Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-28T13:45:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 1182586 bytes, checksum: e4dbe84cb873193781b886c6f32cfe7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-28T13:45:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 1182586 bytes, checksum: e4dbe84cb873193781b886c6f32cfe7e (MD5) Previous issue date: 2001-12-12 / Ovelhas deslanadas em diferentes estágios reprodutivos foram inoculadas com taquizoítos de N. caninum amostra “NC-beef” com o intuito de estudar a patofisiologia da doença nestes animais e verificar a possibilidade de serem usadas como um modelo experimental de neosporose bovina. Utilizaram -se cinco ovelhas gestantes (uma com 15 dias, duas com 30 dias, duas com 90 dias), três não gestantes e duas com 10 dias após o parto. Os animais eram sorologicamente negativos para N.caninum e T. gondii. Duas ovelhas gestantes, não inoculadas, foram utilizadas como controle negativo. Todas as ovelhas inoculadas apresentaram anticorpos contra o parasita a partir da quarta semana pós- inoculação. Igualmente, todos os cordeiros nascidos de ovelhas inoculadas apresentaram anticorpos anti-N. caninum. Nenhuma das ovelhas gestantes apresentou aborto, porém, nas inoculadas com 30 dias de gestação, constatou-se reabsorção fetal. A ovelha inoculada com 15 dias teve um cordeiro aparentemente normal e aquelas inoculadas com 90 dias de gestação tiveram o nascimento a termo de um cordeiro morto e outro fraco com dificuldade de se locomover. Os cordeiros necropsiados, nascidos de ovelhas inoculadas antes ou durante a gestação, apresentaram alterações histopatológicas em diferentes tecidos, sendo as mais severas observadas no sistema nervoso central, caracterizadas pela presença de formas císticas do parasita, associadas com infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear, áreas de necrose e em alguns casos presença de calcificação. Os cordeiros nascidos de ovelhas inoculadas 10 dias após o parto não apresentaram sinais clínicos da doença nem anticorpos contra o parasita. O cordeiro necropsiado não apresentou lesões em nenhum dos tecidos analisados. Um cordeiro nascido de ovelha não inoculada, não apresentou alterações microscópicas em nenhum dos tecidos analisados. Pelas lesões observadas nos cordeiros nascidos de animais inoculados pode-se concluir que ovelhas deslanadas podem ser usadas como modelo experimental de neosporose bovina. / Sheep out of wool, in different reproductive stages, were inoculated with N. caninum tachizoites strain “NC-beef” with the purpose of study the pathophysiology of the disease and the possibility of using them as an experimental model of bovine neosporosis. Inoculation by intravenous route was used. Five pregnant sheep (one with 15 days, two with 30 days, two with 90 days), three not pregnant and two with 10 days post partum were inoculated. By serology, the animals were negative for N.caninum and T. gondii. Two pregnant sheep, not inoculated, were used as negative controls. Fourth weeks after the inoculation, all animals showed antibodies (IgG) against the parasite and so did their lambs. Abortion wasn’t observed in sheep inoculated during pregnancy. In the animals inoculated with 30 days of gestation, was verified fetal reabsorption. A clinical normal lamb born from 15 days of gestation inoculated sheep and two weak lambs from those inoculated with 90 days of gestation. All lambs born from sheep inoculated before or during the gestation showed hystopathologic alterations in different tissues. The most severe were observed in the central nervous system. Inflammatory nonsuppurative processes with or without dystrophic mineralization were the most common lesions. Presence of tissue cysts was also observed. Clinical signs of the disease or antibodies against the parasite in the lambs born from sheep inoculated 10 days post partum weren’t observed. In the necropsy of one lamb belonging to this group no pathologic sign was observed. None of the animals of the control group showed hystopathologic alterations. After analyzing the lesions found, we can conclude that sheep out of wool can be used as an experimental model of bovine neosporosis.

