La surexpression rétrovirale du facteur de transcription HOXB4 résulte en une expansion sélective des cellules souches hématopoïétiques (CSH) in vitro et in vivo et ce, sans induire de leucémie. Par contre, la demi-vie intracellulaire de la protéine est de seulement une heure et le fait que la protéine disparaît du milieu de culture après environ 4 heures représente un obstacle majeur à l’utilisation clinique de la protéine HOXB4. Trois mutants HOXB4 ayant une substitution d`un seul acides aminés (AA) parmi les 31 premiers AA ont démontré une augmentation de la stabilité de la protéine. Nous avons donc évalué l’effet de HOXB4 et de ses trois mutants sur la production de cellules progénitrices myéloïdes. L’expression ectopique de HOXB4 sauvage (s-HOXB4) et HOXB4 mutant (m-HOXB4) a un effet comparable sur la fréquence des cellules progénitrices myéloïdes en essai clonogénique. Par contre, la capacité de prolifération des cellules progénitrices myéloïdes qui surexpriment s-HOXB4 et 1423 m-HOXB4 a été supérieure à celle des cellules contrôles (GFP seul) et des deux autres mutants. De plus, malgré le fait que toutes les variantes de HOXB4 confèrent une capacité d’autorenouvellement similaire aux cellules progénitrices multipotents (GEMM), la production des progéniteurs granulocytaires (CFU-G) est compromise lorsque les cellules surexpriment 1426 et 1427 m-HOXB4. D’autre part, la densité cellulaire des colonies myéloïdes qui surexpriment ces deux mutants est diminuée, ce qui suggère que ces mutations ont non seulement augmenté sa stabilité, mais potentiellement affecté certaines fonctions biologiques de s-HOXB4. Enfin, 1423 m-HOXB4 semble n’avoir perdu aucune fonction de s-HOXB4 dans nos évaluations clonogéniques in vitro, ce qui fait de ce mutant une molécule intéressante pour des applications cliniques d’expansion des cellules progénitrices hématopoïétiques. / Over-expression of the homeobox transcription factor HOXB4 results in a selective expansion of HSC in vitro and in vivo. However, the intracellular half-life of the protein is only one hour, which represents an important obstacle for its clinical use. Three HOXB4 mutants with single amino acid (AA) substitution in the first 31 AA have demonstrated increased intracellular stability of the protein. We evaluated the effect of wild type (wt) and mutant (m) HOXB4 on expansion and differentiation of myeloid progenitors. Ectopic expressions of wt- and m- HOXB4 had a comparable effect on the frequency of myeloid progenitors in semi-solid assay. However, the proliferative capacity of myeloid progenitors expressing wt-HOXB4 and 1423 m-HOXB4 was considerably better than that of control (GFP only) and other two mutants. Additionally, while all HOXB4 variants conferred similar self-renewal capacity to multipotent (GEMM) progenitors, the production of single-lineage granulocytic progenitors (CFU-G) was severely compromised when cells were expressing 1426 and 1427 m-HOXB4. Conversely, the cellularity of myeloid colonies was also diminished with these mutants suggesting, that both mutations affect certain biologic function(s) of wt-HOX4 in addition to increasing its stability. On the other hand, 1423 m-HOXB4 did not seem to lose any wt-HOXB4 functions tested in in vitro assays making this mutant an interesting target for further investigation.

