Titre de l'écran-titre (visionné le 12 janvier 2024) / Les protéines sont des machines moléculaires essentielles au fonctionnement des organismes vivants. Malgré plus de 60 ans de recherche en ce sens, notre compréhension des mécanismes qui façonnent leur évolution reste loin d'être complète. Les nouvelles méthodes d'édition de génome offrent de nouvelles possibilités en termes de méthodologie pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Les connaissances découlant de ces nouvelles approches ont un potentiel important pour améliorer la santé humaine, animale et végétale. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont en premier lieu élaboré une nouvelle méthodologie basée sur l'édition de base pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Cette approche a identifié plus de 700 sites ayant une importance fonctionnelle dans les gènes essentiels de levure. Les données générées par cette expérience ont aussi permis d'identifier des propriétés de sgRNA déterminantes pour l'efficacité de l'édition base. Dans le deuxième chapitre, nous avons utilisé une approche de mutagenèse systématique pour caractériser les mutations menant à la résistance à un antifongique, la 5-fluorocytosine, dans le gène FCY1. Nous avons en même temps pu mesurer les compromis résistance-fonction pour les mutants de ce gène, et pu valider la capacité de notre jeu de données à prédire le phénotype de résistance de mutants d'orthologues provenant d'espèces de levures pathogènes. Finalement, nous avons utilisé nos connaissances des propriétés de FCY1 acquises au chapitre précédent pour en faire un modèle d'évolution des protéines. Plus précisément, nous avons exploré le rôle potentiel de l'épistasie en trans entre des mutants de perte de fonction dans la transition d'un complexe homomérique vers hétéromérique suite à une duplication de gène. Nous avons découvert des centaines de paires d'allèles inactifs de FCY1 pouvant se complémenter, et avons pu explorer les propriétés de ces mutants et des complexes hétéromériques résultants. / Proteins are molecular machines essential to the functioning of living organisms. Despite more than 60 years of research in this direction, our understanding of the mechanisms that shape their evolution remains far from complete. Recently developed genome tools methods offer new possibilities in terms of methodology for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. The knowledge resulting from these new approaches has significant potential in human, animal, and plant health. In the first chapter of this thesis, we developed a new methodology based on base editing for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. This approach identified more than 700 sites of functional importance in essential yeast genes. The data generated by this experiment also made it possible to understand sgRNA properties that are decisive for the efficiency of base editing. In the second chapter, we used a systematic mutagenesis approach to characterize the mutations leading to resistance to an antifungal, 5-fluorocytosine, in the FCY1 gene. At the same time, we measured the resistance-function trade-offs for mutants of this gene and validated the ability of our dataset to predict the resistance phenotype of orthologous mutants from pathogenic species. Finally, we used our knowledge of the properties of FCY1 acquired in the previous chapter to use it as a model for protein evolution. Specifically, we explored the potential role of trans epistasis between loss-of-function mutants in the transition from a homomeric to a heteromeric complex following gene duplication. We have discovered hundreds of pairs of inactive FCY1 alleles that can complement each other, and have been able to explore the properties of these mutants and the resulting heteromeric complexes.

