PINHEIRO, Daniel Pascoalino. Perfil clínico e molecular de pacientes portadores de neoplasia endócrina múltipla tipo 1. 2012. 94 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-18T13:12:15Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_dppinheiro.pdf: 2292524 bytes, checksum: 1a26225cf587f0dd66f29b67bb3addc2 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-18T13:12:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_dppinheiro.pdf: 2292524 bytes, checksum: 1a26225cf587f0dd66f29b67bb3addc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-18T13:12:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_dppinheiro.pdf: 2292524 bytes, checksum: 1a26225cf587f0dd66f29b67bb3addc2 (MD5) Previous issue date: 2012 / MEN-1 is a rare autosomal dominantly inherited syndrome caused by a mutation that inactivates the MEN1 gene (tumor suppressor gene). The clinical manifestation of MEN-1 is defined by the associated occurrence of at least two of the three main endocrine tumors related to MEN1: primary hyperparathyroidism (PHP), pituitary adenoma (PA) and gastroenteropancreatic tumors (GEPs). The MEN1 gene, involved in the syndrome, consists of 10 exons (exon 1 and 832 bases of exon 10 are not translated) encoding a protein that contains 610 amino acids called MENIN. Over 459 different germline mutations have been identified in families with MEN1. A total of eight families and two sporadic cases were studied, resulting in 33 patients with MEN1, with 31 familiar MEN1 and two sporadic MEN1. Four milliliters of peripheral blood were collected for DNA and RNA extraction using the QIAamp DNA Blood Mini and QIAamp RNA Blood Mini Kits from QIAGEN®. Each of the nine coding exons of the MEN1 gene was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR). The PCR products were purified and standard protocols were used for cycle sequencing. Sequences were determined after capillary electrophoresis and analyzed using the software CondonCode Aligner®, in order to draw a mutational profile. RNA samples were converted into cDNA and analyzed in real time PCR. The average age of patients was 40.7 ± 12.7 years, and the prevalence of tumors associated with MEN1 was: PHP, 87.8% (29/33), pituitary adenoma, 81.8% (27/33); GEPs, 54.5% (18 / 33), other tumors associated with MEN1, 63.6% (21/33). As the first manifestation in these patients, the pituitary adenomas prevailed, occurring in 57.5% (19/33). After automated sequencing of the entire coding region of the MEN1 gene, germline mutations were found in seven MEN1 families and in one of the sporadic cases. Three different mutations were identified: two missense mutations, c.597 C>T (H199H) e c.830 C>G (P277R); and one splice-site mutation, c.654 +1 G>T (IVS3+1G→T). We could not find any association between genotype-phenotype in these MEN1 patients. Differences in the gene expression profile were observed. The MEN1 gene in the studied patients was down regulated, when compared to healthy individuals. / A NEM1 é uma síndrome rara com padrão de transmissão autossômico dominante, causada por uma mutação que inativa o gene MEN1 (gene supressor tumoral). Define-se sua presença pela ocorrência associada de dois dos três principais tumores endócrinos relacionados à NEM-1: hiperparatireoidismo primário (HPT), adenomas hipofisários (AH) e tumores gastroenteropancreáticos (TEPs) secretores ou não. O gene MEN1, envolvido nessa síndrome, consiste de 10 exons (exon 1 e 832 bases do exon 10 não são traduzidos), codificando uma proteína que contem 610 aminoácidos, denominada MENIN. Mais de 459 diferentes mutações germinativas já foram identificadas em famílias com NEM1. Um total de 8 famílias e 2 casos esporádicos foram estudados, perfazendo um total de 33 pacientes com NEM1. Foram coletados 4mL de sangue periférico para extração de DNA e RNA utilizando os kits QIAamp DNA Blood Mini e QIAamp RNA Blood Mini, respectivamente, ambos da QIAGEN®. Os nove exons da região codificadora do gene MEN1 foram amplificados por PCR e submetidos, após purificação, à reação de sequenciamento. Em seguida as amostras foram analisadas através de eletroforese capilar. As sequências geradas foram analisadas utilizando o software CondonCode Aligner, afim de traçar um perfil mutacional. As amostras de RNA foram convertidas em cDNA e analisadas em PCR tempo real. A idade média dos pacientes estudados foi de 40,7±12,7 anos, onde a prevalência dos tumores associados a NEM1 foi: HPT, 87,8% (29/33); adenoma hipofisário, 81,8% (27/33); TEPs, 54,5% (18/33); outros tumores associados a NEM1, 63,6% (21/33). Como primeira manifestação nesses pacientes, os adenomas hipofisários prevaleceram, ocorrendo em 57,5% (19/33). Após sequenciamento automático de toda a região codificadora do gene MEN1, foram encontradas mutações germinativas em sete famílias portadoras de NEM1 estudadas e em um dos casos esporádicos. Três diferentes mutações foram identificadas, estando presentes nos exons 3 e 6: duas do tipo misssense (mutações pontuais), c.597 C>T (H199H) e c.830 C>G (P277R); e uma do tipo splice-site (mutações nas regiões de junção exon-intron), c.654 +1 G>T (IVS3+1G→T). Não foi possível estabelecer uma associação entre genótipo-fenótipo nesses pacientes portadores de NEM1. Foram observadas diferenças no perfil de expressão. O gene MEN1, nos pacientes com NEM1 estudados, estava regulado negativamente, quando comparado ao grupo controle.

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é uma neoplasia das células C ou parafoliculares da tireóide, correspondendo a 5–8% dos tumores malignos da glândula. O CMT apresenta-se como um tumor esporádico (75-80%) ou na forma hereditária (20-25%). Na forma familiar é um dos componentes de uma síndrome genética de herança autossômica dominante, apresentando-se isoladamente, como carcinoma medular de tireóide familiar (CMTF) ou como um dos componentes da neoplasia endócrina múltipla (NEM) 2A ou 2B. A síndrome genética NEM 2A caracteriza-se pela presença de CMT (95%), feocromocitoma (30 – 50%) e hiperparatireoidismo (10-20%), enquanto que pacientes com NEM 2B podem aprensentar CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose (100%) e hábito marfanóide (65%). O proto-oncogene RET, gene responsável pela NEM 2, codifica um receptor tirosinoquinase expresso nas células derivadas da crista neural. Mutações germinativas no RET são descritas principalmente nos exons 10, 11 e 16. Diversos estudos demonstraram a associação entre mutações específicas (genótipo) e idade no diagnóstico ou agressividade do CMT hereditário (fenótipo). No entanto, pacientes portadores da mesma mutação no proto-ongene RET podem apresentam quadros clínicos diferentes. Por esta razão, os polimorfismos do RET têm sido investigados como possíveis modificadores do fenótipo clínico em pacientes com NEM 2. Porém, os dados existentes na literatura sobre o papel dos polimorfismos do RET ainda são controversos. O objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel das variantes genéticas do RET na apresentação clínica do CMT (Siqueira DR et al, Endocr Relat Cancer 2010; 17:953-963). Dentro deste contexto, realizamos uma revisão do conhecimento atual sobre a associação dos polimorfismos do RET com o risco de desenvolver ou modificar a evolução do CMT (Ceolin L et al, Int J Mol Sci 2012; 13:221-239). A melhor compreensão dos diferentes mecanismos moleculares envolvidos na patogênese tumoral permitiu o desenvolvimento de novos tratamentos, direcionados principalmente aos pacientes com doença metastática. Dentre as diversas classes de novas drogas, destacam-se os inibidores tirosina quinase; essas drogas inibem a ação de vários receptores, entre eles o RET. O crescente número de estudos publicados avaliando o efeito de inibidores tirosina-quinase no manejo de pacientes com CMT metastático determinou um estudo da literatura sobre este tema (artigo submetido à publicação).

