Adoptive immunotherapy using chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells targeting CD19 has shown remarkable therapeutic efficacy against B cell leukemia and lymphoma, and provided proof of concept for therapeutic potential in other hematologic malignancies. Acute myeloid leukemia (AML) is an entity with an unmet medical need for effective and curative treatments. Therefore, there is a strong desire for development of potentially curative CAR-T cell immunotherapy for AML treatment. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) is a homodimeric transmembrane protein expressed uniformly by AML blasts. FLT3 plays a vital role in the survival of AML blasts and is a key driver of leukemia-genesis in AML cases with internal tandem duplication (FLT3ITD) and tyrosine kinase domain (TKD) mutations. These attributes suggest that FLT3 could be an excellent target for CAR-T cell immunotherapy. Here, we engineered human CD4+ and CD8+ T cells to express FLT3-specific CARs and demonstrate that they confer potent reactivity against AML cell lines and primary AML blasts that express either wild-type FLT3 or FLT3-ITD. Further, we show that FLT3 CAR-T cells exert potent antileukemia activity in xenograft models of AML and induce complete remissions. We also demonstrate that FLT3-expression on FLT3-ITD+ AML cells can be augmented by FLT3 inhibitors, which lead to increased recognition by CARs and improved efficacy of FLT3 CAR-T cells. We confirmed this principle with three different FLT3 inhibitors which are at distinct stages of clinical development i.e. Phase II/III clinical trial (crenolanib, quizartinib) and clinically approved (midostaurin). Further, we observed the strongest anti-leukemia activity of FLT3 CAR-T cells in combination with crenolanib in vivo. FLT3 is known to be expressed by normal hematopoietic stem and progenitor cells. We evaluated FLT3-expression on normal hematopoietic stem cells (HSCs) using flow cytometry and confirmed lower level of FLT3-expression on HSCs and progenitors compared to AML cells. As anticipated, we found that FLT3 CAR-T cells recognize normal HSCs in vitro and in vivo, and compromise normal hematopoiesis, suggesting that adoptive therapy with FLT3 CAR-T cells will require successive CAR-T cell depletion and allogeneic HSC transplantation (HSCT) to reconstitute the hematopoietic system. Moreover, an FLT3 inhibitor treatment does not increase FLT3-expression on HSCs. Accordingly, we demonstrate that the depletion of FLT3 CAR-T cells is possible with inducible Caspase 9 (iCasp9) safety switch. Collectively, our data establish FLT3 as a novel CAR target in AML with particular relevance in high-risk FLT3-ITD+ AML. Our data demonstrate that FLT3 CAR-T cells act synergistically with FLT3 inhibitors in FLT3-ITD+ AML. i.e. FLT3 inhibitors-induced upregulation of FLT3 in FLT3-ITD+ AML cells enhances their recognition and elimination by FLT3 CAR-T cells. Due to recognition of normal HSCs, the clinical use of FLT3 CART cells is likely restricted to a defined therapeutic window and must be followed by CART cell depletion and allogeneic HSCT for hematopoietic reconstitution. The data provide rational to use FLT3 CAR-T cells in combination with FLT3 inhibitors to augment the anti-leukemia efficacy of FLT3 CAR-T cells in high-risk FLT3-ITD+ AML patients, and to mitigate the risk of relapse with FLT3-negative AML variants, which could otherwise develop under therapeutic pressure. The data provide proof of concept for synergistic use of CAR-T cell immunotherapy and small molecule targeted therapy and encourage the clinical evaluation of this combination treatment in high-risk patients with FLT3-ITD+ AML. / Adoptive Immuntherapie, die Chimäre- Antigenrezeptor (CAR) –modifizierte, gegen CD19 gerichtet T-Zellen verwendet, hat eine bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeit gegen B-Zell-Leukämien und -Lymphome und großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung anderer hämatologischer Erkrankungen gezeigt. Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist hierbei eine Entität, für die es bisher an wirksamen und kurativen Therapien fehlt und für die die Entwicklung einer potentiell kurativen CAR-T-Zellimmuntherapie von großer Bedeutung ist. