Avec les constantes avancées du séquençage de nouvelle génération (NGS), la quantité de données disponibles devient massive. En parallèle, les méthodes de détection au cancer demeurent très spécifiques et peu efficaces. De plus, le taux de survie des patients est directement relié à la progression tumorale et par conséquent, aux méthodes de détection. Malgré des avancées technologiques très importantes dans les dernières années, le taux de mortalité du cancer ne cesse d’augmenter. L’importance de développer des nouvelles méthodes de détection applicables à tous les types de cancer devient une nécessité. Jusqu’à présent, il n’existe aucun modèle permettant d’utiliser le séquençage de nouvelle génération qui permet la prédiction de caractéristiques cancéreuse (ex : récurrence, résistance, etc.). Les sections suivantes démontrent la création d’un modèle utilisant des mutations somatiques et germinales pour prédire la récurrence et son applicabilité au travers de tous les types de cancers (et même différentes maladies). En utilisant des signatures géniques (combinaisons de gènes) spécifiques à chaque cancer, nous avons été en mesure d’obtenir une précision de 90% (et plus) pour le groupe où le cancer est récurrent. De nos connaissances, ceci est la première tentative de développement de modèle permettant de prédire le pronostic du patient en utilisant le NGS. Ceci amène un nouvel aspect pour la médecine personnalisée et spécialement pour le dépistage du cancer. / With the constant progress in neext generation sequencing, the quantity of data available for investigation becomes massive. In parallel, cancer detection methods and treatments remain very specific and barely accurate. Moreover, the patients survival rate are directly linked with tumoral progression and therefore, to cancer detection methods. Despite continual technological advances in recent years, the global cancer mortality rate keeps rising. The creation of new detection methods accessible to all cancer types becomes a necessity. As of now, there is no model available that using sequencing data to predict cancer traits (ex: recurrence, resistance, etc.). The following sections demonstrate the creation of such model using somatic and germline mutations to predict recurrence and its applicability across all cancer types (and even across different diseases). By using gene signatures specific to each cancer types, we were able to obtain an accuracy of 90% (and more) for the cohort where the cancer was recurrent. To our knowledge, this is the first attempt to develop a model that can predict the patient’s prognosis using genome sequencing data. This will affect future studies and improve personalized medicine as well as cancer detection methods.

Les canaux sodiques dépendants du voltage (Nav) sont des protéines transmembranaires largement exprimées au sein de l’organisme. Ils sont responsables de l’initiation des potentiels d’action au niveau des cellules excitables et régissent ainsi de nombreuses fonctions physiologiques telles que les fonctions cognitives et sensorielles, les fonctions motrices et la fonction cardiaque. Au niveau du coeur, le sous-type Nav1.5 est majoritairement exprimé à la surface des cardiomyocytes. Leurs dysfonctions sont traditionnellement associées à de nombreux troubles électriques cardiaques. Des mutations de ces canaux ont récemment été reliées au développement d’un phénotype clinique complexe associant diverses arythmies et la cardiomyopathie dilatée (DCM), une atteinte morphologique. L’objectif de mon doctorat a donc été l’identification mais aussi la caractérisation d’un potentiel défaut biophysique commun à l’ensemble des mutations Nav1.5 associées au développement de ce phénotype clinique atypique. Premièrement, nous nous sommes intéressés à deux mutations des canaux Nav1.5 retrouvées chez des patients atteints de DCM, et dont les altérations biophysiques ont été décrites comme divergentes. L'étude parallèle de ces deux mutants nous a amenés à identifier une caractéristique commune : la création d’une nouvelle voie de perméation alternative au sein des canaux Nav1.5, le pore oméga. Dans un second temps, nous avons souhaité consolider l’association entre la création du pore oméga et le développement pathologique. Cette seconde étude portant sur deux autres mutants Nav1.5 a permis de confirmer l’apparition d’un pore oméga et ainsi d’accroître la suspicion du caractère délétère de ce pore oméga. Finalement, à l’aide d’une cinquième mutation des canaux Nav1.5, nous avons investigué les conséquences physiopathologiques de la création d’un pore oméga. Cette étude, a