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é responsável por 5 a 8% dos tumores malignos da tireóide, ocorrendo na forma esporádica (80%) ou hereditária (20%). O CMT hereditário é uma doença autossômica dominante, maligna, de difícil diagnóstico clinico-laboratorial precoce e de alta mortalidade, podendo apresentar-se como componente das síndromes de Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM 2A e 2B) ou Carcinoma Medular de Tireóide Familiar (CMTF) ou outras formas (famílias não incluídas nas formas anteriores). A síndrome genética NEM 2A se caracteriza por CMT (95%), feocromocitoma (30-50%) e hiperparatireoidismo (10-20%). De acordo a alguns autores e baseando-se na apresentação clínica, a síndrome NEM 2A foi subdividida em 3 subtipos fenotípicos; 1) NEM 2A(1), que consiste no acometimento pelos 3 componentes da síndrome (CMT, feocromocitoma e hiperparatireoidismo), 2) NEM 2A(2), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e feocromocitoma) e 3) NEM 2A(3), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e hiperparatireoidismo). A síndrome NEM 2B se caracteriza pela presença de CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose intestinal (100%) e hábitos marfanóides (65%). O CMTF, consiste na presença de CMT isolado em pelo menos 4 membros da mesma família e as outras formas hereditárias consistem no acometimento de 2 ou 3 membros da família com CMT, sem a presença de feocromocitoma ou hiperparatireoidismo até o momento do rastreamento. Diferentes mutações no proto-oncogene rei foram identificadas como responsáveis pelo CMT e estudos recentes sugerem uma correlação entre o genótipo-fenótipo, podendo existir uma variabilidade grande de síndromes clínicas associadas as diferentes mutações, ou seja, indivíduos com um determinado tipo de mutação tem uma probabilidade maior ou menor de apresentar um determinado componente da síndrome. Visto que o CMT é uma doença autossômica dominante, maligna e de alta mortalidade, a aplicação do rastreamento genético para o manejo adequado da hereditariedade do CMT é de extrema importância, já que o diagnóstico precoce determina a conduta e o prognóstico no indivíduo afetado e em seus familiares. O presente estudo teve como objetivo a análise molecular do protooncogene ret no CMT e avaliar uma possível correlação entre as mutações identificadas e os diferentes fenótipos nos indivíduos afetados e seus familiares. Foram selecionadas para estudo molecular 21 famílias com diagnóstico íiistopatológico de CMT, provenientes de diferentes localidades e encaminhados aos ambulatórios de endocrinologia do HCPA e HC-Curitiba. O DNA genômico foi extraído de leucócitos periféricos dos indivíduos afetados e/ou familiares. Os exons 10, 11, 13 e/ou 16 do proto-oncogene ret foram amplificados pela técnica de reação polimerase em cadeia (PCR) com primers específicos. A presença de mutações foi determinada pela análise de restrição enzimática e/ou sequenciamento, seguindo a estratégia diagnostica. Das 21 família analisadas, 14 famílias apresentavam a forma hereditária do CMT e 7 a forma esporádica. Das famílias com CMT hereditário (6 NEM 2A, 2 NEM 2A associada à Líquen Amilóide Cutânea (CI_A), 1 NEM 2B, 2 CMTF e 3 outras formas hereditárias), no total de 96 indivíduos. Em todas as famílias com NEM 2A, inclusive na variante Cl_A, a mutação localizava-se no exon 11 (códon 634; TGC -» CGC ou TGC TAC) e nas famílias com CMTF, no exon 10 (códon 618, TGC AGC). No paciente portador da NEM 2B foi detectada uma mutação de novo no exon 16 (códon 918, ATG ->ACG). Nas outras formas de carcinoma hereditário, as mutações localizavam-se no exon 11 (códon 634, TGC CGC ou TGC TAC) numa família, em outra no exon 10 (códon 618, TGC -> AGC) e na última no exon 10 (códon 618 ou 620, TGC CGC). Foram identificadas mutações em todos os indivíduos com história clínica e laboratorial sugestiva de doença hereditária e/ou diagnóstico histopatológico de CMT muiticêntrico e em 8 familiares assintomáticos, destacando a importância do rastreamento genético como método diagnóstico. / Medullary Carcinoma of the Thyroid (MTC), a rare thyroid malignancy originating from parafollicular C cells, represents less than 8% of ali thyroid cancers and may occur either as sporadic (80%) or hereditary (20%) disease. Hereditary MTC oan occur either alone - familial MTC (FMTC) - or as the thyroid manifestation of multipie endocrine neoplasia type 2 (MEN 2) syndromes (MEN 2A and MEN 2B) or others. MEN 2A is characterized by MTC (95%), phaeochromocytoma (30-50%) and hyperparathyroidism (10-20%). Three phenotypic subtypes have been reported. MEN 2A(1) corresponda to kindred with ai! three components. MEN 2A(2) includes kindred with MTC and phaeochromocytoma, without hyperparathyroidism. MEN 2A(3) relates to kindred with MTC and hyperparathyroidism, without phaeochromocytoma. A variant of MEN 2A, associated with pruritic skin lesions known as cutaneous lichen amyloidosis (CLA), has aiso been described in a few kindred. MEN 2B syndrome is weil characterized by having a specific phenotype, by MTC (90%), neuromas and ganglioneuromatosis (100%) and marfanoid habitus (65%). FMTC includes kindred with at least 4 members with MTC, without other components of MEN 2A or MEN 2B. Other hereditary MTCs correspond to kindred with MTC in 2 or 3 members, without phaechromocytoma or hyperparathyroidism. Germiine mutations in the ret proto-oncogene, which codes for a receptor tyrosine kinase, cause MEN 2 and recent studies suggest a relationship between specific mutations and different phenotypes in MEN 2 syndromes. Early diagnosis and treatment considerably improve the prognosis in patienís with MTC and genetic screening is a fundamental tool for the management of MTC hereditary. The purpose of this study was to identify ret proto-oncogene mutations and analyze a possible relationship between genothype-phenothype in Brazilian kindred with MTC. A total of 21 families with histopathoiogical diagnosis of MTC were included in the study, 14 with the hereditary pattern and 7 with sporadic tumors. DNA was extracted from leukocytes of the affected individuais and relatives. Exons 10, 11, 13 and 16 were amplificated by PCR, using specific primers. The presence of mutation was determined by enzymatic restriction analysis and/or automatic sequencing. The phenotypes of hereditary MTC •Já were as foilows: 6 MEN 2A, 2 MEN 2A associated with CLA, 1 MEN 2B, 2 FMTC and 3 other forms. We identified mutations at codon 634, exon 11 (TGC -> CGC or TGC TAC) in ali families with MEN 2A and MEN 2A+ CLA. In both cases of FMTC, the mutation was found in the codon 618, exon 10 (TGC --> AGC). A mutation at codon 918, exon 16 (ATG -> AGC) was identified in the only individual with MEN 2B, while in the other hereditary forms of the MTC, mutations were identified at 3 different codons, 634 (exon 11, TGC -> CGC or TGC -> TAC). 618 (exon 10, TGC AGC) and 618 or 620 (exon 10, TGC CGC). The genetic screening was abie to identified 8 assymtomatic carriers and determine the hereditary MCT pattern in 2 individuais with apparentiy sporadic tumors. In conclusion, genetic testing can identify affected and assymtomatic individuais with hereditary disease, allowing eariy diagnosis and treatment. In addition, the resuits suggest a correlation between specific mutations and phenotypes, meaning that molecular analysis could also improve the follow up of gene carriers.