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) ist ein homodimeres Transmembranprotein, das von AML-Blasten uniform exprimiert wird. FLT3 spielt eine wichtige Rolle beim Überleben von AML-Blasten und ist ein Schlüsselfaktor in der Leukämie-Genese bei AML-Fällen mit interner Tandem-Duplikation (FLT3-ITD) und Tyrosinkinase-Domänen (TKD)-Mutationen. Diese Eigenschaften legen die Vermutung nahe, dass FLT3 ein ausgezeichnetes Target für die CAR-T-Zell-Immuntherapie darstellen könnte. Daher setzten wir dort an und modifizierten humane CD4+ und CD8+ T-Zellen, um FLT3-spezifische CARs zu exprimieren, und konnten nachweisen, dass diese eine starke Reaktivität gegen AML-Zelllinien und primäre AML-Blasten besitzen, die entweder den FLT3-Wildtyp oder FLT3-ITD exprimieren. Weiterhin konnten wir zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen in AML-Xenograft-Modellen eine starke anti-Leukämie-Aktivität besitzen und vollständige Remissionen hervorrufen können. Zudem gelang der Nachweis, dass die FLT3-Expression auf FLT3-ITD+ AML-Zellen durch FLT3-Inhibitoren verstärkt werden kann, was zu einer erhöhten Erkennung durch die CARs und einer verbesserten Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen führt. Wir konnten dieses Prinzip mit drei verschiedenen FLT3-Inhibitoren belegen, die sich in unterschiedlichen Stadien der klinischen Entwicklung befinden, d. h. aus einer Klinischen Phase II / III-Studie (Crenolanib, Quizartinib) und einem klinisch zugelassenen Inhibitor (Midostaurin). Darüber hinaus beobachteten wir die stärkste anti-Leukämie-Aktivität von FLT3 CAR-T-Zellen in einer Kombination mit Crenolanib in vivo. Es ist bekannt, dass FLT3 von normalen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert wird. Wir untersuchten die FLT3-Expression in normalen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) mittels Durchflusszytometrie und bestätigten im Vergleich zu AML-Zellen eine niedrigere FLT3-Expression auf HSCs und Vorläuferzellen. Wie erwartet, zeigte sich, dass FLT3 CAR-T-Zellen normale HSCs in vitro und in vivo erkennen und die normale Hämatopoese beeinträchtigen, was darauf hindeutet, dass eine adoptive Therapie mit FLT3 CAR-T-Zellen eine sukzessive CAR-T-Zell-Depletion und allogene HSC-Transplantation erfordert, um das hämatopoetische System wiederaufzubauen. Darüber hinaus erhöht die Behandlung mit einem FLT3-Inhibitor nicht die FLT3-Expression auf den HSCs. Dementsprechend konnten wir aufzeigen, dass die Depletion von FLT3 CAR-T Zellen mit einer induzierbaren Caspase 9 (iCasp9) als „Sicherheitsschalter“ möglich ist. Zusammenfassend etablieren unsere Daten FLT3 als ein neuartiges CAR-Target in der Behandlung von AML mit besonderer Relevanz für die Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML. Unsere Daten zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen synergistisch mit FLT3-Inhibitoren in FLT3-ITD+ AML wirken, d.h. eine FLT3-Inhibitoren-induzierte Hochregulation von FLT3 in FLT3-ITD+ AML-Zellen bewirkt und dies die Erkennung und Eliminierung durch FLT3-CAR-T-Zellen verstärkt. Durch ihre Eigenschaft der Erkennung von normalen HSCs ist die klinische Verwendung von FLT3 CAR-T-Zellen wahrscheinlich auf ein definiertes therapeutisches Fenster beschränkt und muss durch eine anschließende CAR-T-Zell-Depletion und eine allogene HSCT zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems ergänzt werden. In Anbetracht der Daten scheint es sinnvoll, FLT3-CAR-T-Zellen in Kombination mit FLT3-Inhibitoren zu verwenden, um die anti-leukämische Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen bei Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML-Patienten zu erhöhen und das Risiko eines Rückfalls mit FLT3-negativen AML-Varianten zu verringern, die sich sonst therapiebedingt entwickeln könnten. Die Daten stellen ein Proof-of-Concept für den synergistischen Einsatz von CAR-T-Zell-Immuntherapie und niedermolekularen Inhibitoren dar, der eine klinische Evaluation dieser Kombinationsbehandlung bei Hochrisikopatienten mit FLT3-ITD+ AML erstrebenswert macht.

