BENEVIDES, Raquel Guimarães. Caracterização bioquímica e estrutural de uma lectina recombinante de sementes de Platypodium elegans Vogel. 2011. 281 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T13:36:10Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_rgbenevides.pdf: 11384028 bytes, checksum: c53d0f90cf10f6c4617f71ad7c4468d9 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T15:27:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_rgbenevides.pdf: 11384028 bytes, checksum: c53d0f90cf10f6c4617f71ad7c4468d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T15:27:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_rgbenevides.pdf: 11384028 bytes, checksum: c53d0f90cf10f6c4617f71ad7c4468d9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lectinas vegetais são excelentes modelos para se estudar as bases moleculares do reconhecimento proteína-açúcar.Uma atividade lectínica com especificidade para manose e glicose foi detectada em sementes de Platypodium elegans, uma leguminosa da subtribo Dalbergiae. O gene da lectina PELa foi clonado, resultante em uma proteína de 261 resíduos de aminoácidos pertencente à família de lectinas de leguminosas, com similaridade com a lectina de Pterocarpus angolensis (PAL). A lectina recombinante foi expressa em células de E. coli e refoldada à partir de corpos de inclusão. Uma análise da especificidade por Glycan array evidenciou uma preferência bastante não-usual para N-glicanos do tipo complexos com ramificações assimétricas. Um braço curto consistindo em um resíduo de manose é preferido no braço 1-6 do N-glicano, enquanto uma extensão por GlcNAc, Gal e NeuAc são favoráveis no braço 1-3. Valores de afinidade foram obtidos por microcalorimetria usando heptassacarídeos simétricos e assimétricos ligados a Asn preparados por método semi-enzimático. Uma alta afinidade de 5 µM foi obtida para ambos os ligantes. Duas estruturas cristalinas de PELa, uma em complexo com um trimanose ramificado e outra com um heptassacarídeo complexo simétrico ligado a Asn foram resolvidas a resoluções de 2,1 e 1,65 Å, respectivamente. A lectina mostrou adotar uma organização dimérica canônica típica de lectinas de leguminsas. O trimanose faz uma ponte entre os sítios de ligação a carboidrato de dímeros vizinhos, resultando na formação de cadeias infinitas no cristal. O heptassacarídeo liga-se com o braço 1-6 no sítio primário de ligação e com contatos extensivos adicionais em ambos os braços. O GlcNAc do braço 1-3 está ligado em uma conformação restrita que pode justificar a alta afinidade que é observada em chips para oligossacarídeos com braço 1-3 curto que não apresentam esse monossacarídeos. / Lectin activity with specificity for mannose and glucose has been detected in the seed of Platypodium elegans, a legume from the Dalbergiae tribe. The gene of the lectin PELa has been cloned and the resulting 261 amino acid protein belongs to the legume lectin family with similarity with Pterocarpus angolensis agglutinin (PAL) from the same tribe. The recombinant lectin has been expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. Analysis of specificity by Glycan Array evidenced a very unusual preference for complex type N-glycans with asymmetrical branches. A short branch consisting of one mannose residue is preferred on the 6- arm of the N-glycan, while extension by GlcNAc, Gal and NeuAc are favorabl e on the 3-arm. Affinities have been obtained by microcalorimetry using symmetrical and asymmetrical Asn- linked heptasaccharide prepared by semi-enzymatic method. Strong affinity of 5 μM was obtained for both ligands. Crystal structures of PELa complexed with branched trimannose and symmetrical complex type Asn-linked heptasaccharide have been solved at 2.1 and 1.65 Å resolution respectively. The lectin adopts the canonical dimeric organization of legume lectins. The trimannose bridges the binding sites of two neighbouring dimers, resulting in the formation of infinite chains in the crystal. The Asn-linked heptasaccharide binds with the 6-arm in the primary binding site and extensive additional contacts on both arms. The GlcNAc on the 3 -arm is bound in a constrained conformation that may rationalize the higher affinity that is observed on chips for oligosaccharide with shorter 3-arm that do not present this monosaccharide.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectin activity with specificity for mannose and glucose has been detected in the seed of Platypodium elegans, a legume from the Dalbergiae tribe. The gene of the lectin PELa has been cloned and the resulting 261 amino acid protein belongs to the legume lectin family with similarity with Pterocarpus angolensis agglutinin (PAL) from the same tribe. The recombinant lectin has been expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. Analysis of specificity by Glycan Array evidenced a very unusual preference for complex type N-glycans with asymmetrical branches. A short branch consisting of one mannose residue is preferred on the 6- arm of the N-glycan, while extension by GlcNAc, Gal and NeuAc are favorabl e on the 3-arm. Affinities have been obtained by microcalorimetry using symmetrical and asymmetrical Asn- linked heptasaccharide prepared by semi-enzymatic method. Strong affinity of 5 μM was obtained for both ligands. Crystal structures of PELa complexed with branched trimannose and symmetrical complex type Asn-linked heptasaccharide have been solved at 2.1 and 1.65 à resolution respectively. The lectin adopts the canonical dimeric organization of legume lectins. The trimannose bridges the binding sites of two neighbouring dimers, resulting in the formation of infinite chains in the crystal. The Asn-linked heptasaccharide binds with the 6-arm in the primary binding