The neosporosis is a disease of great economic importance, is distributed worldwide and is considered today one of the major causes of abortion and neonatal deaths in cattle. The pathogenesis of Neospora caninum infection is not fully understood and some issues in this regard are important in determining the most efficient measures of control and prophylaxis of a flock. The exclusive use of animals in these studies are expensive and time consuming so, some species of animals, such as, the rodents, can be used to make it possible. The gerbils (Meriones unguiculatus) mimic infection in cattle and are considered highly sensitive to replication of the protozoan. This study evaluated the responses of these animal models, at different moments of infection, especially in the amount and severity of acute and chronic/persistent infections by N. caninum. In addition, the research sheds light the tissues preferred location/replication the protozoan in these rodent at different conditions depending on disease progresses. The results are presented in two articles. In chapter one, the aim was to characterize the acute infection by the protozoan for to determine the major tissue sites of replication in experimental models of M. unguiculatus. Thus we have demonstrated that, initially the protozoan made a replication, but there is a distribution in virtually all tissues of the host. In addition, we observed that without an effective action of the immune system to combat agent, the infection progresses to death of animals with characteristic signs rapidity detected between 3 and 5 days after initiation of infection. The second chapter, sought to establish in rodents (M. unguiculatus) chronically infected, which places the N. caninum prefers to develops chronic evolutive form bradyzoites that are characteristic of a phase of persistent disease, especially in regions of the CNS. Furthermore, we note that the dose inoculated interfere significantly in the induction of acute and chronic infection and this is reflected in the amount of detection of nucleic acids in different tissues, above all in the CNS. In this context, it was observed that the emergence of clinical signs was milder without the induction of severe and lethal infections in most chronically infected animals. Thus, through this study we can conclude that highly sensitive techniques are necessary to detect nucleic acids from N. caninum, especially in the CNS tissues in animals chronically infected. / A neosporose é uma enfermidade de grande importância econômica, encontra-se distribuída em todo o mundo e pode ser considerada atualmente, umas das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos. A patogenia da infecção pelo Neospora caninum não está totalmente esclarecida e algumas questões a este respeito são importantes para determinar medidas mais eficientes de controle e profilaxia de um rebanho. A utilização exclusiva de bovinos nestes estudos é dispendiosa e demorada, com isso, algumas espécies de animais, como os roedores, podem ser utilizadas para torna-la possível. Os gerbils (Meriones unguiculatus) mimetizam a infecção em bovinos e são considerados altamente sensíveis a replicação do protozoário. Neste estudo foram avaliados as respostas destes modelos animais, em momentos de infecção diferentes, principalmente em relação a quantidade e severidade da infecção aguda e crônica/persistente pelo N. caninum. Além disso, a pesquisa esclarece os tecidos preferenciais de localização/replicação do protozoário nestes roedores em diferentes condições conforme a evolução da doença. Os resultados estão apresentados em dois artigos. No capítulo um, o objetivo foi caracterizar a infecção aguda pelo protozoário, a fim de determinar os principais sítios teciduais de replicação em modelos experimentais de M. unguiculatus. Desta forma conseguimos demonstrar que, inicialmente o protozoário fez uma replicação, mas que há uma distribuição em praticamente todos os tecidos do hospedeiro. Além disso, foi possível observar que sem uma atuação efetiva do sistema imune no combate ao agente, esta infecção evolui para a morte dos animais com sinais característicos rapidamente detectados, entre 3 a 5 dias após o inicio da infecção. Já o segundo capítulo, buscou estabelecer em roedores (M. unguiculatus) cronicamente infectados, quais os locais onde preferencialmente o N. caninum desenvolve a sua forma evolutiva crônica de bradizoitos que são características de uma etapa persistente da doença, principalmente em regiões do SNC. Além disso, observamos que a dose inoculada interfere significativamente na indução de infecção aguda e crônica e isso se reflete na quantidade de detecção de acidos nucléicos nos diferentes tecidos, sobretudo no SNC. Neste contexto, foi possível observar que o aparecimento de sinais clínicos foram mais brandos sem a indução de infecções letais e severas na maioria dos animais cronicamente infectados. Assim, através desse estudo podemos concluir que são necessárias técnicas altamente sensíveis para detectar ácidos nucléicos do N. caninum, especialmente em tecidos do SNC em animais infectados crônicamente.