clairement démontré les conséquences néfastes d'un tel pore au niveau de l’homéostasie ionique cellulaire. Ces perturbations se répercutent par la suite sur les signaux électriques, les propriétés morphologiques mais aussi fonctionnelles des cardiomyocytes. Les études menées lors de mon doctorat ont ainsi abouti à l'identification du pore oméga comme étant une caractéristique biophysique commune aux mutations des canaux Nav1.5 associées au développement des arythmies et de la dilatation cardiaque. / Voltage gated sodium channels (Nav) are broadly expressed in the human body. They are responsible for the initiation of action potentials (AP) in excitable cells. They underlie several physiological processes such as the cognitive, the sensitive, the motor and the cardiac functions. Nav1.5 channel is the main Nav expressed in the heart. Their dysfunctions are usually associated to the development of pure electrical disorders. However, mutations of Nav1.5 have recently been linked to the development of an atypical clinical phenotype combining complex arrhythmias and dilated cardiomyopathy (DCM). The main objective of my thesis has been to identify and characterize a common biophysical defect for all Nav1.5 mutations located in the channel’s voltage sensitive domains (VSDs) and associated with the atypical clinical phenotype. We were first interested in the case of two families of patients who displayed the same clinical phenotype although they carried two different Nav1.5 mutations, which have been reported to induce divergent biophysical defects. We identified a new alternative permeation pathway (called omega pore or gating pore) in the VSD of mutant Nav1.5 channels. This omega pore might constitute a common biophysical defect for all Nav1.5 mutations located in the channel’s VSDs. The second axe consisted in strengthening the association between mutations in the VSD of Nav1.5 and the creation of a gating pore. This research, based on the study of two other Nav1.5 mutations, confirmed the creation of an omega pore and increased the suspicion of the cardiovascular pathogenic potential of such an alternative permeation pathway. Finally, we studied a fifth Nav1.5 mutation. We used this mutation to characterize the pathological consequences of the creation of an omega pore. This study revealed that the creation of an omega pore disrupts the ionic homeostasis of cardiomyocytes. This homeostatic imbalance then affects electrical signals, cell morphology and also the function of cardiac myocytes. The studies of my thesis permitted to identify the omega pore as a potential common biophysical defect of Nav1.5 mutations located in the channel’s VSDs and associated to the arrhythmias and DCM. Furthermore, we also identified the pathological mechanism linking these mutations and the observed atypical clinical phenotype.

Les canaux sodiques sont des protéines membranaires d'une importance primordiale. Ils sont impliqués dans le déclenchement des potentiels d'action et sont nécessaires à l'excitabilité des cellules. Ils participent à la contraction des muscles striés squelettiques, cardiaques et lisses. Des dysfonctionnements de ces canaux, dûs à des mutations, peuvent engendrer de graves pathologies et atteintes cardiaques telles que le syndrome du QT long, le syndrome de Brugada, ou la cardiomyopathie dilatée. L'étude de ces mutations constitue un enjeu essentiel dans la compréhension des mécanismes de ces canaux et du développement des pathologies associées. Plus les connaissances avancent et plus il devient alors possible d'envisager des études précises sur le développement des traitements appropriés. Cette étude se concentre sur l'analyse de deux nouvelles mutations du gène SCN5A codant pour le canal Nav1.5, et a permis de mettre en évidence les caractéristiques biophysiques dysfonctionnelles de ces mutants et de confirmer le diagnostic médical. / Sodium channels are important transmembrane proteins. They are involved in the upstroke of action potential and they are necessary for the cardiac cell excitability. Their dysfunctions caused by mutations can lead to serious pathologies and cardiac impairments such as long QT syndrome, Brugada syndrome, dilated cardiomyopathy and even sudden death. The study of these mutations is a key step toward the comprehension of the pathophysiological mechanisms involved. The knowledge progress allows to lead accurate studies on drug development. This study focused on the analysis of two novel SCN5A mutations and allowed to highlight the dysfunctional biophysic characteristics of these mutants and to confirm the medical diagnosis.