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Human cells from acute myeloid leukemia (AML) patients are frequently transplanted into immune-compromised mouse strains to provide an in vivo environment for studies on the biology of the disease. Since frequencies of leukemia re-initiating cells are low and a unique cell surface phenotype that includes all tumor re-initiating activity remains unknown, the underlying mechanisms leading to limitations in the xenotransplantation assay need to be understood and overcome to obtain robust engraftment of AML-containing samples. We report here that in the NSG xenotransplantation assay, the large majority of mononucleated cells from patients with AML fail to establish a reproducible myeloid engraftment despite high donor chimerism. Instead, donor-derived cells mainly consist of polyclonal disease-unrelated expanded co-transplanted human T lymphocytes that induce xenogeneic graft versus host disease and mask the engraftment of human AML in mice. Engraftment of mainly myeloid cell types can be enforced by the prevention of T cell expansion through the depletion of lymphocytes from the graft prior transplantation.

Acute Myeloid leukemia (AML) is an aggressive haematological malignancy that mainly affects the elderly. Relapse is common and is thought to be due to the presence of chemotherapy resistant leukemic stem cells (LSC). Within the CD34+ disease (>5% of the blast cells expressing CD34) , two subtypes have been identified; an LMPP/GMPlike expanded type and a MPP/CMP-like expanded type, the former is the most common, accounting for around 80% of CD34+ AML. Both the GMP-like and LMPPlike expanded populations show LSC activity. To improve our understanding of the disease and gain better insight in to how to develop treatments, the molecular basis of the disease needs to be investigated. I investigated miRNAs in the GMP/LMPP-like expanded AML. miRNAs are small non-coding RNAs involved in the regulation of mRNA. In recent years miRNAs have been shown to be implicated in many different diseases. To investigate the role miRNAs play in AML, miRNA expression was profiled in leukemic and normal bone marrow. Bioinformatic analysis was then used to examine the different miRNA expression profiles between normal and leukemic marrow. Our study showed that miRNAs are dysregulated in AML. miRNAs from the miR-17-92 and its paralogous cluster miR-106b-92 were amongst the miRNAs to be found down regulated in AML As had been seen previously at an mRNA level, on an miRNA level the LSC populations more closely resembled more mature progenitor populations than HSC and MPP populations, however the LSC populations did display an aberrant stem cell-like miRNA signature.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a model of tumor evolution in human cancer. The evolution process of CML from the chronic phase (CP) to the blastic phase (BP) is characterized by a blockade of differentiation and acquisition of uncontrolled self-renewal capacity by hematopoietic stem or progenitor cells. CML-BP is associated with the presence of other genetic abnormalities in addition to the BCR-ABL1 fusion which results from chromosomal translocation t(9;22). Unlike patients in the CP, patients with CML-BP do not achieve a long-term complete molecular response to Imatinib mesylate, an inhibitor targeting the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK). Moreover, second and third generation TK inhibitors are less effective in CML-BP when leukemic cells have acquired a therapeutic resistance independent of BCR-ABL1 mutations. The molecular mechanisms of the signaling pathways responsible for CML progression from CP to BP are poorly understood. The aim of our project is to characterize novel genetic alterations in the BP of CML. We have identified by cytogenetics, four novel chromosomal translocations: t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) and t(2;12)(q31;p13) in leukemic cells of patients with CML-BP resistant to therapy. Using fluorescence in situ hybridization, RT-PCR and sequencing techniques, we have mapped chromosomal translocation breakpoints and identified rearranged genes encoding transcription factors which are key regulators of hematopoiesis, such as RUNX1, ETV6, PRDM16 and HOXA. The disruption of these genes could explain the differentiation blockade and/or uncontrolled self-renewal associated with the CML-BP. We identified RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 and ETV6-HOXD11 fusions created by chromosomal translocations t(1;21), t(7;17), t(8;17) and t(2;12) respectively. These fusions generate different alternative transcripts that