Die Diagnose der Myokarditis, einer entzündlichen Herzmuskelerkrankung, stellt die behandelnden Mediziner, trotz klinischer Charakteristika gerade im Hinblick auf die Differentialdiagnosen, weiterhin vor große Herausforderungen. Der Krankheitsverlauf der betroffenen Patienten variiert zwischen asymptomatisch bis hin zum lebensbedrohlichen Krankheitsbild und kann im Verlauf zu einer chronischen Herzinsuffizienz führen, die mit einer erheblich eingeschränkten kardialen Belastbarkeit einhergehen kann. Als Goldstandard in der Diagnostik der Myokarditis wird die Endomyokardbiopsie angesehen. Aufgrund des Sampling Errors sowie der Invasivität der Untersuchung erklärt sich die Suche nach einer adäquaten nicht invasiven diagnostischen Methode. Hier konnte die kardiovaskuläre Magnetresonanztomographie (CMR), welche ein nicht invasives Schnittbildverfahren darstellt, sich als wichtigstes, nicht invasives diagnostisches Verfahren etablieren. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, die 1.5 T MRT Diagnostik sowie die 3.0 MRT Diagnostik von Patienten mit klinischer Präsentation einer Myokarditis in Bezug auf den Goldstandard der Endomyokardbiopsie zu vergleichen. Hierfür erfolgte die Einteilung der Patienten anhand ihrer Symptomdauer in eine Gruppe mit klinisch akuter Myokarditis (akute Gruppe, Gruppe 1, Symptombeginn ≤ 14 Tage) und in eine zweite Gruppe mit klinisch chronischer Myokarditis (chronische Gruppe, Gruppe 2, Symptombeginn > 14 Tage). In dieser prospektiven Studie konnte bei 129 Patienten ein 1.5 T MRT (Gruppe 1: n = 61, Gruppe 2: n = 68) sowie bei 113 Patienten ein 3.0 T MRT (Gruppe 1: n = 56; Gruppe 2: n = 57) durchgeführt werden. Bei allen Patienten wurde eine Endomyokardbiopsie durchgeführt, welche nach Möglichkeit biventrikulär erfolgte. Die histologische, immunhistologische und molekularbiologische Untersuchung erfolgte nach geltenden Standards. Im Anschluss erfolgte ein 1.5 T MRT und innerhalb maximal 72 Stunden nach der Biopsieentnahme ein 3.0 T MRT. Anhand der 1.5 T MRT und 3.0 T MRT Bilder erfolgte die Bestimmung des globalen und/oder fokalen Ödems (ER), des globalen relativen Enhancement (gRE) und des Late Enhancement (LE). Gemäß „Lake Lousie Kriterien“ (LLC) wurde die Diagnose einer Myokarditis gestellt, wenn sich mindestens 2 der 3 oben genannten Parameter positiv darstellten. Bei der Betrachtung der Ergebnisse der LLC der MRT Untersuchung der Patienten mit Verdacht auf die akute Myokarditis im Vergleich zur Endomyokardbiospie ergaben sich folgende Vergleichswerte (1.5 T MRT vs. 3.0 T MRT): Sensitivität 70 % vs. 82 %, Spezifität 63 % vs. 29 %, PPW 80 % vs. 72 % und NPW 52 % vs. 46 %. Bei Patienten mit Verdacht auf eine chronische Myokarditis ergaben sich folgende Vergleichswerte: Sensitivität 69 % vs. 80 %, Spezifität 45 % vs. 38 %, PPW 74 % vs. 76 % und NPW 39 % vs. 43 %. Bei Patienten mit klinischem Verdacht auf eine akute Myokarditis stellt die 3.0 T MRT Diagnostik im Vergleich zur 1.5 T MRT Diagnostik keine geeignete Methode zur Verbesserung der Diagnostik da. Die Ergebnisse dieser Studie geben jedoch Hinweise darauf, dass die schwierige Diagnostik einer chronischen Myokarditis durch die Verwendung der 3.0 T MRT im Vergleich zur Anwendung der 1.5 T MRT Diagnostik einen Vorteil bieten könnte. Allerdings scheint sich die Forschung eher mit der Weiterentwicklung der Mapping Techniken auseinanderzusetzen als mit dem Vergleich der unterschiedlichen