Submitted by TAMIRIS KEMPNER (tamireskempner@yahoo.com.br) on 2018-08-08T19:23:03Z No. of bitstreams: 1 Tese - Tamiris Kempner.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-08-08T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kempner_t_dr_jabo.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kempner_t_dr_jabo.pdf: 3257644 bytes, checksum: b017074bfe0af2c7904609b1f22127e9 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diante da importância do cancro cítrico para a citricultura mundial, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, o agente causal da doença, tem sido amplamente estudada. Pesquisadores brasileiros realizaram o sequenciamento completo do genoma da X. citri subsp. citri isolado 306 (Xac306), com o intuito de elucidar os genes e mecanismos envolvidos na patogenicidade e/ou virulência da bactéria. As ORFs XAC2361 e XAC3898 possuem tamanhos e locais diferentes no genoma da Xac306, mas têm em comum o domínio Peptidase_M23, cujo processo biológico predito é de hidrolase de parede celular, mas a real função destas proteínas em Xac ainda é desconhecida. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio da mutação sítio-dirigida, se as ORFs XAC2361 e XAC3898 estão relacionadas com a virulência e/ou patogenicidade de X. citri subsp. citri 306 e com o desenvolvimento do cancro cítrico. Para isso, foram realizados testes in vitro e in planta dos mutantes obtidos, visando observar alterações fenotípicas. Devido a presença de peptídeo sinal, a ORF XAC2361 foi fundida à proteína fluorescente mCherry (XAC2361-mCherry) para expressão in vivo e avaliação por microscopia de fluorescência. As análises fenotípicas demonstraram que o mutante ΔXAC2361 não apresentou alterações nos sintomas quando avaliado em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), porém apresentou menor capacidade de crescimento in vitro, menor motilidade swimming e swarming e menor capacidade de sobrevivência em SDS. Por outro lado, o mutante ΔXAC3898 apresentou uma significativa redução na virulência, menor capacidade de crescimento in planta, maior capacidade de crescimento in vitro, menor capacidade de agregação, maior produção de goma e biofilme e a avaliação por microscopia eletrônica de varredura mostrou que houve uma redução no comprimento das células da bactéria. A análise por microscopia de florescência da proteína de fusão XAC2361-mCherry mostrou, predominantemente, uma fluorescência dispersa, o que é um indício de que a mesma pode estar sendo direcionada para o citoplasma. Apesar disso, não foi possível confirmar a expressão da proteína de fusão XAC2361-mCherry por meio de Western-blot. Diante dos resultados obtidos, sugere-se que o domínio Peptidase_M23 está de alguma forma envolvido com a virulência e/ou patogenicidade de Xac, atuando na formação da parede celular. / In view of the importance of citrus canker in citrus culture worlwide, the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, the causal agent of this disease, has been extensively studied. Brazilian researchers performed the complete sequencing of the genome of X. citri subsp. citri isolate 306 (Xac306), in order to elucidate the genes and mechanisms involved in the pathogenicity and/or virulence of Xac. The ORFs XAC2361 and XAC3898 have different sizes and location in the genome, but have in common the M23 Peptidase domain, whose biological process is predicted to act as cell wall hydrolase, but the actual function of these proteins in Xac is still unknown. This work aimed to evaluate, through site-directed mutagenesis, whether XAC2361 and XAC3898 ORFs are related to the virulence and / or pathogenicity of Xac306 and the development of citrus canker. In order to observe phenotypic changes, in vitro and in planta tests of the mutants were carried out. Due to the presence of signal peptide, the ORF XAC2361 was fused to the mCherry fluorescent protein (XAC2361-mCherry) for in vivo expression and fluorescence microscopy evaluation. Phenotypic analyzes demonstrated that the ΔXAC2361 mutant showed no change in symptoms when evaluated in Mexican lime (Citrus limonia Osbeck), but presented lower in vitro growth capacity, lower swimming and swarming motility, and lower survival capacity in SDS. On the other hand, the ΔXAC3898 mutant showed a significant reduction in virulence, lower in plant growth capacity, higher in vitro growth capacity, lower aggregation capacity, higher gum production and biofilm, and scanning electron microscopy evaluation showed that there was a reduction in cell length. Microscopy analysis of the XAC2361-mCherry fusion protein showed predominantly dispersed fluorescence, which is an indication that it may be being directed to the cytoplasm. Despite this, the expression of XAC2361-mCherry fusion protein could not be confirmed by Western blotting. In view of the obtained results, it is suggested that the Peptidase_M23 domain is in some way involved with the virulence and/or pathogenicity of Xac, acting in the formation of the cellular wall.