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é uma neoplasia das células C ou parafoliculares da tireóide, correspondendo a 5–8% dos tumores malignos da glândula. O CMT apresenta-se como um tumor esporádico (75-80%) ou na forma hereditária (20-25%). Na forma familiar é um dos componentes de uma síndrome genética de herança autossômica dominante, apresentando-se isoladamente, como carcinoma medular de tireóide familiar (CMTF) ou como um dos componentes da neoplasia endócrina múltipla (NEM) 2A ou 2B. A síndrome genética NEM 2A caracteriza-se pela presença de CMT (95%), feocromocitoma (30 – 50%) e hiperparatireoidismo (10-20%), enquanto que pacientes com NEM 2B podem aprensentar CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose (100%) e hábito marfanóide (65%). O proto-oncogene RET, gene responsável pela NEM 2, codifica um receptor tirosinoquinase expresso nas células derivadas da crista neural. Mutações germinativas no RET são descritas principalmente nos exons 10, 11 e 16. Diversos estudos demonstraram a associação entre mutações específicas (genótipo) e idade no diagnóstico ou agressividade do CMT hereditário (fenótipo). No entanto, pacientes portadores da mesma mutação no proto-ongene RET podem apresentam quadros clínicos diferentes. Por esta razão, os polimorfismos do RET têm sido investigados como possíveis modificadores do fenótipo clínico em pacientes com NEM 2. Porém, os dados existentes na literatura sobre o papel dos polimorfismos do RET ainda são controversos. O objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel das variantes genéticas do RET na apresentação clínica do CMT (Siqueira DR et al, Endocr Relat Cancer 2010; 17:953-963). Dentro deste contexto, realizamos uma revisão do conhecimento atual sobre a associação dos polimorfismos do RET com o risco de desenvolver ou modificar a evolução do CMT (Ceolin L et al, Int J Mol Sci 2012; 13:221-239). A melhor compreensão dos diferentes mecanismos moleculares envolvidos na patogênese tumoral permitiu o desenvolvimento de novos tratamentos, direcionados principalmente aos pacientes com doença metastática. Dentre as diversas classes de novas drogas, destacam-se os inibidores tirosina quinase; essas drogas inibem a ação de vários receptores, entre eles o RET. O crescente número de estudos publicados avaliando o efeito de inibidores tirosina-quinase no manejo de pacientes com CMT metastático determinou um estudo da literatura sobre este tema (artigo submetido à publicação).

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é responsável por 5 a 8% dos tumores malignos da tireóide, ocorrendo na forma esporádica (80%) ou hereditária (20%). O CMT hereditário é uma doença autossômica dominante, maligna, de difícil diagnóstico clinico-laboratorial precoce e de alta mortalidade, podendo apresentar-se como componente das síndromes de Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM 2A e 2B) ou Carcinoma Medular de Tireóide Familiar (CMTF) ou outras formas (famílias não incluídas nas formas anteriores). A síndrome genética NEM 2A se caracteriza por CMT (95%), feocromocitoma (30-50%) e hiperparatireoidismo (10-20%). De acordo a alguns autores e baseando-se na apresentação clínica, a síndrome NEM 2A foi subdividida em 3 subtipos fenotípicos; 1) NEM 2A(1), que consiste no acometimento pelos 3 componentes da síndrome (CMT, feocromocitoma e hiperparatireoidismo), 2) NEM 2A(2), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e feocromocitoma) e 3) NEM 2A(3), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e hiperparatireoidismo). A síndrome NEM 2B se caracteriza pela presença de CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose intestinal (100%) e hábitos marfanóides (65%). O CMTF, consiste na presença de CMT isolado em pelo menos 4 membros da mesma família e as outras formas hereditárias consistem no acometimento de 2 ou 3 membros da família com CMT, sem a presença de feocromocitoma ou hiperparatireoidismo até o momento do rastreamento. Diferentes mutações no proto-oncogene rei foram identificadas como responsáveis pelo CMT e estudos recentes sugerem uma correlação entre o genótipo-fenótipo, podendo existir uma variabilidade grande de síndromes clínicas associadas as diferentes mutações, ou seja, indivíduos com um determinado tipo de mutação tem uma probabilidade maior ou menor de apresentar um determinado componente da síndrome. Visto que o CMT é uma doença autossômica dominante, maligna e de alta mortalidade, a aplicação do rastreamento genético para o manejo adequado da hereditariedade do CMT é de extrema importância, já que o diagnóstico precoce determina a conduta e o prognóstico no indivíduo afetado e em seus familiares. O presente estudo teve como objetivo a análise molecular do protooncogene ret no CMT e avaliar uma possível correlação entre as mutações identificadas e os diferentes fenótipos nos indivíduos afetados e seus familiares. Foram selecionadas para estudo molecular 21 famílias com diagnóstico íiistopatológico de CMT, provenientes de diferentes localidades e encaminhados aos ambulatórios de endocrinologia do HCPA e HC-Curitiba. O DNA genômico foi extraído de leucócitos periféricos dos indivíduos afetados e/ou familiares. Os exons 10, 11, 13 e/ou 16 do proto-oncogene ret foram amplificados pela técnica de reação polimerase em cadeia (PCR) com primers específicos. A presença de mutações foi determinada pela análise de restrição enzimática e/ou sequenciamento, seguindo a estratégia diagnostica. Das 21 família analisadas, 14 famílias apresentavam a forma hereditária do CMT e 7 a forma esporádica. Das famílias com CMT hereditário (6 NEM 2A, 2 NEM 2A associada à Líquen Amilóide Cutânea (CI_A), 1 NEM 2B, 2 CMTF e 3 outras formas hereditárias), no total de 96 indivíduos. Em todas as famílias com NEM 2A, inclusive na variante Cl_A, a mutação localizava-se no exon 11 (códon 634; TGC -» CGC ou TGC TAC) e nas famílias com CMTF, no exon 10 (códon 618, TGC AGC). No paciente portador da NEM 2B foi detectada uma mutação de novo no exon 16 (códon 918, ATG ->ACG). Nas outras formas de carcinoma hereditário, as mutações localizavam-se no exon 11 (códon 634, TGC CGC ou TGC TAC) numa família, em outra no exon 10 (códon 