Escherichia coli MutS is a DNA binding repair protein (97 kDa, monomer) and its biological significance arises from its recognition of mismatches which occur as errors during DNA replication. Mismatches and mutagenic bases represent a fascinating and diverse range of shapes and sizes and it is not obvious how a single protein (MutS) can recognise such molecular diversity against a huge background of canonical Watson-Crick base pairs. In this project, the structure of a 17mer mismatch GT DNA was carried out using NMR spectroscopy to identify the differences caused by the introduction of a non-canonical base pair on helical structure. The resulting structure was B-form in conformation and local helical distortions were observed about the GT mispair due primarily to its sheared orientation. The effect of mismatch orientation, sequence context and oligonucleotide length on mismatch stability was also investigated using UV absorbance melting and NMR spectroscopy. The results showed that substitution of a TG mispair for a GT mispair was accompanied by a small drop in melting temperature. It was also discovered that sequences in which purine-purine or pyrimidine-pyrimidine stacking occurred induced additional stability of the mismatch resulting in a higher melting temperature of the duplex.Affinity of mismatch GT DNA and its mismatch orientation, sequence context and length analogues for MutS was investigated by monitoring changes to the chemical shifts and linewidths of imino protons resonances during NMR titration. The results showed that MutS displayed higher affinity towards sequences which involved better stacking between the flanking base pairs and the GT/TG mispair.Analogous NMR structural investigations of 6-thioguanine modified 13mer GC DNA and its oxidised derivatives have been successfully carried out. The NMR structure was successfully determined of the former and the results obtained showed the effect on helical structure induced by the substitution of a different DNA lesion.Although the crystal structures of MutS bound to DNA mismatches have been known for a number of years, the analogous crystal structures of uncomplexed apo MutS have not been determined to date. Consequently, vital structural knowledge on the large change in conformation of MutS upon binding to the DNA mismatch is seriously lacking. We have successfully isolated the structurally and functionally important NTD of E. coli MutS and its labelled (13C, 15N) analogues and have shown that it is endowed with a stable, tertiary structural fold and well suited to NMR structure determination. This is exemplified by the assignments of several backbone amide and side chain resonances using isotope aided 3D NMR techniques.