As fosfolipases A2 (PLA2s, ou fosfatidil-acil hidrolases EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídio. São encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais vertebrados e invertebrados e estão envolvidas em uma ampla variedade de processos fisiológicos. A fosfolipase A2 secretada humana do grupo IIA (hsPLA2 gIIA) é uma proteína de fase aguda da resposta imunológica, pois sua expressão é induzida por endotoxinas e citocinas via processos autócrinos e/ou parácrinos durante processos inflamatórios de relevância clínica. A hsPLA2 gIIA mostra efeito bactericida contra infecção por Staphylococcus aureus, e tem marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol (PG) encontrados em membranas bacterianas. Uma grande variedade de inibidores de PLA2 do grupo IIA foi descrita na literatura, incluindo substâncias polianiônicas que atuam contra os efeitos inflamatórios destas enzimas. Suramina é um derivado de naftiluréia polissulfonado que recentemente mostrou ligação com os resíduos catiônicos no sítio de reconhecimento interfacial de Bothropstoxina-I (BthTX-I), uma PLA2-Lys49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, inibindo a atividade miotóxica da proteína. Devido ao tipo de interação diferenciada da suramina com BthTX-I em relação aos inibidores competitivos de PLA2, nós avaliamos a especificidade de ligação da suramina na hsPLA2 gIIA como um modelo para estudar este novo tipo de inibidor de PLA2s. O efeito da suramina nas atividades biológicas e de membranas artificiais da hsPLA2 gIIA foi avaliado. A suramina aboliu tanto a atividade hidrolítica da hsPLA2 gIIA quanto a atividade de danificação de membranas artificiais Ca2+ independente. Embora a suramina não tenha inibido a atividade bactericida da hsPLA2 gIIA contra a linhagem Micrococcus luteus, a ativação de macrófagos foi abolida pela mesma de maneira dependente de hidrólise. Além disso, técnicas de simulação de dinâmica molecular, calorimetria de titulação isotérmica e mutagênese sítio dirigida foram utilizadas para mapear os sítios de ligação da suramina na proteína. A interação da suramina com a hsPLA2 gIIA resultou de interações eletrostáticas entre grupos sulfonados com cadeias laterais de aminoácidos da região do sítio ativo e dos resíduos em torno das posições 15 e 116 localizados, respectivamente, na N- e Cterminal. Portanto, estes resultados permitem sugerir que a suramina pode atuar como inibidor de sPLA2s / Suramin is a polysulphonated napthylurea used as an antiprotozoal drug that presents inhibitory activity against a broad range of enzymes. We have evaluated the effect of suramin against the artificial and biological activities of the secreted human group IIA phospholipase A2 (hsPLA2 gIIA), a protein involved in inflammatory processes. To map the suramin binding sites on the hsPLA2 gIIA, proteins with mutations in the active site region and in the protein surface that makes contact with the phospholipids membrane were expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The activation of macrophage cell line RAW 264.7 by hsPLA2 gIIA was monitored by nitric oxide release, and bactericidal activity of the protein against Micrococcus luteus was evaluated by colony counting and by flow cytometry. The hydrolytic activity of the hsPLA2 gIIA against lipossomes composed of a mixture of dioleoylphosphatidylcholine/dioleoylphosphatidylglycerol (DOPC/DOPG) was inhibited by a concentration of 100 nM suramin. The activation of macrophages by hsPLA2 gIIA was abolished at protein/suramin molar ratios where the hydrolytic activity of the enzyme was inhibited. In contrast, both the bactericidal activity of hsPLA2 gIIA against Micrococcus luteus and permeabilization of the bacterial inner membrane were unaffected by suramin concentrations up to 50 M. The affinity of interaction of the suramin with hsPLA2 gIIA was evaluated by suramine fluorescence and the mutants K15A, K38A, R54A and K123A presented a reduced affinity. The binding of the suramin/hsPLA2 gIIA complex was investigated by molecular dynamics simulations, which indicated two conformations of the bound inhibitor, which involve cationic amino-acid side chains in the active-site region and residues around positions 15 and 116 located in the N- and C-termini respectively in the substrate recognition surface. These results were correlated with isothermal titration calorimetry data, which demonstrated 2.7 suramin-binding sites on the hsPLA2 gIIA. These results suggested that suramin represents a novel class of phospholipase A2 inhibitor