618, TGC -> AGC) e na última no exon 10 (códon 618 ou 620, TGC CGC). Foram identificadas mutações em todos os indivíduos com história clínica e laboratorial sugestiva de doença hereditária e/ou diagnóstico histopatológico de CMT muiticêntrico e em 8 familiares assintomáticos, destacando a importância do rastreamento genético como método diagnóstico. / Medullary Carcinoma of the Thyroid (MTC), a rare thyroid malignancy originating from parafollicular C cells, represents less than 8% of ali thyroid cancers and may occur either as sporadic (80%) or hereditary (20%) disease. Hereditary MTC oan occur either alone - familial MTC (FMTC) - or as the thyroid manifestation of multipie endocrine neoplasia type 2 (MEN 2) syndromes (MEN 2A and MEN 2B) or others. MEN 2A is characterized by MTC (95%), phaeochromocytoma (30-50%) and hyperparathyroidism (10-20%). Three phenotypic subtypes have been reported. MEN 2A(1) corresponda to kindred with ai! three components. MEN 2A(2) includes kindred with MTC and phaeochromocytoma, without hyperparathyroidism. MEN 2A(3) relates to kindred with MTC and hyperparathyroidism, without phaeochromocytoma. A variant of MEN 2A, associated with pruritic skin lesions known as cutaneous lichen amyloidosis (CLA), has aiso been described in a few kindred. MEN 2B syndrome is weil characterized by having a specific phenotype, by MTC (90%), neuromas and ganglioneuromatosis (100%) and marfanoid habitus (65%). FMTC includes kindred with at least 4 members with MTC, without other components of MEN 2A or MEN 2B. Other hereditary MTCs correspond to kindred with MTC in 2 or 3 members, without phaechromocytoma or hyperparathyroidism. Germiine mutations in the ret proto-oncogene, which codes for a receptor tyrosine kinase, cause MEN 2 and recent studies suggest a relationship between specific mutations and different phenotypes in MEN 2 syndromes. Early diagnosis and treatment considerably improve the prognosis in patienís with MTC and genetic screening is a fundamental tool for the management of MTC hereditary. The purpose of this study was to identify ret proto-oncogene mutations and analyze a possible relationship between genothype-phenothype in Brazilian kindred with MTC. A total of 21 families with histopathoiogical diagnosis of MTC were included in the study, 14 with the hereditary pattern and 7 with sporadic tumors. DNA was extracted from leukocytes of the affected individuais and relatives. Exons 10, 11, 13 and 16 were amplificated by PCR, using specific primers. The presence of mutation was determined by enzymatic restriction analysis and/or automatic sequencing. The phenotypes of hereditary MTC •Já were as foilows: 6 MEN 2A, 2 MEN 2A associated with CLA, 1 MEN 2B, 2 FMTC and 3 other forms. We identified mutations at codon 634, exon 11 (TGC -> CGC or TGC TAC) in ali families with MEN 2A and MEN 2A+ CLA. In both cases of FMTC, the mutation was found in the codon 618, exon 10 (TGC --> AGC). A mutation at codon 918, exon 16 (ATG -> AGC) was identified in the only individual with MEN 2B, while in the other hereditary forms of the MTC, mutations were identified at 3 different codons, 634 (exon 11, TGC -> CGC or TGC -> TAC). 618 (exon 10, TGC AGC) and 618 or 620 (exon 10, TGC CGC). The genetic screening was abie to identified 8 assymtomatic carriers and determine the hereditary MCT pattern in 2 individuais with apparentiy sporadic tumors. In conclusion, genetic testing can identify affected and assymtomatic individuais with hereditary disease, allowing eariy diagnosis and treatment. In addition, the resuits suggest a correlation between specific mutations and phenotypes, meaning that molecular analysis could also improve the follow up of gene carriers.

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é uma neoplasia das células C ou parafoliculares da tireóide, correspondendo a 5–8% dos tumores malignos da glândula. O CMT apresenta-se como um tumor esporádico (75-80%) ou na forma hereditária (20-25%). Na forma familiar é um dos componentes de uma síndrome genética de herança autossômica dominante, apresentando-se isoladamente, como carcinoma medular de tireóide familiar (CMTF) ou como um dos componentes da neoplasia endócrina múltipla (NEM) 2A ou 2B. A síndrome genética NEM 2A caracteriza-se pela presença de CMT (95%), feocromocitoma (30 – 50%) e hiperparatireoidismo (10-20%), enquanto que pacientes com NEM 2B podem aprensentar CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose (100%) e hábito marfanóide (65%). O proto-oncogene RET, gene responsável pela NEM 2, codifica um receptor tirosinoquinase expresso nas células derivadas da crista neural. Mutações germinativas no RET são descritas principalmente nos exons 10, 11 e 16. Diversos estudos demonstraram a associação entre mutações específicas (genótipo) e idade no diagnóstico ou agressividade do CMT hereditário (fenótipo). No entanto, pacientes portadores da mesma mutação no proto-ongene RET podem apresentam quadros clínicos diferentes. Por esta razão, os polimorfismos do RET têm sido investigados como possíveis modificadores do fenótipo clínico em pacientes com NEM 2. Porém, os dados existentes na literatura sobre o papel dos polimorfismos do RET ainda são controversos. O objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel das variantes genéticas do RET na apresentação clínica do CMT (Siqueira DR et al, Endocr Relat Cancer 2010; 17:953-963). Dentro deste contexto, realizamos uma revisão do conhecimento atual sobre a associação dos polimorfismos do RET com o risco de desenvolver ou modificar a evolução do CMT (Ceolin L et al, Int J Mol Sci 2012; 13:221-239). A melhor compreensão dos diferentes mecanismos moleculares envolvidos na patogênese tumoral permitiu o desenvolvimento de novos tratamentos, direcionados principalmente aos pacientes com doença metastática. Dentre as diversas classes de novas drogas, destacam-se os inibidores tirosina quinase; essas drogas inibem a ação de vários receptores, entre eles o RET. O crescente número de estudos publicados avaliando o efeito de inibidores tirosina-quinase no manejo de pacientes com CMT metastático determinou um estudo da literatura sobre este tema (artigo submetido à publicação).