O protozoário Neospora caninum é considerado um dos principais causadores de abortos infecciosos na pecuária de corte e de leite no mundo. No Brasil, a presença do parasita varia de acordo com a região do país e com o tipo de rebanho, com perdas maiores na agroindústria do leite que ultrapassam US$ 50 milhões ao ano. A neosporose possui como principal manifestação clínica as perdas fetais ou abortamentos em bovinos, além de comprometimento neuronal esporádico em cães. Apesar da sua importância, a neosporose não possui atualmente tratamento eficaz e as opções de controle envolvem basicamente medidas de prevenção. As vacinas ainda são uma alternativa de desenvolvimento exploradas, sobretudo aquelas que utilizam antígenos recombinantes. Uma dificuldade ao se produzir proteínas recombinantes em sistemas de expressão heterólogos é a formação de corpúsculos de inclusão que são agregados de proteínas insolúveis. Estes agregados devem ser submetidos a processos dispendiosos para tornarem-se ativos, resultando num baixo rendimento da proteína final. Diversos recursos são utilizados para obtenção de proteínas solúveis, desde o emprego de diferentes técnicas de purificação, solubilização até o uso de tags de afinidade. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu e patenteou o vetor pET28/NcMIC2-like1/1081 que possui uma tag rica em ácido glutâmico acoplada, conhecida como Nc1081. Esta tag foi capaz de estimular a solubilidade da proteína micronêmica tipo 2 de N. caninum (NcMIC2-like1) fazendo com que a proteína recombinante (rNcMIC2-like1/1081) fosse expressa na forma solúvel. O presente trabalho procurou dar continuidade ao estudo com a rNcMIC2-like1/1080 e com a tag através da clonagem e expressão de uma outra proteína relacionada à invasão do parasita conhecida como proteína associada à adenil ciclase (NcCAP). A sequência codificadora da proteína foi clonada no vetor contendo a tag Nc1081, a proteína recombinante (rNcCAP/1081) foi expressa com um peso de 38 kDa na forma solúvel em tampão não desnaturante Tris-Cl. No teste de ELISA, as proteínas rNcMIC2-like1 e a rNcCAP acopladas ou não a tag foram detectadas com intensidade semelhante pelos respectivos soros policlonais anti-rNcMIC2-like1 e anti-rNcCAP, demonstrando que a presença da tag não influenciou no reconhecimento das proteínas. As proteínas recombinantes solúveis rNcMIC2-like1/1081 e rNcCAP/1081 ainda foram testadas através de ensaios in vitro de invasão e adesão. No ensaio de invasão, a forma solúvel de NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) na concentração de 5 ?g/mL, aumentou a invasão das células VERO pelo parasita, enquanto sua forma insolúvel (rNcMIC2-like1) diminuiu a invasão. Já no teste de adesão (binding), foi possível identificar que a rNcMIC2-like1/1081 aderiu à proteína serina treonina fosfatase 2C, ao fator de alongamento alfa 1 e a proteína hipotética identificada ii como NCLIV_029860, enquanto a rNcCAP/1081 aderiu à proteína hipotética NCLIV_041330. O presente trabalho permitiu o início de estudos das propriedades funcionais das proteínas NcMIC2-like1 e NcCAP que seriam inviáveis com suas formas recombinantes insolúveis, demonstrando a aplicabilidade do vetor com a tag 1081. / Neospora caninum parasite is considered as a major cause of infectious abortion in beef and milk cattle in the world. In Brazil, the presence of the parasite varies in dairy or beef herd and according to the region with greater losses in dairy industry that exceed $ 50 million per year. Neosporosis has as main clinical manifestation fetal losses or abortion in cattle, in addition to sporadic neuronal impairment in dogs. Despite its importance, neosporosis has currently no effective treatment and control options rely primarily on preventive measures. Vaccines still represent an alternative explored by the veterinary industry, especially those employing recombinant antigens. The