Coenzima Q (CoQ) é uma molécula de função essencial na transferência de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial. Em Saccharomyces cerevisiae , a CoQ é constituída por um anel de benzeno associado a uma cadeia poliprenil, com 6 unidades de repetição, sendo por isso também denominada CoQ6 ou Q6. Ao todo já foram identificados treze genes (COQ1 COQ11, ARH1 e YAH1) nucleares necessários para biossíntese da CoQ. A maioria dos produtos Coq estão fisicamente associados em um complexo biossintético ancorado na membrana mitocondrial interna. Neste projeto, tentamos descrever resíduos relevantes de Coq3p e Coq7p aliando análises de bioinformática com testes fenotípicos para balizamento funcional. Coq7p é uma proteína com dois centros de ferro com íons carboxilato e catalisa a hidroxilação de demetoxi-Q6 (DMQ6). Neste estudo, indicamos um grupo de resíduos que modulam a atividade e a estabilidade de Coq7p: D53, R57, V111 e S114. Enquanto R57, V111 e S114 são resíduos muito conservados, V111 e S114 estão correlacionados em comunidades de coevolução. Aqui, demonstramos também que o duplo mutante S114A, V111G e o mutante S114E apresentam deficiência respiratória em temperatura não permissiva, além de acumularem o intermediário DMQ6 e sintetizarem baixas quantidades de Q6, concluindo assim que o fosmimético S114E inibe a atividade Coq7p. Dessa forma, propomos que a fosforilação do resíduo S114 promove o deslocamento de uma alça entre as hélices 2 e 3, afetando assim a atividade do centro catalítico Coq7p. Por sua vez, Coq3p atua como uma metiltransferase, catalisando diferentes passos durante a biossíntese da CoQ. Aqui, identificamos resíduos que colaboram para a atividade funcional de Coq3p: E123, S125, C131, G133, G134, H165, D203, E219, K258 e S262. Mutantes carregando as alterações E123A, H165A, D203A, E219A, K258A e S62A apresentam discreto crescimento respiratório e expressão de Coq3p similares à da linhagem selvagem, além de acumularem baixas quantidades de Q6. Enquanto C131, G133 e G134 são resíduos altamente conservados, localizados em uma alça no espaço entre fitas beta, no provável sítio ativo da proteína, mutantes C131A, G133A e G134A se superexpressos apresentam crescimento respiratório em meio contendo fonte de carbono não fermentável, além de acumularem Q6 compatíveis com os níveis de expressão proteica. Propomos assim um modelo para Coq3p, tendo os resíduos C131, G133 e G134 como centro catalítico de Coq3p. / Coenzyme Q (CoQ) is a molecule of essential function in the transfer of electrons of the mitochondrial respiratory chain. In saccharomyces cerevisiae , CoQ is constituted by a benzene ring associated with a polyprenyl chain with 6 repetition units, being therefore also denominated CoQ6 or Q6. Thirteen nuclear genes have already been identified (COQ1 COQ11, ARH1 and YAH1) required for coenzyme Q biosynthesis. Most of Coq products are physically associated in a biosynthetic complex anchored at the mitochondrial internal membrane. In this project, we identified Coq3p and Coq7p residues relevant for their respective role in CoQ synthesis combining bioinformatics analyzes with phenotypic tests for functional mapping. Coq7p is a carboxylate-bridged di-iron protein that catalyzes the hydroxylation of demetoxy-Q6 (DMQ6), the last monooxygenase step in the synthesis of CoQ. In this study, we found a group of residues that modulate the activity and stability of Coq7p: D53, R57, V111 and S114. While R57, V111 and S114 are highly conserved residues, V111 and S114 are correlated in communities of coevolution. We also demonstrate that the double mutant S114A, V111G and the mutant S114E have respiratory deficiency at non-permissive temperature, in addition to accumulating of the intermediate DMQ6 and low amounts of Q6, thus concluding that phosmimetic S114E inhibits the activity of Coq7p. Hence, we propose that the phosphorylation of S114 is required to move a loop between helices 2 and 3, thus affecting the activity of the catalytic center Coq7p. For its part, Coq3p acts as a methyltransferase, catalyzing different steps during biosynthesis of CoQ. Here we identified residues that collaborate for functional activity of Coq3p: E123, S125, C131, G133, G134, H165, D203, E219, K258 and S262. Mutants E123A, H165A, D203A, E219A, K258A and S62A, have mild respiratory growth, and expression of Coq3p levels similar to the wild strain, in addition to accumulating low amounts of Q6. While C131, G133, and G134 are residues highly conserved, located in a loop in the space between beta sheets, the overexpression of the mutants C131A, G133A and G134A present respiratory growth in medium containing non-fermentable carbon source, in addition to accumulate Q6 compatible with the levels of protein expression. We propose a model for Coq3p, with residues C131, G133 and G134 as part of Coq3p catalytic center.