Feldstärken. Verglichen mit unseren Ergebnissen scheint die Verwendung des Mappings sowie der neuen LLC der konsequente nächste Schritt zu einer verbesserten Diagnostik der Myokarditis zu sein. Viele der jüngeren Studienergebnisse zeigen, dass die klassischen LLC Kriterien als alleiniges CMR Diagnose Verfahren zunehmend an Bedeutung verlieren werden. In jüngere Zeit wurde auch ein kombinierter Ansatz aus semiquantitativer und quantitativer Methode zur Erhöhung der diagnostischen Sicherheit der Myokarditis etabliert. Weiterhin bleibt die sichere Unterscheidung zwischen entzündlicher und nicht-entzündlicher Erkrankung des Myokards eine der großen Herausforderungen in der Myokarditis Diagnostik. Zur Erhöhung der Aussagekraft empfiehlt sich die Durchführung von verblindeten, randomisierten Mulitcenter-Studien, die einheitliche Einschlusskriterien, standardisierte MRT Protokolle und einen einheitlichen Referenzwert, wie beispielsweise die EMB, beinhalten sollten.:1 Inhaltsverzeichnis 2 2 Abkürzungsverzeichnis 5 3 Einführung 7 3.1 Myokarditis 7 3.1.1 Definition und Klinik 7 3.1.2 Epidemiologie 7 3.1.3 Pathogenese 8 3.1.4 Ätiologie 11 3.1.5 Diagnostik 12 3.1.5.1 Elektrokardiographie 12 3.1.5.2 Laborparameter 13 3.1.5.3 Echokardiographie 13 3.1.5.4 Endomyokardbiospie (Herzkatheter) 14 3.1.5.5 Magnetresonanztherapie (MRT) 16 3.1.6 Therapie 19 3.1.7 Prognose 19 3.2 Zielstellung 21 4 Methoden 22 4.1 Patienten und Studienprotokoll 22 4.2 MRT Bildgebung 24 4.2.1 1.5 T und 3.0 T MRT-Scanner und Scannerprotokoll 24 4.3 Auswertung der MRT-Daten 26 4.3.1 Relativer Wassergehalt 26 4.3.2 Globales relatives Enhancement (grE) 27 4.3.3 Late Enhancement (LE) 28 4.4 Herzkatheter 28 4.4.1 Histologische, immunhistochemische und molekularbiologische Analyse 29 4.5 Statistik 30 5 Ergebnisse 31 5.1 Übersicht 31 5.2 Patientencharakteristika 33 5.2.1 Symptome 33 5.2.2 Alter und Geschlecht 34 5.2.3 Symptomdauer 34 5.2.4 Linksventrikuläre Funktion 34 5.2.5 EKG Veränderungen 34 5.2.6 Labor 35 5.2.7 Kardiovaskuläre Risikofaktoren 35 5.3 Herzkatheter Untersuchung 37 5.3.1 Mono bzw. biventrikuläre EMB 37 5.3.2 Ergebnisse der EMB 37 5.3.3 Virusnachweis 38 5.3.4 Fibrose 40 5.4 MRT Diagnostik 40 5.4.1 Ergebnis der 1.5 T MRT Untersuchung 40 5.4.1.1 MRT-Entzündungsparameter 40 5.4.1.2 Ergebnisse der 1.5 T MRT-Diagnostik bezogen auf die EMB 45 5.4.1.2.1 Gesamtkollektiv 45 5.4.1.2.2 Ergebnisse der akuten Gruppe (Symptomdauer ≤ 14 Tage) 46 5.4.1.2.3 Ergebnisse der chronischen Gruppe (Symptomdauer > 14 Tage) 47 5.4.2 Ergebnis der 3.0 T MRT-Untersuchung 48 5.4.2.1 MRT-Entzündungsparameter 48 5.4.2.2 Ergebnisse der 3.0 MRT-Diagnostik bezogen auf die EMB 52 5.4.2.2.1 Gesamtkollektiv 52 5.4.2.2.2 Ergebnisse der akuten Gruppe (Symptomdauer ≤ 14 Tage) 53 5.4.2.2.3 Ergebnisse der chronischen Gruppe (Symptomdauer > 14 Tage) 54 5.4.3 Vergleich 1.5 T MRT mit 3.0 T MRT 55 5.4.3.1 Gesamtkollektiv 55 5.4.3.2 Ergebnisse der akuten Gruppe (Symptomdauer ≤ 14 Tage) 56 5.4.3.3 Ergebnisse der chronischen Gruppe (Symptomdauer > 14 Tage) 56 6 Diskussion 57 6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 57 6.2 Studienkonzeptionen 58 6.3 MRT-Diagnostik 1,5 MRT 59 6.4 MRT-Diagnostik 3,0 T MRT 73 6.5 Mapping und neue LLC 80 6.6 Limitationen der Studie 86 6.7 Ausblick 86 7 Zusammenfassung 88 8 Abbildungsverzeichnis 91 9 Tabellenverzeichnis 93 10 Literaturverzeichnis 94 11 Anhang 105 Eigenständigkeitserklärung 108 Danksagung