La duplication de gènes est l’un des plus importants mécanismes évolutifs pour la génération de diversité fonctionelle. Lorsqu’un gène est dupliqué, la nouvelle copie partage toutes ses fonctions avec la copie ancestrale car elles encodent pour des protéines identiques. Donc, les deux protéines, appelées paralogues, auront le même réseau d’interactions physiques protéine-protéine. Cependant, dans le cas de la duplication des gènes qui codent des protéines qui interagissent avec elles-mêmes (homomères), la nouvelle protéine interagira aussi avec la copie ancestrale, ce qui introduit une nouvelle interaction (heteromère) (Kaltenegger and Ober, 2015; Pereira-Leal et al., 2007). Puisque ces interactions peuvent avoir des différents motifs de rétention et de fonction (Ashenberg et al., 2011; Baker et al., 2013; Boncoeur et al., 2012; Bridgham et al., 2008), il est important de mieux comprendre comment ces états sont atteints et quelles forces évolutives les favorisent. Dans ce memoire, je cible ces questions avec des simulations in silico de l’évolution des protéines suite à la duplication de gènes en travaillant avec des structures crystallographiques de haute qualité, provenant de la Protein Data Bank (Berman et al., 2000; Dey et al., 2018). Les simulations montrent que les sous-unités et interfaces partagées entraînent une forte corrélation entre les trajectoires évolutives de ces complexes. Ainsi, les simulations prédisent que la préservation de seulement les deux homomères ou seulement l’hétéromère ne devrait pas être fréquente. Toutefois, la simulation qui applique la sélection seulement sur un homomère montre que l’homomère neutre est destabilisé plus rapidement que l’hétéromère neutre. Nous avons comparé ces prédictions avec des résultats expérimentaux du réseau d’interactions protéine-protéine de la levure. Comme suggéré par les simulations, les patrons d’interactions les plus fréquents ont été la formation des trois complexes (deux homomères et un hétéromère) ou la formation de seulement un homomère. Les patrons correspondants à deux homomères sans hétéromères ou un hétéromère sans homomères sont rares. Nos résultats démontrent l’extension de l’hétéromérisation entre paralogues dans le réseau d’interactions physiques protéine-protéine de la levure, les mécanismes sous-jacents et ses implications. / Gene duplication is one of the most important evolutionary mechanisms for the generation of functional diversity. When a gene is duplicated, the new copy shares all of the ancestral copy’s functions because they encode identical proteins. Therefore, the two proteins, called paralogs, will have the same protein-protein interaction network. However, in the case of the duplication of genes encoding proteins that self-interact (homomers), the new protein will also interact with the ancestral copy, introducing a novel interaction (heteromer) (Kaltenegger and Ober, 2015; Pereira-Leal et al., 2007). As these interactions can have different retention and functional patterns (Ashenberg et al., 2011; Baker et al., 2013; Boncoeur et al., 2012; Bridgham et al., 2008), it is important to understand better how these states are reached and what evolutionary forces favor each of them. In this thesis, I approach these questions by means of in silico simulations of protein evolution after gene duplication by working with high-quality crystal structures from the Protein Data Bank (Berman et al., 2000; Dey et al., 2018). The simulations show that the shared subunits and interfaces lead to these complexes having highly correlated evolutionary trajectories. Thus, the simulations predict that the preservation of only the two homomers or only the heteromer is not likely to happen often. Nevertheless, simulating evolution with selection on only one homomer shows that the neutral homomer is destabilized faster than the neutral heteromer. We compared these predictions against experimental results from the yeast protein-protein interaction network. As suggested by the simulations, the most abundant interaction patterns were either the formation of all three complexes (two homomers and one heteromer) or the formation of only one homomer, with motifs corresponding to two homomers without a heteromer or a heteromer without homomers being rare. Our results highlight the extent of heteromerization between paralogs in the yeast protein-protein interaction network, the underlying mechanisms, and its implications