As fosfolipases A2 (PLA2s, ou fosfatidil-acil hidrolases EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídio. São encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais vertebrados e invertebrados e estão envolvidas em uma ampla variedade de processos fisiológicos. A fosfolipase A2 secretada humana do grupo IIA (hsPLA2 gIIA) é uma proteína de fase aguda da resposta imunológica, pois sua expressão é induzida por endotoxinas e citocinas via processos autócrinos e/ou parácrinos durante processos inflamatórios de relevância clínica. A hsPLA2 gIIA mostra efeito bactericida contra infecção por Staphylococcus aureus, e tem marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol (PG) encontrados em membranas bacterianas. Uma grande variedade de inibidores de PLA2 do grupo IIA foi descrita na literatura, incluindo substâncias polianiônicas que atuam contra os efeitos inflamatórios destas enzimas. Suramina é um derivado de naftiluréia polissulfonado que recentemente mostrou ligação com os resíduos catiônicos no sítio de reconhecimento interfacial de Bothropstoxina-I (BthTX-I), uma PLA2-Lys49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, inibindo a atividade miotóxica da proteína. Devido ao tipo de interação diferenciada da suramina com BthTX-I em relação aos inibidores competitivos de PLA2, nós avaliamos a especificidade de ligação da suramina na hsPLA2 gIIA como um modelo para estudar este novo tipo de inibidor de PLA2s. O efeito da suramina nas atividades biológicas e de membranas artificiais da hsPLA2 gIIA foi avaliado. A suramina aboliu tanto a atividade hidrolítica da hsPLA2 gIIA quanto a atividade de danificação de membranas artificiais Ca2+ independente. Embora a suramina não tenha inibido a atividade bactericida da hsPLA2 gIIA contra a linhagem Micrococcus luteus, a ativação de macrófagos foi abolida pela mesma de maneira dependente de hidrólise. Além disso, técnicas de simulação de dinâmica molecular, calorimetria de titulação isotérmica e mutagênese sítio dirigida foram utilizadas para mapear os sítios de ligação da suramina na proteína. A interação da suramina com a hsPLA2 gIIA resultou de interações eletrostáticas entre grupos sulfonados com cadeias laterais de aminoácidos da região do sítio ativo e dos resíduos em torno das posições 15 e 116 localizados, respectivamente, na N- e Cterminal. Portanto, estes resultados permitem sugerir que a suramina pode atuar como inibidor de sPLA2s / Suramin is a polysulphonated napthylurea used as an antiprotozoal drug that presents inhibitory activity against a broad range of enzymes. We have evaluated the effect of suramin against the artificial and biological activities of the secreted human group IIA phospholipase A2 (hsPLA2 gIIA), a protein involved in inflammatory processes. To map the suramin binding sites on the hsPLA2 gIIA, proteins with mutations in the active site region and in the protein surface that makes contact with the phospholipids membrane were expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The activation of macrophage cell line RAW 264.7 by hsPLA2 gIIA was monitored by nitric oxide release, and bactericidal activity of the protein against Micrococcus luteus was evaluated by colony counting and by flow cytometry. The hydrolytic activity of the hsPLA2 gIIA against lipossomes composed of a mixture of dioleoylphosphatidylcholine/dioleoylphosphatidylglycerol (DOPC/DOPG) was inhibited by a concentration of 100 nM suramin. The activation of macrophages by hsPLA2 gIIA was abolished at protein/suramin molar ratios where the hydrolytic activity of the enzyme was inhibited. In contrast, both the bactericidal activity of hsPLA2 gIIA against Micrococcus luteus and permeabilization of the bacterial inner membrane were unaffected by suramin concentrations up to 50 M. The affinity of interaction of the suramin with hsPLA2 gIIA was evaluated by suramine fluorescence and the mutants K15A, K38A, R54A and K123A presented a reduced affinity. The binding of the suramin/hsPLA2 gIIA complex was investigated by molecular dynamics simulations, which indicated two conformations of the bound inhibitor, which involve cationic amino-acid side chains in the active-site region and residues around positions 15 and 116 located in the N- and C-termini respectively in the substrate recognition surface. These results were correlated with isothermal titration calorimetry data, which demonstrated 2.7 suramin-binding sites on the hsPLA2 gIIA. These results suggested that suramin represents a novel class of phospholipase A2 inhibitor

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_simone_simionatto.pdf: 333806 bytes, checksum: 6d2a7ca25216004656318115c514c721 (MD5) Previous issue date: 2008-10-10 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia (EP), a respiratory disease responsible for significant economic losses. Commercial vaccines are widely used in the control of this disease, however, they provide only partial protection. Besides, their preparation is expensive because of fastidiously growth of M. hyopneumoniae in vitro. Therefore, the development of alternatives for EP prophylaxis is important for improving health conditions of pigs. Recombinant DNA technology can be used to overcome problems with conventional vaccines. Nevertheless, because of the use of TGA and not TGG to code for tryptophan, translation of mycoplasmal genes terminates prematurely when cloned in other bacteria, such as