Diverses études ont souligné le rôle prépondérant du dialogue entre les cellules NK et les cellules dendritiques au cours des réponses immunes. Cependant, les récepteurs impliqués dans ce processus restent incertains. Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à identifier les récepteurs mis en jeu lors de la reconnaissance virale à l’aide de modèles humains et murins. Pour cela, nous avons mimé l’infection virale en utilisant deux ARN bicaténaires synthétiques – poly(AU) et poly(IC) – et montré qu’ils sont tous deux capables d’activer TLR3 mais que seul poly(IC) engage les hélicases RIG-I et MDA5. Les deux ARN induisent l’activation des cellules NK au sein des PBMC humaines, mais seul poly(IC) induit la production d’IFN-gamma. Les DC myéloïdes (mDC) sont requises pour cette activation sans nécessité d’un contact cellulaire entre les cellules NK et les mDC. En outre, les IFN de type I et l’IL-12 secrétés par les DC sont respectivement nécessaires à l’initiation du potentiel lytique et à la production d’IFN-gamma. Poly(IC), au contraire de poly(AU), a une action synergique avec l’IL-12 produite par les mDC pour induire la production d’IFN-gamma en agissant directement sur les cellules NK. Enfin, l’activation conjointe de TLR3 et des hélicases RLR sur les mDC et RIG-I sur les cellules NK, nécessaire à la production d’IFN-gama en réponse à l’ARN bicaténaire, a été confirmée à l’aide de souris déficientes pour TLR3 et Cardif et d’un ligand spécifique de RIG-I. En conclusion, nous rapportons pour la première fois la nécessité pour un composé microbien d’engager deux familles de récepteurs sur deux populations cellulaires distinctes pour induire une réponse innée éfficace. / Crosstalk between NK cells and DC is critical for the response to the microbial mimic poly(IC) but the dsRNA receptors involved in each cell types remained to be defined. We show herein that two dsRNA, poly(AU) and poly(IC), similarly engaged TLR3 while only poly(IC) triggered the RIG-I and MDA-5 helicases. Both dsRNA triggered NK cell activation within PBMC but only poly(IC) induced IFN-gamma. mDC were required for NK cell activation by the two dsRNA, suggesting that they triggered at least TLR3 on mDC. DsRNA induction of cytolytic potential and IFN-gamma production in NK cells did not require contact with mDC but was dependent on the secretion of type I IFN and IL-12, respectively. Poly(IC) but not poly(AU) synergized with mDC-derived IL-12 for high IFN-gamma production by acting directly on NK cells. Finally, the requirement of TLR3 and the RLR on mDC and the involvement of the RIG-I but not TLR3 on NK cells for the production of IFN-gamma induced by dsRNA was confirmed using TLR3 and Cardif deficient mice and RIG-I specific activator. This cooperation was further confirmed using inactivated FLU virus infected-target cells both in human and mouse system demonstrating that NK cells were able to sense viral material by a direct transfer from infected cells likely through lytic immunological synapse without prior infection of NK cells. Thus, we report for the first time the requirement of cotriggering

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Un défi de la transcriptomique est d'explorer l'intégralité du répertoire des transcrits normaux et anormaux. Les analyses de GEP (Gene Expression Profiling) basées sur la technologie des puces à ADN sont largement exploitées en cancérologie depuis plusieurs années. Parallèlement, les nouvelles méthodes basées sur le séquençage à haut débit offrent désormais la possibilité de réaliser des analyses précises et sensibles nécessaires à l'étude des cellules normales et cancéreuses. Quelle que soit la méthode, la caractérisation de l'ensemble des transcrits codants et non-codants représente un réel défi biologique pour la recherche de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic, et pour la bonne prise en charge des patients. Dans ce travail, j'ai eu l'occasion de traiter deux aspects différents de la biologie qui convergent vers l'identification de transcrits exprimés de manière aberrante dans les leucémies myéloïdes. Le premier aspect a consisté à proposer une sélection de biomarqueurs moléculaires pour la caractérisation de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC). A partir de l'expression de ces gènes, nous avons développé un score de pronostic qui a permis de définir deux groupes de patients cliniquement distincts. Nous avons ensuite complété notre étude par une caractérisation phénotypique par cytométrie en flux des sous-populations cellulaires aberrantes constituant les lignages mono- et granulocytaires. Une partie de ce travail a été étendue aux leucémies aiguës myéloïdes (LAM) à caryotype normal (CN). L'autre aspect a consisté à participer à la mise en place d'une approche computationnelle intégrée pour caractériser de nouveaux ARNs non annotés et fort probablement non-codants. En explorant des données de Digital Gene Expression (DGE), nous avons quantifié et caractérisé la fraction de ces transcrits dans les régions intergéniques. Nous avons vérifié l'expression de ces nouveaux transcrits dans les tissus normaux et cancéreux en croisant avec d'autres données d'expression, telles que le RNA-Sequencing, et regarder leur conservation et leur expression dans d'autres espèces. / A challenge of transcriptomics is to explore the full repertoire of normal and abnormal transcripts. Gene expression profiling analyses based on microarray technology are widely used in cancer research since many years. Meanwhile, new methods based on high-throughput sequencing methods offers henceforth the possibility to undergo accurate and sensitive analyses necessary for studying normal and cancer cells. Despite the method, the characterization of all coding and non-coding transcripts is a real biological challenge in identifying novel diagnostic and prognostic markers, and for the proper care of patients. In the present work, I had the opportunity to address two different aspects of biology, both convergent toward the identification of aberrantly expressed transcripts in myeloid leukemia. The first aspect was to provide a selection of molecular biomarkers for the characterization of chronic myelomonocytic leukemia (CMML). We developed a gene expression-based prognostic score which identified two clinically distinct groups of patients. We then completed our study with a phenotypic characterization by flow cytometry of aberrant subpopulations constituting the myeloid and granulocytic lineages. A part of this work has been extended to acute myeloid leukemia (AML) patients with normal karyotype. The other aspect was to participate in the implementation of an integrated computational approach in order to characterize novel non annotated RNAs, more likely non-coding. We quantified and characterized the proportion of these transcripts in intergenic regions by exploring Digital Gene Expression (DGE) data. We checked their expression in normal and cancer tissues by crossing with RNA-Seq data, and their conservation and expression in other species.

