followed by extensive hemolysis, as evidenced by decreased hematocrit, total hemoglobin and total red blood cells count, which were not altered by the treatments. The leukocytes differential count revealed neutrophilia in the early hours after the envenomation and increased lymphocytes 24h after the injection of L. m. rhombeata venom, characteristics of acute inflammatory process, which were not influenced by treatments. There was a decrease of albumin and total proteins and urea increased as a result of the envenomation. The AST concentration were still higher in treated animals, although the increases in CK values were reduced by treatments with leaves extract and soursop juice. There was an increase of prothrombin time and activated partial thromboplastin time during the first hour, and there were time dependent decrease of the blood pressure after the envenomation. The juice intensified the pressure decrease. An increase of IL-6 was observed in the early hours after the envenomation, as well as changes in the profile of plasmatic proteins, characteristic of acute inflammatory process, as expected in cases of snake bite. The lethality assay reveals LD50 of 51,0 ± 6,3 mg / kg for the group injected with venom without treatment; 48,3 ± 8,6 mg /kg for the group injected with venom and treated with juice of A. muricata; and 62,2 ± 6,8 mg/kg for the group injected with venom and treated with leaves extract of A. muricata. In conclusion, the clinical profile of L. m. rhmobeata envenomation was well analyzed, the main goal of this work. The efficiency of the popular use of soursop on envenomation by L. m. rhombeata snakes was also evaluated. In general, treatments with extracts of leaves and soursop juice do not significantly modify the clinical profile of the envenomation, as observed by similar LD50 values. However, treatment with juice seems to worsen the hypotension caused by envenomation and induce a significant increase in AST levels. On the other hand, there are lower changes in hemostasis on treated animals, as well as a possible protection against the myotoxicity of the venom.

O envenenamento humano por Lachesis, embora pouco freqüente, é bastante severo, caracterizado por pronunciado dano tecidual local e efeitos sistêmicos, como hipotensão e bradicardia, tonturas, náuseas, cólicas abdominais e diarréia. A soroterapia é única terapia específica disponível. Entretanto, para muitas plantas é atribuída ação antiofídica. No Norte e Nordeste brasileiro, o suco da fruta (SAm) e o extrato aquoso de folhas (EFAm) de graviola (Annona muricata) são freqüentemente usados pela população local para tratar o envenenamento por Lachesis muta rhombeata. O objetivo deste estudo foi avaliar a letalidade, as alterações de parâmetros hematológicos, bioquímicos, de pressão arterial e processo inflamatório induzidos pela peçonha de L. m. rhombeata (PLmr), bem como a relevância do tratamento com EFAm e SAm no envenenamento. O perfil hematológico mostra uma hemoconcentração inicial seguida de extensa hemólise, evidenciada pela redução do hematócrito, hemoglobina total e contagem global de eritrócitos, não alterado pelos tratamentos. A contagem diferencial de leucócitos revela neutrofilia nas primeiras horas de envenenamento e aumento de linfócitos 24h após a injeção da peçonha, características de processo inflamatório agudo, não influenciado pelos tratamentos. Houve diminuição de albumina e proteínas totais e aumento de uréia, decorrentes do envenenamento. Os valores de AST foram ainda maiores nos animais tratados, mas os aumentos de CK foram reduzidos pelos tratamentos com EFAm e SAm. Houve aumento de TP e TTPA na primeira hora, e diminuição da pressão arterial tempo dependente no envenenamento. O suco intensificou a queda da pressão. Foi observado aumento de IL-6 nas primeiras horas de envenenamento e alterações das proteínas plasmáticas características de processo inflamatório agudo, como esperado em casos de envenenamento. O ensaio de letalidade revela DL50 de 51,0 ± 6,3 mg/kg, para o grupo injetados com a peçonha e sem tratamento; de 56,3 ± 8,5 mg/kg, para o grupo injetado com a peçonha e tratado com SAm e de 62,2 ± 6,8 mg/kg, para o grupo injetado com a peçonha e tratado com EFAm. Concluindo, o quadro clínico do envenenamento laquético foi bem analisado, que era o objetivo principal do trabalho. Avaliou-se também a eficiência do uso popular da graviola (A. muricata) nos acidentes ofídicos com a serpente L. m. rhombeata. De forma geral, os tratamentos com EFAm e com SAm não alteram de forma relevante o quadro clínico do envenenamento, como observado pelos valores semelhantes de DL50. Entretanto, o tratamento com suco parece agravar a hipotensão causada pelo envenenamento e provocar um aumento significativo das transaminases hepáticas. Por outro lado, é possível notar nos animais tratados menores alterações da hemostasia, bem como uma possível proteção contra a miotoxicidade da peçonha. / The human envenomation by Lachesis, although rare, is quite severe, characterized by pronounced local tissue damage and systemic effects, such as hypotension and bradycardia, dizziness, nausea, abdominal cramps and diarrhea. The only specific therapy available is the serum therapy. However, for many plants is attributed antiophidic action. In North and Northeast Brazil, the fruit juice and the aqueous extract of leaves of soursop (Annona muricata) are often used by local population to treat Lachesis muta rhombeata envenomation. The aim of this study was evaluate the lethality, hematological, biochemical, blood pressure, and inflammation parameters induced by L. m. rhombeata snake venom, as well as the relevance of treatment with fruit juice and the aqueous extract of leaves of soursop. The hematological parameters shows an initial hemoconcentration followed by extensive hemolysis, as evidenced by decreased hematocrit, total hemoglobin and total red blood cells count, which were not altered by the treatments. The leukocytes differential count revealed neutrophilia in the early hours after the envenomation and increased lymphocytes 24h after the injection of L. m. rhombeata venom, characteristics of acute inflammatory process, which were not influenced by treatments. There was a decrease of albumin and total proteins and urea increased as a result of the envenomation. The AST concentration were still higher in treated animals, although the increases in CK values were reduced by treatments with leaves extract and soursop juice. There was an increase of prothrombin time and activated partial thromboplastin time during the first hour, and there were time dependent decrease of the blood pressure after the envenomation. The juice intensified the pressure decrease. An increase of IL-6 was observed in the early hours after the envenomation, as well as changes in the profile of plasmatic proteins, characteristic of acute inflammatory process, as expected in cases of snake bite. The lethality assay reveals LD50 of 51,0 ± 6,3 mg / kg for the group injected with venom without treatment; 48,3 ± 8,6 mg /kg for the group injected with venom and treated with juice of A. muricata; and 62,2 ± 6,8 mg/kg for the group injected with venom and treated with leaves extract of A. muricata. In conclusion, the clinical profile of L. m. rhmobeata envenomation was well analyzed, the main goal of this work. The efficiency of the popular use of soursop on envenomation by L. m. rhombeata snakes was also evaluated. In general, treatments with extracts of leaves and soursop juice do not significantly modify the clinical profile of the envenomation, as observed by similar LD50 values. However, treatment with juice seems to worsen the hypotension caused by envenomation and induce a significant increase in AST levels. On the other hand, there are lower changes in hemostasis on treated animals, as well as a possible protection against the myotoxicity of the venom.