site and extensive additional contacts on both arms. The GlcNAc on the 3 -arm is bound in a constrained conformation that may rationalize the higher affinity that is observed on chips for oligosaccharide with shorter 3-arm that do not present this monosaccharide. / Lectinas vegetais sÃo excelentes modelos para se estudar as bases moleculares do reconhecimento proteÃna-aÃÃcar.Uma atividade lectÃnica com especificidade para manose e glicose foi detectada em sementes de Platypodium elegans, uma leguminosa da subtribo Dalbergiae. O gene da lectina PELa foi clonado, resultante em uma proteÃna de 261 resÃduos de aminoÃcidos pertencente à famÃlia de lectinas de leguminosas, com similaridade com a lectina de Pterocarpus angolensis (PAL). A lectina recombinante foi expressa em cÃlulas de E. coli e refoldada à partir de corpos de inclusÃo. Uma anÃlise da especificidade por Glycan array evidenciou uma preferÃncia bastante nÃo-usual para N-glicanos do tipo complexos com ramificaÃÃes assimÃtricas. Um braÃo curto consistindo em um resÃduo de manose à preferido no braÃo 1-6 do N-glicano, enquanto uma extensÃo por GlcNAc, Gal e NeuAc sÃo favorÃveis no braÃo 1-3. Valores de afinidade foram obtidos por microcalorimetria usando heptassacarÃdeos simÃtricos e assimÃtricos ligados a Asn preparados por mÃtodo semi-enzimÃtico. Uma alta afinidade de 5 ÂM foi obtida para ambos os ligantes. Duas estruturas cristalinas de PELa, uma em complexo com um trimanose ramificado e outra com um heptassacarÃdeo complexo simÃtrico ligado a Asn foram resolvidas a resoluÃÃes de 2,1 e 1,65 Ã, respectivamente. A lectina mostrou adotar uma organizaÃÃo dimÃrica canÃnica tÃpica de lectinas de leguminsas. O trimanose faz uma ponte entre os sÃtios de ligaÃÃo a carboidrato de dÃmeros vizinhos, resultando na formaÃÃo de cadeias infinitas no cristal. O heptassacarÃdeo liga-se com o braÃo 1-6 no sÃtio primÃrio de ligaÃÃo e com contatos extensivos adicionais em ambos os braÃos. O GlcNAc do braÃo 1-3 està ligado em uma conformaÃÃo restrita que pode justificar a alta afinidade que à observada em chips para oligossacarÃdeos com braÃo 1-3 curto que nÃo apresentam esse monossacarÃdeos.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os genes sintÃticos das lectinas das algas marinhas vermelhas Hypnea musciformis (HML) e Bryothamnion triquetrum (BTL) foram clonados em diferentes vetores e transformados em diferentes cÃlulas bacterianas de expressÃo. As lectinas recombinantes foram obtidas a partir da fraÃÃo solÃvel das culturas bacterianas de Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) para rHML e BL21 (DE3) para rBTL. Os testes de hemaglutinaÃÃo mostraram que rHML e rBTL sÃo capazes de aglutinar eritrÃcitos de coelho tratados com diferentes enzimas proteolÃticas. As propriedades hemaglutinantes de rHML e de rBTL confirmam o enovelamento correto e o estado funcional das proteÃnas. A caracterizaÃÃo da especificidade de ligaÃÃo a carboidratos da HML, BTL e da rBTL por glycan array mostrou uma especificidade restrita por oligossacarÃdeos complexos contendo o nÃcleo de fucosilaÃÃo (α1-6), com uma preferÃncia particular por N-glicanos nÃo bisectados, bi e tri-antenados de cadeia curta. A presenÃa de Ãcido siÃlico na extreminada nÃo-redutora dos glicanos favorece o reconhecimento. Essa foi a primeira caracterizaÃÃo de lectinas de algas vermelhas por glycan array. Experimentos de STD-RMN com a BTL mostraram uma interaÃÃo com um octassacarÃdeo contendo o nÃcleo de fucosilaÃÃo (α1-6). A atividade tÃxica das lectinas selvagens e recombinantes foi avaliada contra Artemia sp. e contra cÃlulas de adenocarcinoma de pulmÃo (A549). Nos ensaios de citotoxicidade, HML, rHML, BTL e rBTL nÃo mostraram nenhuma toxicidade contra Artemia sp. e somente HML e rHML mostraram uma baixa toxicidade contra cÃlulas de adenocarcinoma de pulmÃo (A549). O primeiro cristal de rBTL foi obtido a um nÃvel de microescala com a ajuda de um robÃt de cristalizaÃÃo e difratou a 15 Ã de resoluÃÃo. / Synthetic genes from the red marine algae Hypnea musciformis (HML) and Bryothamnion triquetrum (rBTL) were cloned into differents vectors and transformed into several bacterial expression strains. The recombinant lectins were obtained from the soluble fraction of bacterial cultures using Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) strain for rHML and E. coli BL21 (DE3) strain for rBTL. Haemagglutination tests showed that rHML and rBTL are able to agglutinate rabbit erythrocytes with strong haemagglutination activity only after treatment with papain and trysine indicating that their ligands are not directly accessible at the cell surface. The haemagglutinating properties of rHML and rBTL confirm the correct folding and functional state of the proteins. A study of the specificity of these lectins by glycan array was conducted. HML, BTL and rBTL showed a restricted specificity for complex N-glycans with core (α1-6) fucose. A more detailed analysis of the specificity of these lectins showed a preference for non bisecting N-glycans, bi- and tri-antennary branching sugars with short chains. Addition of Sialic acid at the non-reducing end of N-glycans favors their recognition by the lectins. This is the first characterization of lectins from red algae by glycan array. An interaction between BTL and a core (α1-6) fucosylated octasaccharides was also observed by STD-NMR. The toxic activity of wild and recombinant lectins were evaluated against Artemia sp. and the human lung adenocarcinoma cell line (A549). In cytotoxicity assays, HML, rHML, BTL and rBTL showed no toxicity against Artemia sp. Only HML and rHML showed a low cytotoxic activity against cell line (A549). The first crystal of rBTL was obtained in micro-scale level using a robot and diffracted at 15 Ã.