Le système immunitaire joue un rôle complexe, tantôt protecteur, tantôt facilitateur dans la relation hôte-tumeur. La souris transgénique pour le proto-oncogène humain RET développe un mélanome spontané et métastatique et constitue un remarquable modèle pour étudier les facteurs immunitaires et génétiques de la réponse de l’hôte. Ce modèle a été essentiellement examiné sur le fond C57BL/6. La tumeur primaire se situe au niveau de l’œil et se propage ensuite à la face et au dos ainsi qu’aux viscères. La pathogenèse du mélanome est cependant multifactorielle et le contexte génétique peut donc moduler de façon déterminante l’expression du transgène, la surveillance immunitaire et l’évolutivité des tumeurs. Par croisements en retour, nous avons transféré le transgène RET du fond génétique B6 sur le fond NOD (Non-Obese Diabetic), connu par sa propension à l’auto-immunité. Une accélération du développement tumoral a été observée chez les souris NOD.RET+, au site primitif et surtout à distance, par comparaison aux souris B6.RET+. L’objectif de ce travail était ensuite de caractériser les modifications immunitaires en relation avec le fond pro-inflammatoire de la souris NOD et l’accélération du développement tumoral. Nous avons observé une augmentation des cellules T régulatrices, CD4+Foxp3+ dans les tumeurs des souris NOD.RET+ comparées aux souris B6.RET+. Cette augmentation était corrélée avec celle des cellules CD8 exprimant l’interféron-gamma (IFNγ). Surtout, le phénotype agressif chez les souris NOD.RET+ était associé à une perte de l’expression de la Dectin-1 sur les cellules myéloïdes. La Dectin-1 est un récepteur de type C-lectine, connu pour son rôle essentiel dans la réponse anti-infectieuse. De ce fait, le traitement des souris avec le curdlan, un ligand de la Dectin-1, prévenait le développement des métastases. Par ailleurs, l’inactivation du gène Nos2, codant la synthase du monoxyde d’azote de type 2, protégeait également les souris vis-à-vis des métastases. De façon remarquable, l’expression de la Dectin-1 était restaurée chez les souris Nos2-KO, suggérant pour la première fois un lien entre ce récepteur et la voie Nos2. Parallèlement, une étude de la valeur pronostique de l’expression quantitative du gène NOS2 a été entreprise par qPCR sur des biopsies de tumeurs humaines obtenues chez 108 patients tunisiens (sein, n=27 ; côlon/Rectum, 24 ; cavum, 28 ; mélanome, 29). D’une façon générale, l’expression de NOS2 était plus élevée dans les tumeurs du sein comparées à celle du côlon et du cavum, et surtout aux mélanomes où NOS2 était faiblement exprimé. De plus, l’expression de NOS2 était plutôt de mauvais pronostic. En effet, elle était corrélée avec l’indice de Breslow, le niveau de Clark et le sous-type histologique dans les mélanomes. Dans le cancer du cavum, elle était corrélée avec l’âge, le stade TNM, la présence de métastases, la réponse au traitement et l’expression de COX-2. Dans les cancers coliques, elle était corrélée avec le stade TNM, la taille et la localisation des tumeurs et leur type histologique. Dans le cancer du sein, elle était associée avec la taille des tumeurs, le stade tumoral, le grade SBR et les cas triples négatifs. Notre étude a ainsi permis d’établir un nouveau modèle murin de mélanome spontané et agressif, la souris NOD.RET+, qui devrait permettre de mieux comprendre les facteurs de l’hôte qui influencent le pronostic des mélanomes murins et donc peut-être humains et plus généralement la relation hôte-tumeur. Par ailleurs, le rôle de NOS2 a été souligné et surtout relié à l’expression de la Dectin-1. Ces deux protéines pourraient constituer des cibles thérapeutiques intéressantes, d’autant plus que nous avons confirmé la valeur de mauvais pronostic de l’expression de NOS2 dans quatre cancers humains d’origine épithéliale. / Mice transgenic for the RET oncogene provide a remarkable model for investigating the mechanisms underlying the promotion and the development of melanoma. This model was established on the C57BL/6 genetic background. In the present study, we investigated an effect of the strongly proinflammatory and autoimmune genetic makeup of the non-obese diabetic (NOD) strain. We bred (NODxB6)F1 mice and backcrossed them with NOD mice. F1 mice and mice at subsequent generations of backcrossing showed marked acceleration of tumor development, in particular with a more frequent and earlier extension of the