DNA encodes the genetic information of the cell, therefore, every single living organism has a precise DNA damage response mechanism to safeguard DNA integrity. Base mismatches are endogenous DNA lesions introduced by the replicative polymerase during DNA replication. The conserved DNA mismatch repair pathway corrects these base mismatches. Mismatch repair initiation is orchestrated by two proteins, MutS and MutL. MutS recognizes and binds to base mismatches and relays the presence of the lesion to MutL. MutL, in turn, interacts with downstream factors to coordinate mismatch excision. The processivity clamp, typically known for its role in tethering the DNA polymerase to DNA during replication, is also involved in several steps of this repair process including MutL endonuclease activation and strand resynthesis. The dynamics of the MutS-MutL and MutL-processivity clamp interactions present one of the bottlenecks to uncovering the spatial and time organization of these protein assemblies. Therefore, little is known about the interactions that orchestrate the early steps of mismatch repair. The biochemical and structural work included in this thesis outlines a precise series of molecular cues that activate MutL. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-28Bitstream added on 2014-06-13T20:37:45Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_lmr_me_botfca.pdf: 618458 bytes, checksum: cb654c56905a6abeae0bdd7484f37739 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar a agressividade de linhagens de Ralstonia solanacearum provenientes de solanáceas, plantas ornamentais e eucalipto, em plantas de batata, tomate e fumo, bem como caracterizar as linhagens por meio de técnicas moleculares. Vinte e duas linhagens foram utilizadas nos ensaios de avaliação da agressividade, em experimentos conduzidos em casa-de-vegetação evidenciaram alta severidade da doença pelas linhagens de R. solanacearum quando inoculadas em plantas de tomate e batata, sendo a batata mais afetada nas inoculações. Todas as linhagens mostraram-se agressivas, sendo que o fumo mostrou baixa suscetibilidade ao ataque das bactérias. As linhagens mais agressivas em plantas de tomate foram IBSBF 309, IBSBF 1712, IBSBF 1839, IBSBF 1882, IBSBF 1883 e IBSBF 2000, pertencentes às biovares I, II e III. As linhagens mais agressivas às plantas de fumo foram IBSBF 309, IBSBF 2131 e IBSBF 292T, pertencentes à biovar I. Foi efetuado também ensaio de microbiolização in vitro em sementes de eucalipto, a fim de se identificar possíveis linhagens patogênicas a esta espécie vegetal e concluiu-se que todas as linhagens utilizadas infectaram plantas de eucalipto ou afetaram seu crescimento. A caracterização molecular de 41 linhagens de Ralstonia solanacearum, provenientes de diversas plantas hospedeiras, incluindo solanáceas, bananeira, helicônia, plantas ornamentais e eucalipto, foi efetuada empregando-se ERIC e BOX-PCR e os resultados mostraram grande diversidade genética entre as linhagens. A análise de PCR-RFLP da região espaçadora 16S-23S DNAr permitiu distinguir os isolados pertencentes à biovar III das demais biovares (I, II, IIA e IIT), quando digeridos com as enzimas Taq I e Hin6 I. A análise de sequenciamento de parte dos genes Endoglucanase (Egl) e MutS possibilitou a classificação em filotipos e os resultados... / This study aimed to evaluate the aggressiveness of strains of Ralstonia solanacearum from solanaceus, ornamental and eucalyptus plants, on potato, tomato and tobacco, and to characterize the strains through molecular techniques. Twenty-two strains were used in this study to evaluate the aggressiveness and, the experiments conducted in a greenhouse revealed the high susceptibility of tomato and potato plants, with the potato being the most affected on through the inoculations. All isolates proved to be aggressive and higher tolerance to the attack of bacteria was verified on tobacco plants. Strains more aggressive on tomato were IBSBF 309, IBSBF 1712, IBSBF 1839, IBSBF 1882, IBSBF 1883 and IBSBF 2000, belonging to biovars I, II and III. The more aggressive strains on the tobacco plants were IBSBF 309, IBSBF 292T and IBSBF 2131 belonging to biovar I. Tests in vitro of microbiolization of eucalyptus seeds were also performed in order to identify possible pathogenic strains to this species and the results showed that all strains used cause infection on emerging plants or affected their growth. To molecular characterization of 41 strains of Ralstonia solanacearum from several host plants including solanaceous, banana, heliconia, ornamentals and eucalyptus were employed to ERIC and BOX-PCR, and the results showed high genetic diversity among strains. The analysis of PCR-RFLP of 16S-23S spacer region rDNA allowed us to distinguish the isolates belonging to biovar III from the others (biovars I, II, IIA and IIT) when digested with enzymes Taq I and Hin6 I. The sequence analysis of the partial of Endoglucanase (Egl) and MutS genes allowed the classification in phylotypes and the results revealed a predominance of the phylotype II in Brazil, and four isolates were classified in the phylotype I, all belonging to biovar III

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Escherichia coli possède une grande plasticité génomique comme en témoigne la diversité des souches à l’intérieur de cette espèce bactérienne. Bien que la majorité des souches soient inoffensives ou à tout le moins opportunistes, plusieurs ont acquis des facteurs de virulence spécifiques leur procurant un pouvoir pathogénique. Les souches pathogènes comme E. coli O157 :H7 sont responsables de cas de morbidité, mortalité et pertes économiques importantes dans l’industrie agro-alimentaire dans le monde entier. L’évolution bactérienne est un mécanisme continuel qui se fait via l’échange d’éléments génétiques mobiles, de mutations ponctuelles et autres réarrangements génétiques. Ces changements génétiques peuvent procurer des avantages sélectifs permettant une adaptation bactérienne rapide face aux stress et changements environnementaux et favorisant le développement de pathogènes émergents. Dans la première partie de ce projet, nous avons étudié la région intergénique mutS-rpoS, qui est une des plus grandes sources de polymorphisme chromosomique chez les entérobactéries. Notre analyse génomique comparative a permis de confirmer le polymorphisme à l’intérieur même d’un ensemble de souches Escherichia spp., Salmonella spp. et Shigella spp. De plus, nous avons pu confirmer que certains types de polymorphismes dans la région mutS-rpoS étaient fortement associés à certains types de pathogènes chez E. coli. Dans notre analyse, nous avons ressorti un groupe de gènes à l’intérieur de la région mutS-rpoS qui pourraient sevir comme marqueur chromosomique intéressant pour les E. coli extra-intestinaux (ExPEC), un groupe comprennant des souches hautement pathogènes et difficiles à définir par les tests actuelllement disponibles. Dans notre analyse bio-informatique, nous avons isolé ce groupe de gènes associé aux ExPEC et nous l’avons caractérisé in sillico. Nous avons également inclus dans l’analyse deux souches hypermutables du genre Escherichia spp. de notre collection, isolées d’animaux de ferme. L’hypermutabilité ou la capacité d’acquérir des mutations plus rapidement que la normale accélère le processus d’évolution et la capacité d’adaptation de ces souches. La région mutS-rpoS est reliée au système de réparation de l’ADN bactérien (MMRS) et pourrait être impliquée dans l’apparition du phénotype d’hypermutabilité. Durant les dernières années, de plus en plus d’espèces du genre Escherichia ont été isolées de cas cliniques d’animaux et d’humains. Ces souches atypiques ont un potentiel de virulence très élevé, des combinaisons de gènes de virulence et des variants génétiques différents des souches typiques, et certaines souches ont même évolué en tant que pathogènes. Les souches de l’espèce E. albertii ont été isolées récemment et ont un grand potentiel de virulence autant chez les humains que chez les oiseaux. Ces souches sont souvent confondues avec d’autres organismes pathogènes comme E. coli dans les tests biochimiques, et le manque de connaissances sur E. albertii rend son identification difficile. Dans la deuxième partie de ce projet, nous avons identifié des gènes spécifiques aux souches d’E. albertii ainsi que des gènes de virulence présents chez E. albertii par comparaisons génomiques, ce qui a permis de développer et optimiser un test PCR (réaction en chaîne par polymérase) visant l’identification génomique rapide et fiable d’E. albertii.