In der hier vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass im menschlichen Herzen sowohl bei Gesunden als auch bei kardial Erkrankten lokale Progenitorzellen zu finden sind. Der Nachweis der lokalen Progenitorzellen gelang hier mithilfe der Ko-Expression von den Progenitorzellmarkern CD90 und CD117. Da die Identifizierung der Marker durch immunhistochemische Analyse direkt in den Myokardbiopsien stattfand, spiegeln die Ergebnisse den Nativzustand des Gewebes wider und enthalten Informationen über die unverfälschte Anzahl und Verteilung der Progenitorzellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die These, dass die Aktivierung lokaler Progenitorzellen Teil eines Reparaturmechanismus ist, welcher nach einem akuten, entzündlichen Myokardschaden in Gang gesetzt wird. Man kann nun davon auszugehen, dass in jedem Herzen lokale Progenitorzellen ruhen, welche bei Aktivierung zu einer narbenfreien Regeneration des Myokards führen könnten. Hinweisend dafür ist der Anstieg lokaler CD90+/CD117+ Progenitorzellen vor allen Dingen bei Patienten mit Myokarditis. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, welches traditionelle histologische Methoden mit einer neuartigen Technologie der digitalen Bildanalyse verbindet. Mittels eines virtuellen Mikroskops konnten aus den histologischen Präparaten so genannte „Whole Slide Images“ erzeugt werden. Unter Verwendung der digitalisierten histologischen Bilder konnten nicht nur qualitative Analysen an einzelnen Bildausschnitten vorgenommen werden, sondern auch quantitative Analysen des gesamten Schnittes in einem effizienten, automatisierten Prozess durchgeführt werden. Somit wurde mit dieser Arbeit eine neuartige Methode entwickelt, in Paraffin eingebettete humane Myokardbiopsien hinsichtlich des Vorkommens lokaler Progenitorzellen qualitativ und quantitativ auszuwerten und miteinander vergleichen zu können.:I Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………...3 II Vorbemerkungen……………………………………………………………………….4 1. Einführung in die Thematik……………………………………………………………5 1.1 Hintergrund………………………………………………………………………...5 1.2 Pluripotente Stammzellen………………………………………………………….6 1.3 Multipotente Stammzellen………………………….…...……..…………………..7 1.4 Lokale kardiale Stammzellen ……………………………………….………….….8 1.5 Das Oberflächenantigen CD117………………….………………….……………..9 1.6 Das Oberflächenantigen CD90………..…………………………………………..10 1.7 Direkter Nachweis von CD117 und CD90 in Myokardbiopsien……….……..10 1.8 Myokarditis und Kardiomyopathie………………………………………………..11 1.9 Virtuelle Mikroskopie………………………………………...…………...............12 1.10 Hypothesen, Frage- und Zielstellungen………………………………………….12 2. Publikationen……………………………………………………………………….....14 2.1 'How to mend a broken heart: adult and induced pluripotent stem cell therapy for heart repair and regeneration.'…………………………………...…………...15 2.2 “Qualitative and Quantitative Analysis of Cardiac Progenitor Cells in Cases of Myocarditis and Cardiomyopathy”……....……….…….……………………….34 3. Zusammenfassung………………………………………………………………….57 4. Literaturverzeichnis…………………………………………...………………………62 III Anhang………………………………………………………………………………..69 IV Darstellung des eigenen wissenschaftlichen Beitrags……………………………72 V Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit………………………..…73 VI Curriculum Vitae……………………………………………..……………………….74 VII Danksagung……………………………………………………………...……………77