Titre de l'écran-titre (visionné le 9 avril 2024) / Les myopathies liées à RYR1, les myopathies congénitales les plus fréquemment diagnostiquées, se caractérisent par une hypotonie musculaire squelettique et une faiblesse musculaire squelettique non progressive ou lentement progressive. Les myopathies liées à RYR1 sont causées par des mutations dans le gène RYR1. L'édition Prime a le potentiel d'atteindre une efficacité élevée dans le traitement des myopathies liées à RYR1 en ciblant les mécanismes physiopathologiques en amont. L'édition Prime utilise le même mécanisme que les systèmes CRISPR/Cas conventionnels, permettant toutes les conversions possibles de base à base et leurs combinaisons, mais n'exploite pas de modèle d'ADN double brin (dADN) ni ne confère de cassures double-brin (DSB) dans la séquence cible. La correction de la mutation T4709M est un exemple important pour le traitement potentiel des maladies liées à RYR1. Le maintien d'une homéostasie calcique adéquate pourrait réduire l'incidence de la faiblesse musculaire, améliorer la contraction musculaire et renforcer la fonction motrice globale. La correction des mutations du gène RYR1 en utilisant l'édition Prime offre également la possibilité de prévenir l'apparition de complications associées aux maladies liées à RYR1. La correction précoce de la mutation T4709M pourrait améliorer le pronostic à long terme des personnes atteintes en fonction de l'évolution observée de la faiblesse musculaire et de l'incapacité. Cette approche offre la possibilité d'établir des schémas thérapeutiques plus efficaces et individualisés afin d'optimiser les avantages thérapeutiques et de minimiser simultanément les effets indésirables. Ainsi, cette étude vise à explorer l'application de l'édition Prime pour le traitement des myopathies liées à RYR1. Les myopathies liées à RYR1 sont causées par des mutations dans le gène RYR1. L'efficacité de l'édition Prime dans la correction de T4709M, une mutation faux-sens de RYR1, a été évaluée à la fois in vitro et in vivo. Pour les expériences in vitro, les plasmides d'édition Prime ont été transfecté dans des cellules HEK293T, des cellules primaires de fibroblastes humains, une lignée de cellules de myoblastes humains, des cellules primaires de fibroblastes RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ de souris et des cellules C2C12 par électroporation. Pour les expériences in vivo, les plasmides d'édition Prime ont été injectés dans le modèle de souris RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ, suivi d'une électroporation. Plusieurs pegARN ont été testés. Les résultats des expériences in vitro montrent que l'efficacité de correction varie selon les pegARN. PE3 est l'un des dispositifs incrémentiels de l'édition Prime. PE3b est une version ajustée de PE3 avec une efficacité de correction améliorée et une gamme étendue de modifications génétiques ciblées. La stratégie PE3 s'est révélée plus efficace que la stratégie PE3b pour corriger la mutation ponctuelle. L'efficacité de correction de l'édition Prime peut être améliorée en effectuant plusieurs transfections ou en ajoutant une séquence ARN formant des doubles brins (appelée TevopreQ1) au pegARN. L'efficacité de correction de la mutation RYR1 T4706M par l'édition Prime in vivo ne peut être confirmée. / RYR1-related myopathies, the most frequently diagnosed congenital myopathies, are characterized by skeletal muscle hypotonia and non-progressive or slowly progressive skeletal muscle weakness. RYR1-related myopathies are caused by mutations in the RYR1 gene. Prime editing has the potential to achieve a high efficiency in the treatment of RYR1- related myopathies by targeting the upstream of the pathophysiological mechanisms. Prime editing employs the same mechanism as conventional CRISPR/Cas systems mediating all 12 possible base-to-base conversions and combinations but does not exploit a dDNA template or confer DSBs in the target sequence. Correction of the T4709M mutation is important example for the