Le retard mental (RM) est une maladie incurable qui affecte 2 à 3 % de la population. Des mutations dans le gène GDI1, codant pour GDIa, un régulateur des GTPases Rab, sont associées à un RM chez l'homme. Un médicament ayant pour cible un gène ayant une fonction antagoniste à GDI1 pourrait réduire les symptômes de la maladie. Une mutation suppressive est une 2e mutation à un site différent de la mutation à l'étude, qui supprime le phénotype de la première mutation. Afin d'identifier ces suppresseurs génétiques, nous utilisons une approche couplant la génomique intégrative et la génétique chez un animal modèle, le nématode Caenorhabditis elegans. La réduction de l'expression de gdi-1 par traitement des nématodes à l'ARN interférent (ARNi) nous a permis d'observer 7 phénotypes: la stérilité (Ste); une altération de la morphologie de la gonade (Gon); une accumulation d'oocytes endomitotiques (Emo); une diminution de la contraction des cellules myoépithéliales de la gaine de la gonade, un défaut de morphologie des oocytes matures et une inhibition de l'endocytose des particules yolk (YPl70-GFP) par les oocytes. Nous montrons que gdi-1 joue un rôle important dans le contrôle de la morphologie des gonades et des oocytes. Notre laboratoire a récemment développé un outil bioinformatique permettant la prédiction d'interactions génétiques chez C. elegans. Nous avons utilisé les prédictions faites pour gdi-1 afin d'estimer la performance de ce prédicteur. Cette étude nous a permis d'identifier des partenaires fonctionnels de gdi-1 dont les fonctions neurologiques ont déjà été reconnues chez l'homme et de prouver le grand potentiel prédictif de notre outil bioinformatique. Parmi les partenaires fonctionnels identifiés pour gdi-1, il y a dyb-1 (dystrobrevin) qui est l'orthologue le plus près de dystrobrévine chez l'homme, une protéine associée à certaines formes de RM et une dystrophie musculaire. De plus, gdi-1 (ARNi) diminue le phénotype de dystrophie musculaire associé à dyb-1. Plusieurs gènes qui interagissent avec gdi-1, interagissent aussi avec des protéines motrices, dont la myosine qui contrôle la contraction de la machinerie actinemyosine. Ces résultats sont en accord avec le rôle montré pour gdi-1 dans le contrôle de la contraction de la gonade, ainsi que dans la morphologie des gonades et des oocytes. Notre approche nous a permis d'identifier des suppresseurs génétiques de gdi-1 chez le nématode C. elegans qui pourrait s'avérer être des cibles thérapeutiques prometteuses contre certaines formes de RM. De plus, cette approche nous a permis d'identifier une famille d'agents actifs pouvant être testée comme agents thérapeutiques contre les déficits neurologiques associés à la délétion fonctionnelle de GDI-1 chez la souris. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : gdi-1, retard mental, plasticité synaptique, dystrophie musculaire, ML-7, Rab, dystrobrévine, Caenorhabditis elegans, cible thérapeutique.

Thèse de doctorat : Bioinformatique : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 269-280.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative qui se manifeste par un vaste répertoire de symptômes moteurs, cognitifs et psychiatriques. La pathologie est causée par une expansion anormale de la queue polyglutamine du gène huntingtine (HTT), qui code pour une protéine ubiquitaire du même nom, et qui possède différentes fonctions dans de nombreux processus cellulaires. La MH résulte de l'expression d'une forme mutée de la protéine huntingtine (mHTT), laquelle peut s'agréger et ainsi interférer avec les processus cellulaires conduisant à la dégénérescence des cellules. Une précédente étude a analysé les conséquences délétères de la présence de mHTT dans la barrière-hémato-encéphalique (BHE), une structure cellulaire localisée au niveau du réseau vasculaire cérébral qui empêche le passage de substances périphériques à l'intérieur du système nerveux central (SNC). Par conséquent, nous avons décidé d'explorer l'existence de déficiences similaires au niveau de la barrière entre sang et la moelle épinière, une structure similaire à la BHE, mais localisée dans le réseau vasculaire de la moelle épinière (blood-spinal cord barrier, BSCB). Nous avons d'abord analysé la distribution, la fréquence et la localisation spécifique des agrégats de mHTT dans des échantillons de moelle épinière provenant de patients MH et de contrôles sains. Ces analyses ont révélé la présence quasi-exclusive de la mHTT dans la substance grise de la moelle épinière. Nous avons par la suite mesuré l'impact de ces agrégats sur les composants protéiques de la BSCB. Notre analyse démontre une dérégulation significative de certaines protéines essentielles formant des jonctions serrées dans la barrière, causant possiblement le phénomène de perméabilité accrue de la BSCB observé chez les patients atteints de la MH. Des études précédentes ont conduit à la théorie selon laquelle la mHTT pourrait se comporter à la manière d'un prion, propageant ainsi la maladie dans le