difficulties regarding production of recombinant proteins in heterologous expression systems are formation of inclusion bodies, which are insoluble protein aggregates. These aggregates have to undergo costly procedures to become active, resulting in low yield of final protein. Many techniques are used to obtain soluble proteins ranging from different purification or solubilizing techniques to the use of affinity tags. Our research group has developed and patented a vector pET28/NcMIC2-like1/1081 that has a rich glutamic acid tag attached, known as Nc1081. This tag is capable of stimulating the solubility of the recombinant micronemic protein type 2 like 1 of N. caninum (rNcMIC2-like1), expressingsoluble rNcMIC2-like1/1081. This study aimed to continue the study with rNcMIC2-like1/1080 and the tag by cloning and expressing another protein related to parasite invasion known as cyclase-associated protein (NcCAP). The protein coding sequence was cloned into the vector containing the Nc1081 tag, recombinant protein (rNcCAP/1081) was expressed with a molecular weight of 38 kDa in soluble form in non-denaturing Tris-Cl. In the ELISA test, rNcMIC2- like1 protein and rNcCAP coupled or not with the tag were detected with similar intensities by the respective polyclonal anti-sera rNcMIC2-like1 and antirNcCAP, demonstrating that the tag did not decrease the recognition of the proteins. Soluble recombinant proteins rNcMIC2-like1/1081 and rNcCAP/1081 were also tested in vitro in invasion and binding tests. In the invasion assay, a soluble form of NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) at a concentration of 5 ?g/mL increased the VERO cell invasion by the parasite, while its insoluble form (rNcMIC2-like1) decreased invasion. In the binding test, the rNcMIC2-like1/1081 bound to protein serine threonine phosphatase 2C, the elongation factor 1 alpha and the hypothetical protein identified as NCLIV_029860, while rNcCAP/1081 bound to the hypothetical protein NCLIV_041330. The current work allowed the initial functional studies of the NcMIC2-like1 and NcCAP proteins, otherwise unfeasible with their insoluble recombinant forms, demonstrating the applicability of the vector with the tag 1081.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Marcelo Sales Guimaraes.pdf: 3899079 bytes, checksum: 38f856923d6a5606a0da0a5054c4e8f9 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / Bovine neosporosis is a parasitic disease of cosmopolitan distribution, caused by the obligatory intracellular cyst forming protozoan Neospora caninum (Phylum Apicomplexa, family Sarcocystidae). It has a strong association with bovine abortion, being N. caninum protozoan considered the most important for this species. The main route of transmission is vertical, determining the endemic-type neosporosis in cattle. Brazilian local breeds as Curraleiro and Pantaneiro present hardiness and resistance to adverse conditions, e.g. poor nutrition and microbiological challenges, as predominant characteristics. The conservation program of such breeds has encouraged studies aiming at a greater knowledge of these animals peculiarities. The purpose of this study was to assess the seroprevalence of these breeds for N. caninum and the occurrence of vertical transmission in herds, evaluating the importance of bovine neosporosis for these herds. Five farms in the state of Goiás and one in the state of Mato Grosso do Sul, with Curraleiro and Pantaneiro herds, respectively, were observed. Blood was collected from females at reproductive age and their offspring before colostrum intake, if possible. If it was not possible, blood was periodically collected from the offspring (five collections) until about ten months of age. A total of 358 animals was examined, 249 (198 females and 51 calves) Curraleiros and 109 (62 females and 47 calves) Pantaneiros. Seropositivity to N. caninum was evaluated by