potential treatment of RYR1-related diseases. Maintenance of proper calcium homeostasis could ameliorate muscle weakness, improve muscle contractility, and enhance overall motor function. Correcting mutations of the RYR1 gene using Prime editing also offers the potential to prevent the occurrence of complications associated with RYR1-related diseases. Early correction of the T4709M mutation may improve the long-term prognosis for affected individuals based on observed progression of muscle weakness and disability. This approach offers the potential for establish more effective and individualized treatment regimens to optimize therapeutic benefits and to simultaneously minimize adverse effects. Thus, this study aims to explore the application of Prime editing for treating RYR1-related myopathies. RYR1-related myopathies are caused by mutations in the RYR1 gene. The efficiency of Prime editing in correcting T4709M, a missense mutation of RYR1, was evaluated both in vitro and in vivo. For in vitro experiments, the Prime editing plasmids were transfected into HEK293T cells, human fibroblast primary cells, human myoblast cell line, mouse RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ fibroblast primary cells, and C2C12 cells through electroporation. For in vivo experiments, the Prime editing plasmids were injected into RYR1ᵀᴹ/ᵀᴹ mouse model followed by electroporation. Multiple pegRNAs were tested. The results of in vitro experiments show that correction efficiency varies across pegRNAs. PE3 is one of the incremental devices in Prime editing. PE3b is an adjusted version of PE3 with improved editing efficiency and expanded range of targeted genetic modifications. The PE3 strategy was found to be a more effective than PE3b strategy for correcting the point mutation. The correction efficiency of Prime editing can be improved by conducting multiple transfections or by adding a RNA sequence forming double strands (called TevopreQ1) to pegRNA. The efficiency of correcting RYR1 T4706M mutation by Prime editing in vivo cannot be confirmed.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant. Biologie structurale : Strasbourg 1 : 2008. / Extrait en partie de périodique. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 275-292.

Les femmes non porteuses de mutations familiales des gènes BRCA1 ou BRCA2 présentent un risque de cancers du sein et de l'ovaire généralement comparable à celui des femmes de la population générale du même âge. Par conséquent, elles ne sont pas à risque élevé pour ces cancers et devraient suivre les recommandations de dépistage s'adressant aux femmes de la population générale. Toutefois, des études antérieures suggèrent que les pratiques de dépistage du cancer des non-porteuses « excèdent » ces recommandations. Ce projet a pour objectif de décrire les comportements de dépistage des femmes non porteuses indemnes et d'évaluer le rôle des antécédents familiaux sur leurs pratiques de dépistage du cancer. Des données sur les pratiques de dépistage des cancers du sein et de l'ovaire ont été recueillies rétrospectivement auprès de 220 non-porteuses indemnes, sur des périodes allant jusqu'à 10 ans (moyenne = 4,3) depuis la divulgation du résultat de leur test génétique. Les analyses ont porté sur le recours à la mammographie, à l'échographie des seins, à l'imagerie par résonance magnétique (IRM) des seins, à l'échographie transvaginale et/ou pelvienne et au dosage du CA-125. Les résultats indiquent que les pratiques de dépistage des non-porteuses sont dans l'ensemble cohérentes avec les recommandations à l'intention des femmes de la population générale. Lorsque des participantes ont adopté un comportement de dépistage différent de ce qui serait attendu pour des femmes considérées à risque populationnel de cancer, ces pratiques ont été associées dans la plupart des cas à la présence d'antécédents familiaux de cancer du sein ou de l'ovaire. Les connaissances acquises dans ce projet seront utiles pour l'élaboration d'outils visant à répondre aux besoins et aux préoccupations des non-porteuses afin de favoriser une utilisation optimale des mesures de dépistage du cancer conformément à leur profil génétique, leur histoire familiale et leurs préférences.