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é responsável por 5 a 8% dos tumores malignos da tireóide, ocorrendo na forma esporádica (80%) ou hereditária (20%). O CMT hereditário é uma doença autossômica dominante, maligna, de difícil diagnóstico clinico-laboratorial precoce e de alta mortalidade, podendo apresentar-se como componente das síndromes de Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM 2A e 2B) ou Carcinoma Medular de Tireóide Familiar (CMTF) ou outras formas (famílias não incluídas nas formas anteriores). A síndrome genética NEM 2A se caracteriza por CMT (95%), feocromocitoma (30-50%) e hiperparatireoidismo (10-20%). De acordo a alguns autores e baseando-se na apresentação clínica, a síndrome NEM 2A foi subdividida em 3 subtipos fenotípicos; 1) NEM 2A(1), que consiste no acometimento pelos 3 componentes da síndrome (CMT, feocromocitoma e hiperparatireoidismo), 2) NEM 2A(2), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e feocromocitoma) e 3) NEM 2A(3), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e hiperparatireoidismo). A síndrome NEM 2B se caracteriza pela presença de CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose intestinal (100%) e hábitos marfanóides (65%). O CMTF, consiste na presença de CMT isolado em pelo menos 4 membros da mesma família e as outras formas hereditárias consistem no acometimento de 2 ou 3 membros da família com CMT, sem a presença de feocromocitoma ou hiperparatireoidismo até o momento do rastreamento. Diferentes mutações no proto-oncogene rei foram identificadas como responsáveis pelo CMT e estudos recentes sugerem uma correlação entre o genótipo-fenótipo, podendo existir uma variabilidade grande de síndromes clínicas associadas as diferentes mutações, ou seja, indivíduos com um determinado tipo de mutação tem uma probabilidade maior ou menor de apresentar um determinado componente da síndrome. Visto que o CMT é uma doença autossômica dominante, maligna e de alta mortalidade, a aplicação do rastreamento genético para o manejo adequado da hereditariedade do CMT é de extrema importância, já que o diagnóstico precoce determina a conduta e o prognóstico no indivíduo afetado e em seus familiares. O presente estudo teve como objetivo a análise molecular do protooncogene ret no CMT e avaliar uma possível correlação entre as mutações identificadas e os diferentes fenótipos nos indivíduos afetados e seus familiares. Foram selecionadas para estudo molecular 21 famílias com diagnóstico íiistopatológico de CMT, provenientes de diferentes localidades e encaminhados aos ambulatórios de endocrinologia do HCPA e HC-Curitiba. O DNA genômico foi extraído de leucócitos periféricos dos indivíduos afetados e/ou familiares. Os exons 10, 11, 13 e/ou 16 do proto-oncogene ret foram amplificados pela técnica de reação polimerase em cadeia (PCR) com primers específicos. A presença de mutações foi determinada pela análise de restrição enzimática e/ou sequenciamento, seguindo a estratégia diagnostica. Das 21 família analisadas, 14 famílias apresentavam a forma hereditária do CMT e 7 a forma esporádica. Das famílias com CMT hereditário (6 NEM 2A, 2 NEM 2A associada à Líquen Amilóide Cutânea (CI_A), 1 NEM 2B, 2 CMTF e 3 outras formas hereditárias), no total de 96 indivíduos. Em todas as famílias com NEM 2A, inclusive na variante Cl_A, a mutação localizava-se no exon 11 (códon 634; TGC -» CGC ou TGC TAC) e nas famílias com CMTF, no exon 10 (códon 618, TGC AGC). No paciente portador da NEM 2B foi detectada uma mutação de novo no exon 16 (códon 918, ATG ->ACG). Nas outras formas de carcinoma hereditário, as mutações localizavam-se no exon 11 (códon 634, TGC CGC ou TGC TAC) numa família, em outra no exon 10 (códon 618, TGC -> AGC) e na última no exon 10 (códon 618 ou 620, TGC CGC). Foram identificadas mutações em todos os indivíduos com história clínica e laboratorial sugestiva de doença hereditária e/ou diagnóstico histopatológico de CMT muiticêntrico e em 8 familiares assintomáticos, destacando a importância do rastreamento genético como método diagnóstico. / Medullary Carcinoma of the Thyroid (MTC), a rare thyroid malignancy originating from parafollicular C cells, represents less than 8% of ali thyroid cancers and may occur either as sporadic (80%) or hereditary (20%) disease. Hereditary MTC oan occur either alone - familial MTC (FMTC) - or as the thyroid manifestation of multipie endocrine neoplasia type 2 (MEN 2) syndromes (MEN 2A and MEN 2B) or others. MEN 2A is characterized by MTC (95%), phaeochromocytoma (30-50%) and hyperparathyroidism (10-20%). Three phenotypic subtypes have been reported. MEN 2A(1) corresponda to kindred with ai! three components. MEN 2A(2) includes kindred with MTC and phaeochromocytoma, without hyperparathyroidism. MEN 2A(3) relates to kindred with MTC and hyperparathyroidism, without phaeochromocytoma. A variant of MEN 2A, associated with pruritic skin lesions known as cutaneous lichen amyloidosis (CLA), has aiso been described in a few kindred. MEN 2B syndrome is weil characterized by having a specific phenotype, by MTC (90%), neuromas and ganglioneuromatosis (100%) and marfanoid habitus (65%). FMTC includes kindred with at least 4 members with MTC, without other components of MEN 2A or MEN 2B. Other hereditary MTCs correspond to kindred with MTC in 2 or 3 members, without phaechromocytoma or hyperparathyroidism. Germiine mutations in the ret proto-oncogene, which codes for a receptor tyrosine kinase, cause MEN 2 and recent studies suggest a relationship between specific mutations and different phenotypes in MEN 2 syndromes. Early diagnosis and treatment considerably improve the prognosis in patienís with MTC and genetic screening is a fundamental tool for the management of MTC hereditary. The purpose of this study was to identify ret proto-oncogene mutations and analyze a possible relationship between genothype-phenothype in Brazilian kindred with MTC. A total of 21 families with histopathoiogical diagnosis of MTC were included in the study, 14 with the hereditary pattern and 7 with sporadic tumors. DNA was extracted from leukocytes of the affected individuais and relatives. Exons 10, 11, 13 and 16 were amplificated by PCR, using specific primers. The presence of mutation was determined by enzymatic restriction analysis and/or automatic sequencing. The phenotypes of hereditary MTC •Já were as foilows: 6 MEN 2A, 2 MEN 2A associated with CLA, 1 MEN 2B, 2 FMTC and 3 other forms. We identified mutations at codon 634, exon 11 (TGC -> CGC or TGC TAC) in ali families with MEN 2A and MEN 2A+ CLA. In both cases of FMTC, the mutation was found in the codon 618, exon 10 (TGC --> AGC). A mutation at codon 918, exon 16 (ATG -> AGC) was identified in the only individual with MEN 2B, while in the other hereditary forms of the MTC, mutations were identified at 3 different codons, 634 (exon 11, TGC -> CGC or TGC -> TAC). 618 (exon 10, TGC AGC) and 618 or 620 (exon 10, TGC CGC). The genetic screening was abie to identified 8 assymtomatic carriers and determine the hereditary MCT pattern in 2 individuais with apparentiy sporadic tumors. In conclusion, genetic testing can identify affected and assymtomatic individuais with hereditary disease, allowing eariy diagnosis and treatment. In addition, the resuits suggest a correlation between specific mutations and phenotypes, meaning that molecular analysis could also improve the follow up of gene carriers.