Par micromanipulation et mesure de force sur molécule unique, avec un piège magnétique, ce travail a porté en partie sur l'étude du système de réparation « à longue distance » de l'ADN. Cette réparation fait intervenir pour son initiation les protéines MutS, MutL, et MutH et utilise un mécanisme non identifié précisément, qui lui permet<br />d'agir à distance, entre un site de mésappariement de l'ADN (dû par exemple à une erreur de réplication), et un site proximal distant (hémi-méthylation de séquence GATC), ce qui permet de diriger la réparation sur le brin néosynthétisé. Certains modèles de l'action de la protéine MutS font intervenir une boucle dans l'ADN. Nous<br />avons cherché à mettre en évidence une telle action sur un ADN double brin, contenant (ou ne contenant pas) un mésappariement. Nous n'avons pas mis en évidence de<br />formation de boucle par MutS, qui soit spécifiquement liée à la présence d'un mésappariement. Ce résultat négatif semble donc exclure ce modèle de boucle spécifique. Dans une deuxième partie, nous avons effectué des expériences de micromanipulation sur une jonction de Holliday (ADN en forme de croix, intermédiaire de recombinaison). Nous avons montré directement qu'il est possible d'extruder une jonction de Holliday, en sous-enroulant mécaniquement une molécule d'ADN comportant une séquence palindromique, et avons aussi déduit de ces expériences une mesure du pas de l'hélice de l'ADN. Dans une dernière partie, nous avons étudié l'influence du bromure d'éthidium sur l'ADN. Nous avons montré que la présence de cet agent intercalant peut induire une attraction non-spécifique, intra- ou inter- simple brins d'ADN.