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) fait partie d’un regroupement de maladies héréditaires dont le tissu cible est la peau. Cette maladie dermatologique est causée par une mutation dans les gènes KRT5 ou KRT14, laquelle entraîne un problème au niveau de la formation des filaments intermédiaires de la kératine qui composent la peau. Un mésappariement au niveau des kératines 5 et 14 est responsable de l’apparition des symptômes de la maladie incluant la formation de cloques suite au trauma mécanique que subit la peau. Ces cloques entraînent d’importantes douleurs chez le patient, et de l’inflammation et de l’irritation. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible pour soulager les patients atteints de la maladie. Depuis quelques années, les chercheurs utilisent des technologies pour modifier directement l’ADN des patients afin de réparer la mutation responsable de l’apparition des symptômes. Des technologies d’édition du génome telles que CRISPR/Cas9 constituent donc une avenue prometteuse pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques comme l’EBS. Cette technologie permet de cibler un endroit précis dans le génome par la combinaison d’un ARN guide simple brin et d’une protéine Cas9. La réparation de l’ADN se fait par l’induction d’une coupure double brin de l’ADN par la protéine Cas9 et sa réparation par un fragment d’ADN donneur double ou simple brin. Ce projet a pour objectif principal de corriger les mutations causant l’EBS chez deux patients possédant des mutations hétérozygotes. Plus spécifiquement, ce projet de maîtrise a pour objectif d’optimiser la méthode permettant l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans un contexte d’EBS. La technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée sur des cellules HEK293T, permettant de démontrer que la Cas9 est en mesure d’induire une coupure double brin de l’ADN au site ciblé dans l’ADN. Ensuite, il a été démontré que la coupure de la Cas9 jumelée à l’utilisation d’un ADN double ou simple brin permet de réparer la coupure en réalisant de la recombinaison homologue. Le séquençage a permis de confirmer ces résultats. À ce jour, les résultats dans les cellules HEK293T se sont montrés concluants et ont permis d’initier les travaux dans les fibroblastes de patients.

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Presqu’un tier des cas de démence frontotemporale est causé par une mutation sur les gènes progranulin (GRN), microtubule-associated protein tau (MAPT) ou chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72). Plusieurs années avant le début de la maladie, plusieurs études montrent déjà des changements au niveau cérébral chez les porteurs présymptomatiques de ces mutations. En utilisant la TEP-FDG, nous posons l’hypothèse que les changements cérébraux de ces porteurs de mutations apparaîtront de façon plus précoce qu’en utilisant des techniques d’imagerie traditionnelles. Nous avons recruté 18 participants venant de familles à risque de DFT (6 porteurs de mutations MAPT et 12 nonporteurs) de l’étude GENFI. Un examen clinique et neuropsychologique complet a été effectué. Une TEP-FDG a été effectuée chez tous nos participants. Les images ont été segmentées et analysées par le logiciel MIMNeuro. Les porteurs et non-porteurs ne diffèrent pas significativement entre les groupes quant au métabolisme cérébral peu importe la région. L’évaluation visuelle par un médecin nucléiste expert ne semble pas non-plus être en mesure de différencier les porteurs des non-porteurs. L’observation qualitative des imageries des patients semble montrer des altérations médiales temporales chez la majorité des porteurs de mutation et chez quelques non-porteurs. / About one third of frontotemporal dementia (FTD) are caused by mutations on the progranulin (GRN), microtubule-associated protein tau (MAPT) or chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) genes. Several studies show that there are cerebral changes many years prior to the actual onset of the disease in pre-symptomatic carriers. Using fluorodeoxyglucose-positron emission tomography (FDG-PET), we expected to observe cerebral changes in carriers earlier than other traditional imaging techniques. We recruited 18 participants from families at risk of FTD (6 carriers and 12 non-carriers) from the GENFI study. A complete clinical and neuropsychological examination was performed. FDG-PET scan was done in all participants. Carriers and non-carriers did not differ significantly regarding brain metabolism (regardless of the region). Visual inspection by an expert nuclear medicine specialist could not differentiate carriers from non-carriers. Qualitative analyses of imaging of patients showed medial temporal alterations in most carriers and in some noncarriers.