Das Proteasom ist ein multikatalytischer, ATP-abhängiger Enzymkomplex, der kurzlebige und regulatorische Proteine in der Zelle abbaut. Im Rahmen der Proteinqualitätskontrolle werden durch das Proteasom auch fehlerhaft synthetisierte bzw. falsch gefaltete oder chemisch geschädigte Proteine degradiert. Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimieren sogenannte Immunoproteasomen, die durch drei alternative katalytische Untereinheiten (LMP2, MECL-1 und LMP7) charakterisiert sind. Unter dem Einfluss von Interferonen kommt es auch in nicht-hämatopoetischen Zellen zur de novo Assemblierung von IP. Sie weisen im Vergleich zu Standardproteasomen einen erhöhten Substratumsatz sowie veränderte Schnittpräferenzen auf. Dadurch können Standard- und Immunoproteasomen verschiedene MHC Klasse I-restringierte antigene Peptide generieren. Die vorliegende Arbeit untersucht die Relevanz der LMP2- bzw. der LMP7- Untereinheit im Rahmen der Coxsackievirus B3 Myokarditis. LMP7-/- Mäuse zeigen eine suffiziente CD8+ T Zell Antwort, die zur vollständigen Viruselimination nach der akuten Entzündungsphase beiträgt. Die reguläre Expression pro-inflammatorischer Zytokine und antiviraler Signalwege sowie CVB3-spezifischer IgG-Antikörper spricht gegen eine spezielle Funktion von IP bei der Induktion einer effektiven Immunantwort in diesem Modell. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der verminderte Einbau aller IP-Untereinheiten in LMP7-defizienten Mäusen mit einer schweren Inflammation und Myokardschädigung einhergeht. Der verringerte Substratumsatz führt zur Akkumulation von polyubiquitinylierten, oxidativ geschädigten Proteinen sowie zur verstärkten Apoptose IP-defizienter Kardiomyozyten und inflammatorischer Zellen. / The standard proteasome is the major ATP-dependent multi-catalytic protein complex that is important for the proteolytic processing of short-lived and regulatory proteins. It also degrades exogenous or improperly synthesized, misfolded, and damaged proteins. Cells of hematopoietic origin predominantly express an alternative variant - the immunoproteasome, which is characterized by three specific catalytically active subunits (LMP2, MECL-1 and LMP7). In non-immune cells, these immunosubunits are also induced and incorporated into newly assembling IPs upon exposure to interferons. As compared to standard proteasomes, IPs display altered cleavage site preferences, resulting in the generation of a different spectrum of antigenic peptides for MHC class I presentation. The present thesis investigates the impact of LMP2- and LMP7 within the context of viral heart disease, making use of the well-established murine model of coxsackievirus B3 infection. LMP7-deficient mice demonstrate a potent CD8+ T cell capacity to control CVB3 infection, resulting in viral clearance after the acute stage of disease. The expression of pro-inflammatory cytokines, innate antiviral mediators, and CVB3-specific IgG antibodies argue against a specific role of IPs in the induction of an effective immune response against CVB3 infection. However, the impaired incorporation of all three immunosubunits in LMP7-deficient hearts coincides with severe inflammation and myocardial tissue damage. Exposure to IFN-γ gives rise to prolonged accumulation of oxidant-damaged, poly-ubiquitylated proteins in IP-deficient cardiomyocytes and inflammatory cells. Along with the restricted degradation of toxic protein aggregates, inflammatory cells and the adjacent myocardium are prone to increased apoptotic cell death.