SNC. Nous avons validé cette théorie en utilisant trois approches différentes ; une in vitro et deux in vivo. Trois différents modèles cellulaires humains (SH-SY5Y, THP1, et iGABA) ont été traités avec des fibrilles synthétiques afin d'observer l'effet de fibrilles humaines exogènes de mHTT (Q48) et de huntingtine normale (HTT ; Q25). Nous avons observé que les fibrilles pouvaient être internalisées par ces cellules, induisant des changements morphologiques et de la mort cellulaire. De plus, des changements de niveaux de HTT ont été observés. Au cours des expériences in vivo, des souris adultes sauvages (WT) ont reçu une injection intra-corticale unilatérale de fibrilles synthétiques de fragments N-terminaux de (m)HTT (Q25 et Q48), alors que des souriceaux R6/2 et WT ont reçu une injection intraventriculaire bilatérale. Dans les deux protocoles, les injections de fibrilles Q48 ont conduit à des changements comportementaux et les analyses post-mortem ont révélé que ces fibrilles exogènes étaient capables d'induire et d'exacerber la pathologie. Ces résultats démontrent que la mHTT pourrait se comporter tel un prion, se propageant et aggravant la pathologie dans le SNC. De plus, la démonstration que la mHTT perturbe l'intégrité de la BSCB suggère que l'exacerbation de sa perméabilité pourrait être une route possible de la propagation de la mHTT. / Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative disorder that results in a series of motor, cognitive, and psychiatric symptoms. The pathology is caused by abnormal expansion of the polyglutamine tract of the huntingtin gene (HTT), which encodes a ubiquitous protein named huntingtin, and has different functions in several cellular processes. HD results from the expression of a mutated form of the huntingtin protein (mHTT) that forms protein aggregates and disrupts these cellular processes causing neurodegeneration. A previous study analyzed the deleterious consequence of the presence of mHTT on the blood-brain barrier (BBB), a cellular structure located in the brain vasculature that prevents the passage of peripheral substances into the central nervous system (CNS). Therefore, we decided to explore the existence of similar impairments in the blood-spinal cord barrier (BSCB), a structure similar to the BBB, but located in the spinal cord vasculature. To begin with, we analyzed the anatomical distribution, frequency, and specific location of mHTT aggregates in spinal cord samples from HD and healthy control human samples, revealing an almost exclusive presence of mHTT within the grey matter of the spinal cord. We then measured HD impact on the spinal cord vasculature and BSCB permeability. Our analysis showed an increase of the small blood vessel density and the presence of features related to BSCB leakage, such as diffusion of fibrinogen in the surrounding parenchyma and peripheral cells infiltration. Moreover, the measure of the levels of the protein components of the BSCB revealed a downregulation of some essential proteins forming tight junctions in the barrier that is the likely cause of the increased BSCB permeability that we observed in HD patients. Previous studies led to the theory that mHTT might behave in a prion-like fashion spreading and seeding the disease throughout the CNS. We validated this theory using three different approaches; one in vitro and two in vivo. Three different human cell lines (SH-SY5Y, THP1, and iGABA neurons) were treated with synthetic fibrils to observe the effect of exogenous human fibrillar mHTT (Q48) and huntingtin (HTT) (Q25). We observed that the fibrils could be taken up by these cells, subsequently inducing cellular morphological changes and apoptosis. Moreover, changes in HTT levels and sequestration of endogenous HTT within pathological inclusion bodies were observed suggesting a prion-like behavior by mHTT. Subsequently, in in vivo experiments, wild type (WT) adult mice were administered an intracortical unilateral injection of synthetic fibrillar N-terminal fragments of mHTT (Q25 and Q48), while R6/2 and WT pups received a bilateral intraventricular injection. In both protocols, the Q48 injections resulted in behavioral changes and the appearance of features HD-related. The post-mortem analysis revealed that the exogenous fibrils were able to spread through the brain inducing and exacerbating the pathology in both animal models. These results demonstrate that mHTT might behave in a prion-like fashion, spreading and exacerbating the disease throughout the CNS. Moreover, the demonstration that mHTT disrupts the integrity of the BSCB suggests that the increased permeability could be a route of mHTT propagation.

Thèse d'exercice : Médecine. Génétique médicale : Paris 12 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 45-51.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Informatique : Lille 1 : 2004. / N° d'ordre (Lille 1) : 3565. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 173-177. Index.

Th. : Göteborg : 1998. / Notes bibliogr.