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Untersuchungen zum stickstoffinduzierten Phycobilisomenabbau - NblA, ein kleines Protein mit großer WirkungBaier, Antje 16 December 2013 (has links)
Der Abbau der PBS unter Stickstoffmangel ist in Cyanobakterien ein ubiquitärer Mechanismus. Essenziell für den Abbau ist das Protein NblA. Das in Nostoc sp. PCC 7120 gut untersuchte ~7 kDa große Protein interagiert als Homodimer mit den PBS und dem Chaperon ClpC. Soweit bekannt kodieren alle Cyanobakterien ein essenzielles NblA-Protein. Der Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803, dagegen kodiert mit NblA1 und NblA2 sogar zwei für den PBS-Abbau entscheidende Proteine. In dieser Arbeit konnte erstmalig durch in vitro und in vivo Interaktionsstudien mithilfe von pull down-Versuchen und FRET gezeigt werden, dass NblA1 und NblA2 als biologisch aktive Form ein Heterodimer bilden. In vitro-pulldown-Versuche zeigten für Synechocystis eine Interaktion des Heterodimers mit den PBS und ClpC. Durch die Ausbildung dieses ternären Komplexes markiert NblA1/NblA2 die PBS für den Abbau durch eine Clp-Protease mit ClpC als Chaperonpartner. In Photobionten gibt es eine Reihe von clp-Genen, so besitzen Cyanobakterien vier proteolytische clp Untereinheiten. Aus diesen bilden sich gemischte Heptamere aus je zwei Clp-Untereinheiten. Zwei lösliche, im Cytoplasma vorkommende Proteasen wurden bis jetzt zweifelsfrei identifiziert, eine dritte, an der Thylakoidmembran assoziierte Protease wird außerdem vermutet. Diese putative Protease, vermutlich aus dem Chaperon ClpC und den proteolytischen Untereinheiten ClpP1 und ClpR aufgebaut, wurde heterolog exprimiert. Mittels Koreinigung konnte ein funktioneller proteolytischer Kern gereinigt werden, der zusammen mit dem Chaperon ClpC eine aktive Clp-Protease bildet. Durch Größenausschlusschromatografie und Untersuchungen zur Proteaseaktivität konnte diese dann erstmalig charakterisiert werden. Des Weiteren zeigten in vitro-Degradationsversuche mit der aktiven Protease zweifelsfrei, dass das NblA1/NblA2-Heterodimer durch ClpC-ClpP1/ClpR abgebaut wird. Der Abbau von NblA1/NblA2 kann demnach auch ohne ein Substrat durch die Protease erfolgen. / The degradation of pycobilisomes under nitrogen deficiency, which is visible as a color change from blue green to yellow green, is an ubiquitary mechanism. Essential for the degradation is the small NblA protein. The well characterized NblA protein from Nostoc sp. PCC 7120 builds as biological active form a homodimer and interacts with the phycobilisomes and ClpC. However, the model organism Synechocystis sp. PCC 6803 possess two nblA genes, nblA1 and nblA2, which are both essential for phycobilisome degradation. In this work it could be shown by interaction studies and Förster resonance energy transfer that NblA1 and NblA2 builds as biological active form a heterodimer. Furthermore it could be shown that the NblA proteins form a ternary complex with ClpC (the HSP100 chaperone partner of Clp proteases) and phycobiliproteins in vitro. This complex is susceptible to ATP-dependent degradation by a Clp protease. Clp proteases of Cyanobacteria consist, besides the chaperones ClpC and ClpX of three different proteolytic subunits (ClpP1, 2, 3) and the ClpP variant ClpR which lacks the catalytic triad typical of Serine-type proteases. In Synechococcus 7942 two Clp proteases could be identified by gel filtration and immunoblot analyses, which provided evidence that each protease consists of a unique proteolytic core comprised of two separate Clp subunits, one core consisting of ClpP1 and ClpP2, and the other of ClpP3 and ClpR, in which subunits ClpP1/ClpP2 interact with ClpX and the ClpP3/ClpR protease with ClpC. In addition to these two soluble proteases, a third, membrane associated proteolytic complex is assumed, consisting of ClpP1 and ClpR. In Synechocystis 6803, homologs of the Clp machinery could be found by BLAST analyzes. This putative ClpP1/ClpR protease could be characterized in vitro by size-exclusion chromatography and degradation assays. Furthermore it could be shown a degradation of the NblA1/NblA2 heterodimer by the protease.
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Role of Gcn4p in nutrient-controlled gene expression in Saccharomyces cerevisiae / Die Rolle von Gcn4p in der nährstoffkontrollierten Genexpression in Saccharomyces cerevisiaeGrundmann, Olav 27 July 2001 (has links)
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