Der Großteil MHC Klasse I restringierter Epitope wird bei der Proteindegradation durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) generiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des UPS in der Antigenpräsenation in einer Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten akuten und chronischen Myokarditis untersucht. Für in vitro Degradationsexperimente mit isolierten 20S Proteasomen wurden CVB3 Polypeptide synthetisiert und die Degradationsprodukte massenspektrometrisch analysiert. Eine erhöhte Substratumsatzrate und eine Verschiebung von Schnittpräferenzen durch Immunoproteasomen oder unter dem Einfluss von PA28 führten zu einer verbesserten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente. Inflammatorische Kardiomyopathien können in Mäusen durch eine CVB3 Infektion ausgelöst werden. Resistente Stämme (C57BL/6) eliminieren das Virus vollständig, in anfälligen Mäusen (A.BY/SnJ) erfolgt keine vollständige Elimination. In Herzen gesunder Mäuse werden vorwiegend konstitutive 20S Proteasomen exprimiert. Eine myokardiale Entzündung, ausgelöst durch eine CVB3 Infektion, führte in den Herzen beider Mausstämme zu der Bildung von Immunoproteasomen, was zu einer gesteigerten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente führte. Die größte Menge immunrelevanter Fragmente wurden durch Proteasomen gebildet, die am Tag vier aus den Herzen akut erkrankender C57BL/6 Mäuse und am Tag acht aus chronisch erkrankenden A.BY/SnJ Mäusen isoliert wurden. Dies korrelierte mit der Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und einer unterschiedlichen Interferon (IFN) Typ I Kinetik. In Geweben lymphatischen Ursprungs hingegen waren Zusammensetzung und proteolytische Aktivität der Proteasomen im Verlauf der Infektion in beiden Mausstämmen unverändert. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer zeitlich optimalen IFN Sekretion an der Infektionsstelle, die zu der Anpassung des UPS an die inflammatorischen Bedingungen führt. / The recognition of viral antigens bound to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules by CD8+ T cells is crucial for virus elimination. Most MHC class I restricted antigenic peptides are produced by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). In the present study, the impact of the UPS in antigen presentation during Coxsackievirus B3 (CVB3) induced acute and chronic myocarditis has been investigated. To examine whether the proteasome is involved in the generation of MHC class I ligands derived from the CVB3 polyprotein, polypeptides were synthesized for in vitro processing by 20S proteasomes. Mass spectrometry analysis demonstrated an enhanced generation of immunorelevant CVB3 fragments due to an increased substrate degradation rate and altered cleavage site preferences by immunoproteasomes or in the presence of PA28. Murine models of CVB3 induced myocarditis mimic human disease pattern with diverse outcomes. Permissive mice (A.BY/SnJ) develop chronic myocarditis with cardiac CVB3 persistence whereas resistant mice (C57BL/6) recover and eliminate the virus after acute infection. Constitutive 20S proteasomes are mainly expressed in hearts of healthy mice. Myocardial inflammation, caused by a CVB3 infection, resulted in immunoproteasome formation in hearts of both, resistant C57BL/6 and susceptible A.BY/SnJ mice, and was correlated with enhanced generation of immunorelevant CVB3 peptides. In concurrence with distinctive type I interferon kinetics, immunoproteasome formation and improved epitope generation peaked on day 4 post infection in resistant mice, and was delayed in susceptible mice. No alterations were observed in assembly and proteolytic activity of 20S proteasomes in lymphatic tissues during CVB3 infection, independent from mouse strain. The results emphasise the impact of a rapid adjustment of the UPS to viral infection due to early secretion of type I interferon at site of infection.