Background: Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) represent the most worrying Gram-negative and Gram-positive nosocomial pathogens of the present age. They are of increasing concern in the clinical environment due to their multi-drug resistance and the dwindling therapeutic options available. A. baumannii is the most frequently isolated clinical species of the genus, and is able to rapidly acquire resistance. Hypermutators, most frequently deficient in mismatch repair (MMR) via defects in the mutS gene, have been associated with antimicrobial resistance in several bacterial populations. To date, however, the potential role of MMR-deficient mutators in the development of resistance in clinical Acinetobacter spp. has not been investigated. Biocides, most notably chlorhexidine (CHX), are increasingly used in the hospital environment to prevent bacterial spread. This has led to concerns about the development of reduced biocide susceptibility and associated antibiotic resistance in hospital bacterial populations, where there is frequent exposure to both of these factors. The effect of CHX upon defined clinical MRSA isolates is examined here. Methods: The mutS gene of clinical Acinetobacter spp. isolates with varying sensitivities was sequenced and compared to establish whether any variations were present. Mutation studies were performed on isolates by challenging them with ciprofloxacin to determine whether different mutS types correlated with any variation in their ability to develop significant fluoroquinolone resistance. The response of clinical MRSA isolates to a range of CHX concentrations was examined with susceptibility testing methods, and effects were compared with standard strains. Determination of post-exposure minimum inhibitory concentrations (MICs) of a range of antibiotics enabled evaluation of whether exposure to CHX had an effect on susceptibility to antibiotics. Results: Variation was observed in the mutS gene of clinical Acinetobacter spp. isolates, with greater homology observed as resistance increased. A highly conserved and previously unreported amino acid sequence was discovered in resistant isolates. Nonresistant isolates with this ‘R-type’ mutS sequence appeared to have a greater ability to develop significant ciprofloxacin resistance. Clinical MRSA isolates had varying susceptibility to CHX, and there were differences in the susceptibility of standard strains compared to clinical isolates. CHX residues exerted a prolonged minimal inhibitory effect, and several increases in antibiotic MICs following CHX exposure were observed. Conclusions: The correlation of the mutS sequence with mutation ability suggests that defects in the mutS gene may have a role to play in the ability of certain Acinetobacter spp. to rapidly acquire resistance. This could have implications for the treatment of Acinetobacter spp. infections, and may enable quick determination of which clinical isolates have the potential to develop clinically significant resistance. Incomplete eradication due to the prolonged minimal effect of CHX residues may act as a selective pressure in the hospital environment, allowing survival of reduced susceptibility MRSA isolates. Increases in antibiotic MICs following CHX exposure is of grave concern for the future of biocide usage.

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité de l'agent anticancéreux cisplatine en activant une voie apoptotique. La déficience de ce système de réparation est reliée in vivo à une chimiorésistance des cellules cancéreuses au cisplatine. Afin de définir le lien entre la cytotoxicité du cisplatine et le fonctionnement du système MMR, nous avons étudié l'interaction de la protéine MutS du système MMR bactérien avec un composé de lésion du cisplatine (formé lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux guanines platinées appartenant à l'adduit intrabrin d(GpG)). Mon travail a porté essentiellement sur i) une étude des propriétés biochimiques ATP-dépendantes de MutS en présence d'un composé de lésion du cisplatineii) une étude d'interaction entre plusieurs composés de lésion du cisplatine et la protéine HMGB1 qui est bien connue comme pouvant inhiber l'accessibilité des lésions majoritaires du cisplatine à des protéines de réparation. Notre étude a été réalisée par des techniques de biologie moléculaire, de biochimie et de spectroscopie (résonance plasmonique de surface). Nous montrons qu'un composé de lésion du cisplatine module les propriétés ATP-dépendantes de MutS, un résultat inattendu étant qu'il inhibe le relargage de MutS de l'ADN. Un composé de lésion pourrait donc jouer un rôle dans la signalisation MMR-dépendante en modulant les stades précoces de l'initiation de la réparation ce qui est en accord avec le modèle dit « de signalisation directe MMRdépendante».

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité du cisplatine, puissante drogue anticancéreuse qui interagit avec l'ADN. Nous avons étudié in vitro certaines étapes clé des mécanismes moléculaires qui relient le fonctionnement du système de réparation MMR avec la cytotoxicité de cette drogue. Notre étude s'est focalisée sur l'interaction entre l'ADN platiné et la protéine MutS du système MMR impliquée dans les étapes d'initiation de la réparation. Trois points ont été abordés dans cette étude : i) la reconnaissance par MutS des lésions du cisplatin et des composés de lésion du cisplatine (formés lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux purines pontées par le platine) ii) l'étape d'initiation de la réparation régulée par la fixation d'ATP et d'ADP par la protéine MutS iii) l'étude d'un dérivé du cisplatine (DACH-platine) ne présentant pas de résistance croisée avec le cisplatine. Les principaux résultats ont été obtenus par des techniques électrophorétiques et par résonance plasmonique de surface. Notre étude montre que MutS joue le rôle d'un senseur des lésions du cisplatine et que l'ADN platiné peut jouer le rôle d'un cofacteur dans la régulation biochimique de l'activité de MutS en présence de nucléotides régulateurs. Nos résultats suggèrent que les composés de lésion des adduits majoritaires du cisplatine pourraient être les lésions critiques impliquées dans la cytotoxicité du cisplatine via le système MMR.

Dissertation (Ph.D.)--University of Toledo, 2009. / "In partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences." Title from title page of PDF document. Bibliography: p. 174-180, p. 201-238.