primary uveal melanoma. In close relation with this severe evolution, we observed a profound drop in Dectin-1 expression on CD11b+Ly6G+ granulocytic myeloid cells correlating with an expansion of CD4+Foxp3+ T regulatory cell and of interferon (IFN)-γ producing CD8+ T cell subsets in tumors. IFNγ is a major inducer of the type 2 nitric-oxide synthase (Nos2) gene whose products are known to be tumorigenic. Germline inactivation of the Nos2 gene was associated with a dramatically improved tumor prognosis and a restoration of Dectin-1 expression on myeloid cells. Moreover, in vivo treatment of (NODxB6)F1.RET+ mice with curdlan, a glucose polymer that binds Dectin-1, prevented tumor extension and was associated with marked reduction of the CD4+Foxp3+ T cell subset. In parallel, we study the prognostic value of iNOS expression in four types of human tumors of 108 Tunisian patients: (breast n=27, colorectal=24, nasopharyngeal=28, and melanoma=29). The level of iNOS was measured by RT-QPCR in tumor specimens. We showed that the expression of iNOS was higher in breast compared to colorectal and nasopharyngeal tumors whereas in melanoma, the level of iNOS expression was low. Furthermore, iNOS expression correlated with the Breslow thickness, Clark level and histological subtype in melanoma while in nasopharyngeal carcinoma, significant association was seen with age at diagnosis, TNM, metastasis, response to treatment and expression of COX-2. Furthermore, the expression of iNOS correlated with tumor size, TNM, tumor location, and histological type in colorectal cancer, and with tumor size, tumor stage, SBR grade and triple negative cases in breast cancer. These observations highlight the (NODxB6)F1.RET+ mice as a new model to investigate the role of the immune system in the host-tumor relationship. Furthermore, the role of NOS2 was emphasized and mainly related to the expression of the Dectin-1. These two proteins could constitute a potentially promising therapeutic target, especially as we confirmed the poor prognostic value of the expression of NOS2 in four epithelial human cancers.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) du sujet âgé sont les plus fréquentes des leucémies aiguës. Bien que de physiopathologie hétérogène, elles partagent un pronostic défavorable. L’azacitidine est devenue un des traitements de référence pour les patients jugés inéligibles pour une chimiothérapie intensive mais les critères de sélection des patients entre ces deux approches sont controversés. L’identification de biomarqueur prédictif de réponse à l’azacitidine doit permettre de rationnaliser ce choix thérapeutique. Les facteurs pronostiques classiques d’une cohorte de 334 patients atteints de LAM manquent de précision pour guider la meilleure stratégie pour un patient donné. A partir du séquençage de 224 patients traités par azacitidine, nous montrons un impact défavorable des mutations de TP53 sur la survie globale, quel que soit leur caractérisation fonctionnelle. Le séquençage des exomes de 49 patients selon leur réponse à l’azacitidine (26 répondeurs et 23 non répondeurs), suivi du re-séquençage ciblé de 4 polymorphismes chez 175 patients a montré un impact positif du polymorphisme rs7622799 de MECOM sur la survie globale sous azacitidine. / Elderly patients with acute myeloid leukemias (AML) represent the most frequent acute leukemias. Although they differ in their pathophysiology, they all share an adverse prognosis. Azacitidine has become one of the reference low-intensity frontline therapy for patients deemed unfit for intensive chemotherapy. Patients selection between these 2 options remains controversial. Predictive biomarkers of response to azacitidine should allowed to rationalize this decision making. Classical prognosis factors of a cohort of 334 newly diagnosed AML lack of precision to determine the optimum strategy for any individual patient. By sequencing of a 224-patients series of azacitidine-treated AML patients, we demonstrate an adverse impact of TP53 mutation on overall survival, irrespective of the functional characterization of p53 mutants. Exome sequencing of 49 patients with extreme phenotype as defined by their response under azacitidine (26 responders versus 23 non-responders), followed by targeted sequencing of 4 common polymorphisms in a validation set of 175 patients, showed a positif impact of MECOM rs7622799 on overall survival.