O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy

O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5001.pdf: 2740278 bytes, checksum: 9d646e9df12b2864a43bac973517db51 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / A serpente Lachesis muta rhombeata (Viperidae), popularmente conhecida como surucucu pico-de-jaca, é uma subespécie de Lachesis muta endêmica na Mata Atlântica brasileira, podendo ser encontrada do Ceará até o Rio de Janeiro. O gênero Lachesis apresenta uma peçonha complexa que engloba diferentes proteínas que possuem uma ampla variedade de atividades biológicas, como por exemplo, aquelas que afetam os fatores da coagulação sanguínea, agem na fibrinólise, provocam uma ação inflamatória no local da picada, e induzem um choque hipotensivo. Com o auxílio de técnicas proteômicas e de Bioinformática, este projeto teve como objetivo principal analisar o proteoma da peçonha de L. m. rhombeata, identificando as principais famílias proteicas presentes. Para isso, 200μg da peçonha desta serpente foram aplicados em géis bidimensionais-2D. As proteínas obtidas foram extraídas dos géis, tratadas, e posteriormente identificadas e analisadas por meio de espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF). Os arquivos brutos provenientes dessas análises foram aplicados no programa MASCOT utilizando para a identificação proteica o banco de dados SwissProt e como especificação taxonômica o banco de dados SNAKES contido no site do NCBI. Foram identificadas 11 famílias proteicas: PLA2s (37,93%), inibidores de proteases (22,41%), proteínas de sinalização intracelular (13,79%), NGFs (5,17%), metaloproteases (3,45%), fatores associados à DDB1 e CUL4 (3,45%), oxidorredutases (3,45%), proteínas de transdução de sinal (1,72%), componentes do complemento (1,72%), proteínas NipSnap (1,72%) e proteínas lin-7 (1,72%), das quais a grande maioria é de função metabólica e ajuda na difusão/entrada dos componentes tóxicos no organismo da vítima/presa. Cerca de 1-5mg da mesma peçonha também foram analisados por meio de FPLC e sequenciamento proteico e as proteínas obtidas foram identificadas por meio de busca no banco de dados nr (nonredundant protein sequences) do NCBI utilizando a ferramenta blast-p. As seguintes famílias proteicas foram encontradas: serinoproteases (30,03%), metaloproteases (24,17%), BPPs (19,64%), PLA2s (14,95%), lectinas tipo C (1,94%), LAAOs (1,40%) e metaloendopeptidases (0,73%), ressaltando a toxicidade da peçonha. Os dois resultados obtidos foram comparados com proteomas de outras serpentes do gênero Lachesis encontrados na literatura. Observou-se que há uma grande similaridade entre os proteomas das peçonhas deste gênero, mas que alguns componentes proteicos são diferenciais e assim, podem ajudar na taxonomia destas serpentes, mantendo-as em suas respectivas espécies e subespécies. Além disso, a peçonha também foi analisada por eletroforese unidimensional (SDS-PAGE) para avaliar se o espécime em estudo era um neonato, um juvenil ou um adulto. A presença de uma proteína similar à mutalisina II (metaloprotease) confirmou que a L. m. rhombeata utilizada neste estudo era uma adulta. O conhecimento do proteoma da peçonha de L. m. rhombeata auxiliará (1) os estudos envolvendo a Sistemática do gênero e (2) a produção de novos fármacos que poderão ser desenvolvidos para o tratamento de diversas doenças.