both maintain and alter the open reading frame. Sequence analysis of chimeric transcripts identified in this project, including RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 and ETV6-HOXD11, allowed us to predict potential functional domains present in putative chimeric proteins. In-frame fusion transcripts can generate functional domains from both fusion partners. For example, in two RUNX1-PRDM16 transcripts, the RUNX1 DNA binding domain RHD (Runt homology domain) is fused to the majority of PRDM16 domains. Out-of-frame fusion transcripts resulted in truncated forms of RUNX1, MSI2 and ETV6. The juxtaposition of promoter regions of these genes to the 5’ part of their partners resulted in the activation of the oncogenic short form of PRDM16 in the t(1;21) or of different HOXA/D genes in t(7;17) and t(2;12), and in the aberrant expression of a novel alternative SOX17 transcript in the t(8;17). Our study allowed us to identify novel fusion genes and/or activation of genes that potentially cooperate with BCR-ABL1 fusion in the progression of CML and contribute to treatment resistance of this disease. The characterization of genetic events related to the blastic transformation of CML is an important step in the investigation of molecular pathways involved in this stage of the disease. Understanding treatment resistance of these patients might help to identify new therapeutic targets in this leukemia.

La vigueur de la réponse immunitaire générée par les cellules dendritiques (DC) a positionné ces cellules comme médiatrices centrales dans l’activation des lymphocytes T. La vulnérabilité des cellules cancéreuses de leucémie myéloïde chronique (LMC) à l’intervention immunitaire résulte apparemment de la capacité des cellules leucémiques de se différencier en DC. Ces DC ont alors la capacité de présenter des peptides provenant des cellules souches leucémiques aux lymphocytes T. Dans ce travail, nous démontrons que la plupart des patients atteints d’une LMC présentent un déficit important en DC au niveau du sang et de la moelle osseuse avant la greffe de cellules souches allogéniques. Les faibles niveaux de DC circulantes résultent en grande partie d’une perte de la diversité au niveau des cellules progénitrices CD34+ leucémiques au niveau de la moelle osseuse. Ces cellules progénitrices CD34+ présentent d’ailleurs une capacité réduite à se différencier en DC in vitro. Nous avons trouvé qu’un décompte faible de DC avant une greffe allogénique était associé à une diminution significative de la survie et une augmentation considérable du risque de développer une des complications mortelles. Puisque la reconstitution des DC suite à la greffe est absente, notre étude appuie aussi la thèse que ce sont les cellules DC pré greffe qui sont primordiales dans l'effet du greffon contre leucémie (GVL). Dans ce contexte, notre étude suggère que le compte des DC avant la greffe allogénique pourrait servir de marqueur pronostique pour identifier les patients LMC à risque de développer certaines complications suite à une greffe allogénique. / The intensity of the immune response that is generated by the dendritic cells (DCs) has established these cells as central mediators in the activation of T lymphocytes. The vulnerability of leukemic cells present in chronic myeloid leukemia is mostly attributable to the ability of the leukemic stems cell to differentiate themselves into potent DCs. The latter are then able to present peptides which come from endogenous origin and from leukemic stem cells to the T lymphocytes. In this thesis, we demonstrate that, before allogeneic stem cell transplant, the majority of patients afflicted by CML have a considerable lack of DCs in their peripheral blood as well as in their bone marrow. The low levels of circulating DCs result to a great extent from a loss of diversity in the CD34+ leukemic progenitor cells located in the bone marrow. Moreover, these CD34+ leukemic progenitor cells display a reduced capacity to differentiate themselves into DCs in vitro. Our findings show that having a low level of DCs prior to an allogeneic transplant is associated with a significant decline in survival rates as well as with increased risks of developing life threatening complications. Since the DCs’ reconstitution following an allogeneic bone marrow transplant is missing, our study supports the thesis that pre graft DCs are essential in the Graft versus leukemia effect (GVL).Therefore, our research suggests that tallying DC before proceeding with an allogeneic transplant could act as a prognostic marker to identify LMC patients who present risks of complications after an allogeneic transplant.