SOUZA, M. R. Avaliação epidemiológica, clínica e laboratorial de indivíduos sob-risco de neoplasia endócrina múltipla tipo 1 na microrregião do Baixo Jaguaribe do estado do Ceará. 2015. 101 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T11:35:10Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mrsouza.pdf: 1760979 bytes, checksum: e0cbe68cfe4e111b8aa96946fb250ad6 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T11:35:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mrsouza.pdf: 1760979 bytes, checksum: e0cbe68cfe4e111b8aa96946fb250ad6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T11:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mrsouza.pdf: 1760979 bytes, checksum: e0cbe68cfe4e111b8aa96946fb250ad6 (MD5) Previous issue date: 2015-09-04 / The Multiple Endocrine Neoplasia type 1 (MEN1) is a genetic disorder with autosomal dominant inheritance with high penetrance (near 100% at 50 years) caused by a mutation that inactivates the MEN1 gene. It is defined by the combined occurrence of two of the three major endocrine tumors related to MEN1: Primary hyperparathyroidism (HPT), pituitary tumors (PT) and enteropancreatic endocrine tumors (PET). It is classified as familial MEN1 when there is one patient with MEN1 and at least one first degree relative with one of the three classic tumors. Due to this inheritance pattern, the first degree relatives of patients with MEN1 have a theoretical 50% risk of being carriers of the mutation. In a previous study conducted at the University Hospital Walter Cantídio were clinically diagnosed 56 patients with MEN1, divided into 12 families and four sporadic cases. Of the 12 families, six are coming from two cities located in micro-region of Ceará state known as Baixo Jaguaribe. In this work we aimed to perform clinical and laboratory screening and evaluating associations between epidemiological, clinical and laboratory data on the impact on the diagnosis of MEN1 in relatives under-risk MEN1 from that region and measuring the degree of correlation between clinical research by applying the questionnaire and the biochemical diagnosis. Collection of clinical data of first-degree relatives ≥ 20 years-old under-risk through clinical and epidemiological questionnaire and biochemical evaluation were performed for diagnosis of the main tumors-related syndrome (serum glucose, insulin, total calcium, ionized calcium, phosphorus, PTH, 25-hydroxyvitamin D, prolactin, IGF-1 and gastrin). Of the 27 individuals at-risk evaluated the average age was 45,1 ± 13.1 (22-65) years-old, 59% of them performed activities related to network weaving. Of the total sample, 11/27 (40,7%) had at least one clinical complaints possibly related to the presence of HPT, while the biochemical diagnosis of this was done in 13/27 (48,1%). 18/27 (66,6%) of subjects had one or more signs/symptoms that may be associated with PET, while the biochemical diagnosis was made in only 2/27 (7,4%) of the subjects (01 gastrinoma and 01 insulinoma). Suggestive complaint of PT were found in 17/27 (62,9%), while the biochemical confirmation was made in 5/27 (18,5%), all with hyperprolactinemia. We found a correlation between the clinical and biochemical research for HPT in 8/11 (72,7%) of the subjects (kappa = 0,40, p = 0,054), which is considered moderate and on the other hand there were a weak correlation to both PET in 2/ 18 (11,1%; kappa = 0,076 and p = 0.054) and PT in 5/17 (29,4%; kappa = 0,23 and p = 0,124). In conclusion, we found 14/27 (51,8%) new cases diagnosed with MEN1 in a population considered high risk, which is consistent with the pattern of disease transmission. On average the diagnosis was made in the fifth decade of life, showing a delay in diagnosis. The clinical questionnaire had a poor applicability for diagnosis since the relationship between the presence of a sign and/or a symptom and biochemical diagnosis showed low consistency, with only moderate concordance considered for diagnosis of HPT. / A Neoplasia Endócrina Múltipla Tipo 1 (NEM1) é um patologia genética com padrão de herança autossômico dominante de alta penetrância (próximo 100% aos 50 anos) causada por uma mutação que inativa o gene MEN1. Define-se pela ocorrência combinada de dois dos três principais tumores endócrinos relacionados à NEM1: hiperparatireoidismo primário (HPT), tumores hipofisários (TH) e tumores endócrinos enteropancreáticos (TEP). Classifica-se como NEM1 familiar quando há um paciente com NEM1 e pelo menos um familiar com um dos três tumores clássicos. Devido ao padrão de herança os parentes de primeiro grau dos indivíduos afetados apresentam um risco teórico de 50% de serem portadores da mutação. Em estudo prévio realizado no Hospital Universitário Walter Cantídio foram diagnosticados clinicamente 56 pacientes com NEM1, sendo oriundos de 12 famílias e 4 casos esporádicos. Das 12 famílias, seis são procedentes de dois municípios situados numa microrregião do estado do Ceará conhecida como Baixo Jaguaribe. No presente trabalho objetivamos realizar rastreamento clínico-laboratorial e avaliar associações entre dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais sob o impacto no diagnóstico de NEM1 em parentes sob-risco de NEM1 provenientes da região supracitada e aferir o grau de concordância entre a pesquisa clínica através da aplicação de questionário e o diagnóstico bioquímico. Foram realizadas coleta dos dados clínicos dos parentes de primeiro grau ≥ 20 anos sob-risco, através de questionário clínico-epidemiológico e avaliação bioquímica, para diagnóstico dos principais tumores relacionados à síndrome (dosagem sérica de glicemia, insulina, cálcio total, cálcio ionizado, fósforo, PTH, 25-hidroxivitamina D, prolactina, IGF-1 e gastrina). Dos 27 indivíduos sob-risco avaliados a idade média foi de 45,1 ± 13,1(22-65) anos, 59% destes realizavam atividade relacionada à tecelagem de rede. Do total da amostra, 11/27 (40,7%) apresentaram pelo menos uma queixa clínica possivelmente relacionada à presença de HPT, enquanto o diagnóstico bioquímico deste foi feito em 13/27(48,1%). 