using the indirect immunofluorescence (cutoff ≥ 1:200) and ELISA (HerdChek® IDEXX Laboratories) (cutoff S/P ≥ 0.50). The total incidence of seropositives was 47,49% (170/358), 51% (127/249) Curraleiro and 39,45% (43/109) Pantaneiro. One hundred percent of the farms observed presented seropositive animals. The highest titer was 1:25600. The overall vertical transmission rate observed in herds was 51% (95%, CI 37%-64%), being 48% (95%, CI 30%-66%) in Curraleiro and 54% (95%, CI 35%-73%) in Pantaneiro. There was no statistically significant association between breed or titer of the cows and the occurrence of vertical transmission (OR 0,79; CI 0,27-2,34 95%). A low-moderate agreement was found between the two diagnostic techniques used (κ = 0.34). Thus, N. caninum is present in Curraleiro and Pantaneiro cattle breeds, with significant rates of seropositivity and vertical transmission. Although widely distributed, N. caninum does not seem to cause problems in Curraleiro and Pantaneiro herds, as abortion problems are rare and females have good fertility, within the constraints of the breed. / A neosporose bovina é uma enfermidade parasitária causada pelo protozoário intracelular obrigatório Neospora caninum (filo Apicomplexa, família Sarcocystidae), formador de cistos. Enfermidade de distribuição cosmopolita, a neosporose apresenta forte associação com o abortamento bovino, sendo N. caninum considerado o protozoário mais importante para essa espécie. A principal rota de transmissão é a vertical determinando a neosporose do tipo endêmica nos rebanhos. Raças locais brasileiras como o gado Curraleiro e Pantaneiro apresentam como características preponderantes a rusticidade e resistência às condições adversas tais como carência nutricional e desafios microbiológicos. O programa de conservação destas raças incentivou estudos que visam o maior conhecimento das particularidades destes animais. A proposta deste trabalho foi avaliar a soropositividade destas raças para N. caninum e a ocorrência de transmissão vertical nos rebanhos, permitindo determinar a importância da neosporose bovina nestes rebanhos. Cinco propriedades criadoras de Curraleiro (estado de Goiás) e uma criadora de Pantaneiro (estado de Mato Grosso do Sul) foram acompanhadas. Foi colhido sangue das fêmeas em idade reprodutiva e de suas crias antes da ingestão do colostro, quando possível. Quando não, foi colhido sangue das crias periodicamente (cinco colheitas) até em torno dos dez meses de idade. Um total de 358 animais foi analisado, sendo 249 (198 fêmeas e 51 bezerros) Curraleiros e 109 (62 fêmeas e 47 bezerros) Pantaneiros. Avaliou-se a soropositividade para N. caninum por meio das técnicas de imunofluorescência indireta (ponto de corte ≥ 1:200) e ELISA indireto (HerdChek® IDEXX Laboratories) (ponto de corte S/P ≥ 0,50). A ocorrência total de soropositivos foi 47,49% (170/358), com 51% (127/249) do gado Curraleiro e 39,45% (43/109) do gado Pantaneiro soropositivo. Cem por cento das propriedades acompanhadas apresentaram animais positivos. O maior título encontrado foi de 1:25600. A taxa de transmissão vertical geral observada nos rebanhos foi de 51% (95%, IC 37%-64%), sendo de 48% (95%, IC 30%-66%) no gado Curraleiro e de 54% (95%, IC 35%-73%) no Pantaneiro. Não houve associação estatisticamente significativa entre título ou raça das mães e ocorrência de transmissão vertical (OR 0,79; IC 0,27-2,34 95%). Uma concordância moderada-baixa foi verificada entre as duas técnicas de diagnóstico utilizadas (κ = 0,34). Assim, N. caninum está presente nos rebanhos bovinos das raças Curraleiro e Pantaneiro, com consideráveis taxas de soropositividade e transmissão vertical. Embora amplamente distribuído, N. caninum parece não representar problema nos rebanhos Curraleiro e Pantaneiro, visto que problemas de abortamento são raros e as fêmeas apresentam boa fertilidade, dentro das limitações das raças.