Der Abbau der PBS unter Stickstoffmangel ist in Cyanobakterien ein ubiquitärer Mechanismus. Essenziell für den Abbau ist das Protein NblA. Das in Nostoc sp. PCC 7120 gut untersuchte ~7 kDa große Protein interagiert als Homodimer mit den PBS und dem Chaperon ClpC. Soweit bekannt kodieren alle Cyanobakterien ein essenzielles NblA-Protein. Der Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803, dagegen kodiert mit NblA1 und NblA2 sogar zwei für den PBS-Abbau entscheidende Proteine. In dieser Arbeit konnte erstmalig durch in vitro und in vivo Interaktionsstudien mithilfe von pull down-Versuchen und FRET gezeigt werden, dass NblA1 und NblA2 als biologisch aktive Form ein Heterodimer bilden. In vitro-pulldown-Versuche zeigten für Synechocystis eine Interaktion des Heterodimers mit den PBS und ClpC. Durch die Ausbildung dieses ternären Komplexes markiert NblA1/NblA2 die PBS für den Abbau durch eine Clp-Protease mit ClpC als Chaperonpartner. In Photobionten gibt es eine Reihe von clp-Genen, so besitzen Cyanobakterien vier proteolytische clp Untereinheiten. Aus diesen bilden sich gemischte Heptamere aus je zwei Clp-Untereinheiten. Zwei lösliche, im Cytoplasma vorkommende Proteasen wurden bis jetzt zweifelsfrei identifiziert, eine dritte, an der Thylakoidmembran assoziierte Protease wird außerdem vermutet. Diese putative Protease, vermutlich aus dem Chaperon ClpC und den proteolytischen Untereinheiten ClpP1 und ClpR aufgebaut, wurde heterolog exprimiert. Mittels Koreinigung konnte ein funktioneller proteolytischer Kern gereinigt werden, der zusammen mit dem Chaperon ClpC eine aktive Clp-Protease bildet. Durch Größenausschlusschromatografie und Untersuchungen zur Proteaseaktivität konnte diese dann erstmalig charakterisiert werden. Des Weiteren zeigten in vitro-Degradationsversuche mit der aktiven Protease zweifelsfrei, dass das NblA1/NblA2-Heterodimer durch ClpC-ClpP1/ClpR abgebaut wird. Der Abbau von NblA1/NblA2 kann demnach auch ohne ein Substrat durch die Protease erfolgen. / The degradation of pycobilisomes under nitrogen deficiency, which is visible as a color change from blue green to yellow green, is an ubiquitary mechanism. Essential for the degradation is the small NblA protein. The well characterized NblA protein from Nostoc sp. PCC 7120 builds as biological active form a homodimer and interacts with the phycobilisomes and ClpC. However, the model organism Synechocystis sp. PCC 6803 possess two nblA genes, nblA1 and nblA2, which are both essential for phycobilisome degradation. In this work it could be shown by interaction studies and Förster resonance energy transfer that NblA1 and NblA2 builds as biological active form a heterodimer. Furthermore it could be shown that the NblA proteins form a ternary complex with ClpC (the HSP100 chaperone partner of Clp proteases) and phycobiliproteins in vitro. This complex is susceptible to ATP-dependent degradation by a Clp protease. Clp proteases of Cyanobacteria consist, besides the chaperones ClpC and ClpX of three different proteolytic subunits (ClpP1, 2, 3) and the ClpP variant ClpR which lacks the catalytic triad typical of Serine-type proteases. In Synechococcus 7942 two Clp proteases could be identified by gel filtration and immunoblot analyses, which provided evidence that each protease consists of a unique proteolytic core comprised of two separate Clp subunits, one core consisting of ClpP1 and ClpP2, and the other of ClpP3 and ClpR, in which subunits ClpP1/ClpP2 interact with ClpX and the ClpP3/ClpR protease with ClpC. In addition to these two soluble proteases, a third, membrane associated proteolytic complex is assumed, consisting of ClpP1 and ClpR. In Synechocystis 6803, homologs of the Clp machinery could be found by BLAST analyzes. This putative ClpP1/ClpR protease could be characterized in vitro by size-exclusion chromatography and degradation assays. Furthermore it could be shown a degradation of the NblA1/NblA2 heterodimer by the protease.