Der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR) ist ein Typ I Transmembran-protein, das an der Adsorption von Viren und der Aufrechterhaltung von Zell-Zellkontakten beteiligt ist. Coxsackievirus B3 (CVB3) Infektionen sind eine häufige Ursache für akute Myokarditis, die bei Patienten häufig zu chronischer Kardiomyopathie bis zur Herzinsuffizienz führen können. CAR ist für die Aufnahme von Viren in unterschiedliche Zelltypen verantwortlich und damit ein potentielles Ziel bei der Therapie und Prävention von CVB3-Infektionen. Der komplette Knockout von CAR ist embryonal letal. Die betroffenen Embryonen zeigten Missbildungen des Herzens. Weiterhin konnte eine reduzierte Expression von Connexinen im Knockout beobachtet werden – ein mögliches Zeichen gestörter interzellulärer Kommunikation. In konditionellen CAR Knockout Tieren führte die Infektion mit CVB3 im Gegensatz zu CVB3-infizierten Wildtyp Kontrolltieren zu keinen pathologischen Veränderungen oder eine Erhöhung von Entzündungsmarkern. Die kontraktile Funktion des CVB3-infizierten Knockout Herzen war erhalten. Um mögliche unerwünschte Konsequenzen aus dem Verlust von CAR zu untersuchen, wurde eine umfassende kardiale Phänotypisierung durchgeführt, die AV-block im Knockout-Herzen zeigte. Der zugrunde liegende Mechanismus betrifft die Interaktion von Tight- und Gap-Junctions mit veränderter Expression und Lokalisierung von Connexinen, sowie die interzelluläre Kommunikation zwischen CAR-Knockout Kardiomyzeten. CAR ist essentiell für eine normale Embryonalentwicklung und kardiale Funktion. Das CAR-Knockout-Modell bietet einerseits den ersten genetischen Hinweis für eine Rolle von CAR als Virusrezeptor in vivo und belegt andererseits die Relevanz von direkter Virus-vermittelter Symptomatik gegenüber einer sekundären autoimmun- Komponente in CVB3-induzierten Herzerkrankungen. Damit ist CAR ein potentielles therapeutisches Target in der Prävention und Behandlung von viraler Myokarditis. / The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is a type I transmembrane protein involved in virus uptake and the maintenance of cell-cell contacts. Coxsackievirus B3 (CVB3) infections are frequent causes of human acute myocarditis, often resulting in chronic cardiomyopathy that may progress into terminal heart failure. The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is involved in virus uptake into various cell types and has therefore been suggested as a therapeutic target to prevent or treat CVB3 induced diseases. The complete CAR-knockout was embryonic lethal at midgestation with cardiac malformation. Connexin expression was decreased in the knockout, suggesting an abnormal cell-cell communication secondary to the loss of CAR. The role of CAR in murine viral myocarditis was investigated using the inducible CAR-knockout infected with CVB3. Unlike control animals exposed to CVB3, the cardiac inducible knockout mice did not exhibit structural changes such following CVB3 infection, or increased production of markers of inflammation, and severe contractile dysfunction. To evaluate possible adverse effects that might result from CAR deficiency, we implemented a detailed cardiac phenotyping protocol and found that CAR deficient animals developed AV nodal block. The underlying mechanism relates to the crosstalk of tight and gap junctions with altered expression and localization of connexins that affect the communication between CAR knockout cardiomyocytes. Thus, CAR is essential for embryonic development and normal cardiac function. The CAR-knockout does not only provide the first genetic evidence to establish CAR as the CVB3 receptor in vivo, but furthermore demonstrates the relevance of direct virus-mediated pathology versus a secondary autoimmune component in CVB3 induced heart disease. Our data suggest that CAR is a suitable target to help prevent and treat viral myocarditis.