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique. / Ex vivo hematopoietic stem cell expansion represents a most appealing option to improve bone marrow transplantation. Utilization of the unique hematopoietic stem cell (HSC) expansion abilities of the transcription factor HOXB4 for clinical applications is hampered by its short intracellular half-life. To overcome this difficulty, 3 different single amino-acid substitution mutants of HOXB4 with 3-4 fold increased half-life were generated and their biologic activity compared to that of wild type (wt) HOXB4 using in vitro and in vivo assays. We have shown that overexpression of mutated HOXB4 in HSC using an infection strategy did not impair their long term hematopoietic reconstitution potential in transplanted mice. We have found that cells overexpressing mutant HOXB4 had greater expansion in vitro in competitive and non-competitive designs than wt HOXB4. Moreover, in vivo peripheral blood and spleen repopulation had lymphoid and myeloid contributions closer to untransplanted animals with mutant than wt HOXB4. In addition, cells overexpressing mutant HOXB4 protein were detected much more rapidly and in greater proportion in peripheral blood than cells overexpressing the wt form. One of the mutated HOXB4 proteins (1426) did not promote the expansion of common myeloid progenitors in comparison to wt HOXB4. Finally, using intracellular protein modulation studies, we have shown that the effects of mutated and wt HOXB4 proteins in hematopoietic stem and progenitor cells were not completely due to a HOXB4 concentration effect.

La surexpression rétrovirale du facteur de transcription HOXB4 résulte en une expansion sélective des cellules souches hématopoïétiques (CSH) in vitro et in vivo et ce, sans induire de leucémie. Par contre, la demi-vie intracellulaire de la protéine est de seulement une heure et le fait que la protéine disparaît du milieu de culture après environ 4 heures représente un obstacle majeur à l’utilisation clinique de la protéine HOXB4. Trois mutants HOXB4 ayant une substitution d`un seul acides aminés (AA) parmi les 31 premiers AA ont démontré une augmentation de la stabilité de la protéine. Nous avons donc évalué l’effet de HOXB4 et de ses trois mutants sur la production de cellules progénitrices myéloïdes. L’expression ectopique de HOXB4 sauvage (s-HOXB4) et HOXB4 mutant (m-HOXB4) a un effet comparable sur la fréquence des cellules progénitrices myéloïdes en essai clonogénique. Par contre, la capacité de prolifération des cellules progénitrices myéloïdes qui surexpriment s-HOXB4 et 1423 m-HOXB4 a été supérieure à celle des cellules contrôles (GFP seul) et des deux autres mutants. De plus, malgré le fait que toutes les variantes de HOXB4 confèrent une capacité d’autorenouvellement similaire aux cellules progénitrices multipotents (GEMM), la production des progéniteurs granulocytaires (CFU-G) est compromise lorsque les cellules surexpriment 1426 et 1427 m-HOXB4. D’autre part, la densité cellulaire des colonies myéloïdes qui surexpriment ces deux mutants est diminuée, ce qui suggère que ces mutations ont non seulement augmenté sa stabilité, mais potentiellement affecté certaines fonctions biologiques de s-HOXB4. Enfin, 1423 m-HOXB4 semble n’avoir perdu aucune fonction de s-HOXB4 dans nos évaluations clonogéniques in vitro, ce qui fait de ce mutant une molécule intéressante pour des applications cliniques d’expansion des cellules progénitrices hématopoïétiques. / Over-expression of the homeobox transcription factor HOXB4 results in a selective expansion of HSC in vitro and in vivo. However, the intracellular half-life of the protein is only one hour, which represents an important obstacle for its clinical use. Three HOXB4 mutants with single amino acid (AA) substitution in the first 31 AA have demonstrated increased intracellular stability of the protein. We evaluated the effect of wild type (wt) and mutant (m) HOXB4 on expansion and differentiation of myeloid progenitors. Ectopic expressions of wt- and m- HOXB4 had a comparable effect on the frequency of myeloid progenitors in semi-solid assay. However, the proliferative capacity of myeloid progenitors expressing wt-HOXB4 and 1423 m-HOXB4 was considerably better than that of control (GFP only) and other two mutants. Additionally, while all HOXB4 variants conferred similar self-renewal capacity to multipotent (GEMM) progenitors, the production of single-lineage granulocytic progenitors (CFU-G) was severely compromised when cells were expressing 1426 and 1427 m-HOXB4. Conversely, the cellularity of myeloid colonies was also diminished with these mutants suggesting, that both mutations affect certain biologic function(s) of wt-HOX4 in addition to increasing its stability. On the other hand, 1423 m-HOXB4 did not seem to lose any wt-HOXB4 functions tested in in vitro assays making this mutant an interesting target for further investigation.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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