Die meisten Cyanobakterien und Chloroplasten von Rotalgen verfügen über Phycobilisomen, große lichtsammelnde Multiproteinkomplexe, die an der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran gebunden vorliegen. Unter stickstofflimitierten Bedingungen werden die Phycobilisomen proteolytisch abgebaut. Dieser Prozess schützt vor Fotoschäden unter den gegebenen Stressbedingungen und liefert gleichzeitig einen großen Vorrat an Stickstoff enthaltenden Substanzen. Das Gen nblA, welches in allen Phycobilisomen enthaltenden Organismen vorkommt, kodiert für ein Polypeptid von ungefähr 7 kDa, das eine Schlüsselrolle im Abbau der Phycobilisomen einnimmt. Die Wirkungsweise von NblA dabei wird jedoch bisher kaum verstanden. Ein Selenomethioninderivat von NblA des filamentösen Cyanobakteriums Anabaena sp. PCC 7120 wurde in Escherichia coli rekombinant hergestellt, gereinigt und kristallisiert. Die Röntgenkristallstruktur von NblA wurde mithilfe der single-wavelength anomalous dispersion-Methode bis zu einer Auflösung von 1,8 Angstrom bestimmt. Das finale Modell verfügt über einen kristallographischen R-Wert von 18,2% und einen freien R-Wert von 21,7%. Das kleine NblA-Protein von 65 Aminosäuren besteht aus zwei alpha-Helices, die in einem ca. 37°-Winkel in einer antiparallelen, V-förmigen Anordnung zueinander stehen. Zwei dieser Monomere bilden die grundlegende strukturelle Einheit von NblA, ein vier-Helix-Bündel, bei dem sich die Spitzen der "Vs" auf der gleichen Seite des Dimers überlagern und über eine nicht-kristallographische zweizählige Achse miteinander verknüpft sind. Auf der Grundlage von Bindungsstudien und der Kenntnis der NblA-Struktur konnte ein Modell für die Bindung von NblA an die Phycobilisomenstruktur postuliert werden. / Cyanobacterial light harvesting complexes, the phycobilisomes, are proteolytically degraded when the organisms are starved for combined nitrogen, a process referred to as chlorosis or bleaching. Gene nblA, present in all phycobilisome-containing organisms, encodes a protein of about 7 kDa that plays a key role in phycobilisome degradation. To gain deeper insights into the mode of action of NblA in this degradation process the crystal structure of NblA was determined and a model of its binding to phycobilisomes was proposed. For this purpose, NblA from Anabaena sp. PCC 7120 was produced as selenomethionine NblA derivative in Escherichia coli B834 (DE3), purified and crystalized. NblA crystals grew as long, but thin rods and belong to the monoclinic space group P2(1) with cell parameters of a = 43.2 A, b = 95.9 A, c = 104.8 A and Beta = 97.0°. They contain twelve NblA monomers in the asymmetric unit. The crystal structure with a resolution of 1.8 A was determined using the single-wavelength anomalous dispersion (SAD) technique and refined to final values for Rwork and Rfree of 0.182 and 0.217, respectively. The small NblA polypeptide of 65 amino acids consists of two alpha-helices which are assembled at a ~37° angle in an antiparallel, V-shaped arrangement. Two NblA monomers form the basic structural unit of NblA, a four-helix bundle with the tips of the V superimposing on the same side of a dimer. The dimer is formed by two molecules related by a non-crystallographic dyad axis. Based on the crystal structure presented here, pull-down experiments, and peptide scan data a model of binding of NblA to phycobilisomes was proposed. Considering the entire phycobilisome structure, NblA is predicted to bind via its amino acids Leu51 and Lys53 to the trimer-trimer interface of the phycobiliprotein hexamers.