18/27(66,6%) dos indivíduos apresentaram um ou mais sinais/sintomas que podem estar associados aos TEP, enquanto o diagnóstico bioquímico foi feito em apenas 02/27(7,4%) dos indivíduos (01 gastrinoma e 01 insulinoma). Manifestações sugestivas de TH foram encontradas em 17/27 (62,9%), enquanto a confirmação bioquímica foi feita em 05/27(18,5%), todos com hiperprolactinemia. Encontramos uma concordância entre o diagnóstico clínico e bioquímico para pesquisa de HPT em 8/11(72,7%) dos indivíduos (kappa = 0,40, p=0,054) que é considerada moderada, sendo a mesma considerada fraca para TEP com 2/18 (11,1%; kappa = 0,07 e p=0,054) e TH em 5/17 (29,4%; kappa = 0,23 e p=0,124). Em conclusão, encontramos 14/27(51,8%) novos casos com diagnóstico de NEM1 em uma população considerada de alto risco, estando de acordo com o padrão de transmissão da doença. Em média, o diagnóstico foi feito na quinta década de vida, demonstrando um atraso no diagnóstico. A aplicabilidade do questionário clínico mostrou-se de baixa confiabilidade para o diagnóstico uma vez que a relação entre a presença de um sinal e/ou sintoma e a confirmação bioquímica apresentou baixa concordância, havendo apenas uma concordância considerada moderada para o diagnóstico de HPT.

Orientadores: Laura Sterian Ward, Janete Cerutti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbieri_RaquelBueno_M.pdf: 1118684 bytes, checksum: aea72fb3df76b68d6756c422b46ffc56 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Polimorfismos de genes baixa penetrância têm sido consistentemente associados com a suscetibilidade a uma série de tumores humanos, incluindo o câncer de tireóide. A fim de determinar seu papel no carcinoma medular de tireóide (CMT), foi utilizado o método TaqMan® SNP Genotyping em 138 pacientes com CMTH, 47 pacientes com CMT-s e um grupo controle de 578 indivíduos para genotipagem dos polimorfismos CYP1A2*F (rs762551), CYP1A1m1 (rs4646903), NAT2 C282T (rs1041983), GSTP1 codon 105 (rs1695), TP53 codon 72 (rs1042522). Este estudo demonstrou uma associação entre a presença de alelos polimórficos de CYP1A2*F, GSTP1 e NAT2 e o desenvolvimento de CMTH. A herança do alelo C em homozigose do gene CYP1A 2*F influencia o desenvolvimento de CMTH em mais de 2 vezes. Pacientes que apresentaram o alelo T em homozigose para o gene NAT2 possuem uma probabilidade 3 vezes maior para o desenvolvimento de CMTH e os indivíduos que herdaram o alelo G do gene GSTP1 em homozigose apresentam maior probabilidade de desenvolvimento de CMTH. Uma análise estatística de regressão logística, ajustada para sexo, idade, etnia, tabagismo e os genes CYP1A*F, CYP1A1m1, NAT, GSTP1 e TP53 para os pacientes com CMTH demonstrou que, quando considerado o tamanho do tumor como estimativa de agressividade, o sexo masculino apresentou-se como fator de proteção ao aumento do tamanho do tumor (OR=0,12; p=0,0072). Considerando a recidiva local como estimativa de agressividade, o genótipo alterado do gene GSTP1 apresentou-se como fator de risco para presença de recidiva local (OR=1,17; p=0,035). A análise de regressão logística mostrou que a herança do genótipo C/C dos genes NAT2 (OR=3,87; IC95%=2,11-7,10; p=2,2x10-5) e TP53 (OR=3,87 IC95%=1,78-6,10; p=2,8x10-4) aumentou o risco de CMT-s. Uma análise de regressão indicou que o genótipo C/C do gene TP53 contribui com 8,07% do risco CMT-s. Não foi possível identificar qualquer relação entre os polimorfismos de NAT2 e TP53, sugerindo que são fatores independentes de risco para o CMT-s. Em conclusão, foi demonstrado que os genes de detoxificação e genes de apoptose e controle do ciclo celular estão envolvidos na suscetibilidade ao desenvolvimento de CMT-s e CMTH e podem modular a suscetibilidade à doença / Abstract: Polymorphisms in low penetrance genes have been consistently associated with susceptibility to a variety of human tumors, including thyroid cancer. In order to determine its role in medullary thyroid carcinoma (MTC) TaqMan® SNP Genotyping method was used in 138 patients with HMTC, 47 patients with MTC-s and a control group of 578 for genotyping of polymorphisms CYP1A2*F (rs762551), CYP1A1m1 (rs4646903), NAT2 C282T (rs1041983), GSTP1 codon 105 (rs1695) and TP53 codon 72 (rs1042522). This study demonstrated an association between the presence of polymorphic alleles of CYP1A2 F, GSTP1 and NAT2 and the development of HMTC. The legacy of the C allele in homozygous CYP1A2*F gene influences the development of CMTH in more than two times. Patients who had the T allele in homozygous for the NAT2 gene have a three times more likely to develop HMTC and individuals who have inherited the G allele of GSTP1 gene in homozygous are more likely to develop CMTH. A statistical analysis of logistic regression, adjusted for sex, age, ethnicity, smoking and genes CYP1A*F, CYP1A1m1, NAT, GSTP1, and TP53, in patients with HMTC, showed that, when considering the size of the tumor as an estimate of aggression, sex male presented himself as a protective factor to the increase in tumor size (OR=0.12; p=0.0072). Considering the estimate of local recurrence and aggressiveness, the altered gene GSTP1 genotype appeared as a risk factor for presence of local recurrence (OR=1.17; p=0.035). The logistic regression analysis showed that the genotypes of the NAT2 gene C/C (OR=3.87; 95%CI=2.11-7.10, p=2.2x10-5) and TP53 C/C (OR=3.87; 95%CI=1.78-6.10; p=2.8x10-4) inheritance increased the risk of sporadic MTC. A regression analysis showed that genotype C/C TP53 gene accounts for 8.07% of sporadic MTC risk. In addition, there was no association between the investigated genes and clinical or pathological features of aggressiveness of the tumors or the outcome of MTC patients. In conclusion, we demonstrated that detoxification genes and apoptotic and cell-cycle control genes are involved in the susceptibility of MTC-s and HMTC and may modulate the susceptibility to the disease / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