Escherichia coli. Because of this, the number of antigenic proteins characterized to date in vaccine formulations or immunodiagnostic tests is still restricted. In this work, 63 genetic fragments were selected, which correspond to 48 sequences coding (CDS) of M. hyopneumoniae. First, an overlap extension-PCR method for site-directed mutagenesis of M. hyopneumoniae genes was standardized, aiming at substituting TGA codon by TGG. With this improved method, site-directed mutagenesis was successfully achieved in 14 M. hyopneumoniae genes. Other selected genes were amplified by PCR and cloned into Champion pET200D/TOPO®. A total of 59 genetic fragments were efficiently cloned. From these, 49 had their proteins expressed in E. coli and 35 were purified by affinity chromatography using Ni- Sepharose columns (HisTrap ). Immunogenic and antigenic properties of these proteins were analyzed. For this, the proteins were tested against sera from hyperimmune and from convalescent pigs through ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and Western blot. Nineteen recombinant proteins were specifically recognized by convalescent pig sera indicates they are expressed during infection. Immune humoral response against recombinant proteins was evaluated in BALB/c mice by ELISA. The results showed that antigens induce variable levels of antibodies, which allows inferring the immunogenicity of each antigen. Sera from inoculated mice with twenty recombinant proteins were able to recognize the native protein by ELISA. This study allowed identifying and characterizing new immunogenic proteins according to their potential for use in diagnostic tests and/or vaccine. These data represent an important contribution for the development of more efficient serological tests and a subunit vaccine for controlling M. hyopneumoniae infections in pigs. / Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença respiratória responsável por significativas perdas econômicas. Vacinas comerciais são mundialmente utilizadas no controle desta doença, porém proporcionam apenas proteção parcial. Além disso, são caras devido ao crescimento fastidioso do M. hyopneumoniae in vitro. Desta forma, o desenvolvimento de alternativas para a profilaxia da PES é fundamental para a melhoria da sanidade dos suínos. A tecnologia do DNA recombinante pode ser usada para superar problemas com as vacinas convencionais. No entanto, pela utilização de códons TGA e não TGG para codificar o amino ácido triptofano, a tradução de genes de micoplasmas termina prematuramente quando clonados e expressos em outras bactérias, como Escherichia coli. Devido a isso, o número de proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae caracterizadas e testadas como vacinas ou em testes de imunodiagnóstico ainda é restrito. Neste trabalho, 63 fragmentos gênicos foram selecionados, os quais correspondem a 48 seqüências codificadoras (CDS) de M. hyopneumoniae. Num primeiro momento, foi padronizado um método de PCR de sobreposição para mutagênese sítio-dirigida de genes de M. hyopneumoniae, objetivando a substituição do códon TGA por TGG, na seqüência do DNA. Com esse método, a mutagênese sítio-dirigida foi realizada com sucesso em 14 genes de M. hyopneumoniae. Os demais genes selecionados foram amplificados por PCR e clonados no vetor Champion pET200D/TOPO®. No total, 59 fragmentos gênicos foram clonados eficientemente. Destes, 49 tiveram suas proteínas expressas em E. coli e 35 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Ni- Sepharose (HisTrap ). As propriedades antigênicas e imunogênicas destas proteínas foram analisadas. Para isso, as proteínas foram testadas contra soro de suínos convalescentes e soro hiperimune através de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e Western blot. Dezenove proteínas recombinantes foram reconhecidas especificamente por soro de suínos convalescentes, indicando que elas são expressas durante a infecção. Resposta imune humoral contra as proteínas recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c através de ELISA. Os resultados demonstraram que os antígenos induzem um nível variável de anticorpos, o que nos permite inferir quanto à capacidade imunogênica de cada antígeno. O soro dos camundongos inoculados com 20 proteínas foi capaz de reconhecer as proteínas nativas através de ELISA. Este estudo permitiu identificar e caracterizar novas proteínas imunogênicas de acordo com o seu potencial para uso em testes de diagnóstico e/ou vacina. Estes dados representam uma importante contribuição para o desenvolvimento de testes sorológicos mais efecientes e vacinas de subunidade para o controle da infecção causada por M. hyopneumoniae em suínos.

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The α-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri α-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the α-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic α-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced α-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of α-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The α-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri α-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the α-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic α-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced α-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of α-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.