INTRODUÇÃO: A imensa maioria dos casos com Neoplasia Endócrina Múltipla Tipo 2 (NEM2) é causada por uma única mutação germinativa no proto-oncogene RET. Entretanto, há alguns poucos casos descritos na literatura (~16) que apresentam duplas mutações/polimorfismos no gene RET, geralmente associados a fenótipos atípicos. OBJETIVOS: Os objetivos deste projeto são: a) caracterizar os aspectos clínicos de pacientes advindos de cinco famílias não relacionadas com diagnóstico de NEM2A, nas quais se documentou a presença de uma nova dupla mutação germinativa RET nos códons 634 e 791 e b) realizar rastreamento gênico familiar dos casos sob-risco com a finalidade de identificarmos possíveis casos com esta nova mutação. PACIENTES: Cinco casos-índice foram recentemente descobertos albergando a dupla mutação germinativa RET C634Y/Y791F. Nestas famílias há relato de 208 parentes, potencialmente, sob-risco (~50%) de serem portadores desta mutação. Dentre estes 208 indivíduos, 81 (38,9%) aceitaram participar do rastreamento gênico. MÉTODOS: O estudo foi realizado na Disciplina de Endocrinologia, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O DNA do sangue periférico dos pacientes e de seus parentes sob- risco foi obtido após a obtenção do consentimento livre e esclarecido. Após PCR, foi realizado o sequenciamento gênico direto (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), abrangendo todos os 20 éxons do RET. Foram investigados potenciais polimorfismos e mutações no RET. Os tumores NEM2-relacionados (carcinoma medular de tireoide, CMT; feocromocitoma, FEO; hiperparatireoidismo primário, HPT) foram estudados quanto a vários parâmetros clínicos, como: sinais/sintomas; dimensão, penetrância e agressividade dos tumores; porcentagem de remissão bioquímica do CMT, e recidiva ou persistência dos tumores. RESULTADOS: Dentre os 81 indivíduos que participaram do rastreamento gênico, documentamos 28 casos (34,5%) como portadores da dupla mutação RET C634Y/Y791F. Além disso, as mutações foram testadas in vitro e um gene de efeito fundador foi descartado. Observou-se que: a) os cinco casos-índice (100%) com mutação germinativa RET C634Y/Y791F apresentaram FEO com características tais como, tumores medindo acima de 5,0 cm, e quatro dentre os cinco casos (80%) tiveram o diagnóstico com idades inferiores a 35 anos. A frequência de FEO nos parentes adultos (a partir da terceira década) foi de 73% e eram bilaterais em 80%; b) as características do CMT nos afetados albergando a mutação RET 634/791 eram similares às que ocorrem em pacientes com a mutação 634 isolada. Adicionalmente, estudo in vitro desta dupla mutação revelou que o grau de fosforilação das células com a dupla mutação celular 634/791 era significativamente maior (p=0,04), quando comparada com a capacidade fosforilativa das mutações 634 e 791 avaliadas individualmente. CONCLUSÃO: Diante dos presentes achados, conclui-se que os pacientes com esta nova dupla mutação tenderam a apresentar FEO de maior agressividade (precocidade, tumores volumosos e bilaterais), enquanto que o CMT, nestes casos, apresentava características usuais aos portadores de mutação RET no códon 634. A nossa hipótese é que os achados relativos ao FEO, nos presentes pacientes, foram influenciados pela presença da segunda mutação RET Y791F, a qual teria atuado como fator modulador do fenótipo. Esta hipótese foi suportada pelos estudos in vitro. Além disso, a ausência de um efeito fundador levou-nos a prever que esta dupla mutação RET pode não ser rara, na área geográfica estudada. Ainda que estes achados devam ser validados, os presentes dados podem ser úteis no diagnóstico genético e no manejo clínico e terapêutico dos pacientes com NEM2A / INTRODUCTION: The vast majority of cases with multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A) is caused by a single germline mutation in the RET proto-oncogene. However, some instances (~16) of double germline RET mutations have been reported, most frequently associated with atypical phenotypes. OBJECTIVES: The main goals of this project were: a) to characterize the phenotype of patients from five unrelated MEN2A families harboring a new RET double germline in codons 634 and 791; b) perform the genetic screening in at-risk family members attempting to search for new similarly affected cases. PATIENTS: Five affected index-cases were recently found with this new double RET mutation C634Y/Y791F. In these five families, 208 first-degree relatives were reported and they were at-risk (~50%) to develop this mutation. Eighty-one individuals out of the 208 at-risk relatives (38.9%) were available and signed the informed consent. METHODS: The present investigation was performed at the Department of Endocrinology, School of Medicine, University of São Paulo. DNA was obtained from the peripheral blood of patients and at-risk relatives, after obtaining the informed consent of all individuals. After PCR, the direct genetic sequence was performed (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), involving all 20 exons of the RET proto-oncogene. Potential mutations and polymorphisms were investigated. In addition, the mutations were tested in vitro and a potential founder effect was evaluated. The MEN2A- related tumors (medullary thyroid carcinoma, MTC; pheochromocytoma, PHEO; and primary hyperparathyroidism, HPT) were approached using several clinical parameters, as: signs and symptoms; age at the diagnosis; tumor size and aggressiveness; biochemical remission of MTC; tumor relapse or persistence; RESULTS: Within the 81 genetically screened individuals, 28 cases (34.5%) were documented harboring the RET C634Y/Y791F germline mutation. It was observed that: a) the five affected index-cases (100%) were presented with PHEOs with features such as tumors measuring more than 5.0cm, and four out of the five cases (80%) had this diagnosis under the age of 35 years old. The frequency of PHEO in the adult affected relatives was also high (73%), from the third decade on, and were bilateral in 80%; b) the features and outcome of MTC in the affected C634Y/Y791F cases were similar to those MEN2A cases harboring the RET 634 mutation only. In addition, in vitro studies verified that cells with the 634/791 mutation had a significantly higher capacity of phosphorylation than cells harboring each individual mutation (p=0.04). Also, a founding gene was ruled out in these families. CONCLUSION: Our present data indicated that the earlier and more aggressive PHEOs seen in the present cases were most probably due to a phenotype modulation of the second RET 791 mutation. This hypothesis was supported by data from in vitro studies. Also, the absence of a founding couple led us to predict that this double RET mutation may not be rare, in the studied geographic area. Although these findings need to be validated, the present data may be useful in the genetic diagnosis as well as in the clinical and therapeutic management of MEN2A