Die Neubildung von Neuronen persistiert lebenslang in der Subgranularzellschicht des Hippocampus und der Subventrikularzone des Großhirns und wird als adulte Neuroge-nese bezeichnet. Es wird vermutet, dass diese beim erwachsenen Menschen einen rele-vanten Einfluss auf degenerative Veränderungen, verschiedene neurologische Krank-heitsbilder und auf die (Dys-)Funktion des Gedächtnisses hat. Im Tiermodell wurde eine Verringerung der Neurogenese nach chronischer Morphingabe nachgewiesen. Vorarbeiten zeigten einen Zusammenhang zwischen chronischem Heroinmissbrauch und reaktiver Astrogliose, Mikrogliose und einer vermehrten Expression des polysialylated neural cell adhesion molecule im humanen Hippocampus. Daraus leitet sich die Hypothese ab, dass chronischer Heroinmissbrauch, als Modell für eine Abhängigkeitserkrankung, einen Einfluss auf die adulte humane Neurogenese hat. Es wurden in Formalin fixierte Gewebeproben aus dem Hippocampus von Verstorbenen mit einer letalen Heroinintoxikation und mit bekanntem Heroinmissbrauch (n = 20) un-tersucht und mit einer nach Alter und Geschlecht angepassten Kontrollgruppe (n = 28) verglichen. Hierbei wurden spezifische Neurogenesemarker mittels immunhistochemi-scher Methoden angewendet und ausgewertet. Es bestand eine generell sehr geringe zelluläre Proliferationsrate und eine signifikante Reduktion Musashi-1 positiver neuro-naler Vorläuferzellen bei gleichzeitig unveränderter Anzahl Nestin positiver reifender und Calretinin positiver migrierender postmitotischer Neurone. Zudem wurde ein ver-ändertes Calretinin-Expressionsmuster als Hinweis auf eventuelle funktionelle neuronale Defizite bei Drogenabhängigen festgestellt. Der potentielle Einfluss von chronischem Heroinmissbrauch auf die adulte humane Neurogenese wird erstmals gezeigt. Die Ergebnisse weisen auf eine negative Beeinflus-sung im Stadium neuronaler Vorläuferzellen und der Zellfunktion migrierender Neurone in der Fallgruppe im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe hin. Diese Hemmung der Neurogenese könnte eine Erklärungsmöglichkeit für kognitive Defizite und Funktionsstörungen des Gedächtnisses infolge chronischen Drogenkonsums bieten und zugleich eine Bedeutung bei der Entstehung von Abhängigkeitserkrankungen haben. Insofern könnte sich hier ein Ansatzpunkt für zukünftige Therapiestrategien derartiger Erkrankungen oder ihrer Folgen bieten.:I. Inhaltsverzeichnis 1 II. Bibliografische Zusammenfassung 2 III. Abkürzungsverzeichnis 3 1. Einführung 4 1.1. Drogenabhängigkeit und Epidemiologie 4 1.2. Heroin 6 1.3. Hippocampus 9 1.4. Adulte Neurogenese 11 1.5. Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit 14 2. Materialen und Methoden 18 2.1. Fall- und Kontrollgruppe 18 2.2. Toxikologisch-chemische Untersuchungen 20 2.3. Immunhistochemie 21 2.4. Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie 25 2.5. Quantifizierung, Datenanalyse und Statistik 26 3. Ergebnisse 28 3.1. Deskriptive Datenanalyse 28 3.2. Musashi-1 30 3.3. Nestin 31 3.4. Calretinin 32 3.5. Ki-67 34 3.6. Doublecortin 35 3.7. Doppelimmunfluoreszenz 36 4. Diskussion 37 4.1. Neurogenese – Proliferation (Ki-67) 38 4.2. Neurogenese – Differenzierung (MSI-1, Nestin) 39 4.3. Neurogenese – Reifung (Calretinin) 42 4.4. Methodische Grenzen und Fehlerbetrachtung 43 4.5. Fazit und Ausblick 46 5. Zusammenfassung der Arbeit 48 6. Literaturverzeichnis 52 7. Anlagen 1-8 65 IV. Selbständigkeitserklärung 73 V. Curriculum vitae 74 VI. Publikationen 75 VII. Danksagung 76

[ES] Los receptores tipo Toll, TLR, son receptores clave en la defensa contra los patógenos capaces de iniciar la respuesta inmunitaria innata para proteger al huésped. Su papel no solo se relega a responder a estímulos foráneos, sino que también pueden detectar daños en los tejidos o células lesionadas induciendo su respuesta a lo que se conoce como "inflamación estéril". Las células del sistema inmunitario no son las únicas que presentan TLR; también se encuentran en células de la glía, neuronas y precursores neurales (NPC). Concretamente, TLR2 y TLR4 en NPC en cerebro contribuyen a la determinación del destino celular y plasticidad neuronal durante el desarrollo. Sin embargo, sus funciones en la fisiología y patología de la médula espinal no están bien definidas, así como en procesos críticos como la neurogénesis, autorrenovación o proliferación. Esta tesis doctoral, distribuida entre tres capítulos, se ha centrado 1) en el estudio del papel de TLR2 y TLR4 en precursores derivados de medula espinal neonatal (Capítulo 1); 2) en evaluar el papel de ambos, TLR2 y TLR4 en el proceso de regeneración espontánea o tras trasplante ectópico de NPC, en un modelo de lesión medular inducida (Capítulo 2); 3) en el estudio del papel de TLR4 en la modulación del fenotipo inflamatorio en respuesta al proteoglicano condroitín sulfato (CSPG) secretado tras la lesión medular con actividad inhibitoria del recrecimiento axonal tras lesión medular (Capítulo 3). / [CA] Els receptors tipus Toll, TLR, són receptors clau en la defensa contra els patògens capaços d'iniciar la resposta immunitària innata per a protegir l'hoste. El seu paper no sols es relega a respondre a estímuls forans, sinó que també poden detectar danys en els teixits o cèl·lules lesionades induint la seua resposta al que es coneix com a "inflamació estèril". Les cèl·lules del sistema immunitari no són les úniques que presenten TLR; també es troben en cèl·lules de la glia, neurones i precursors neurals (NPC). TLR2 i TLR4 en NPC en cervell contribueixen a la determinació del destí cel·lular i plasticitat neuronal. No obstant això, les seues funcions en la fisiopatologia de la medul·la espinal no estan ben definides, així com en processos crítics com la neurogènesi, autorenovació o proliferació. Aquesta tesi doctoral, distribuïda entre tres capítols, s'ha centrat: 1) En l'estudi del paper de TLR2 i TLR4 en precursors derivats de medul·la espinal neonatal (Capítol 1); 2) A avaluar el paper de tots dos, TLR2 i TLR4, en el procés de regeneració espontània o després de trasplantament ectòpic de NPC, en un model de lesió medul·lar induïda (Capítol 2); 3) En l'estudi del paper de TLR4 en la modulació del fenotip inflamatori en resposta al proteoglicà condroití sulfat (CSPG) secretat després de la lesió medul·lar amb activitat inhibitòria del recreixement axonal després de lesió medul·lar (Capítol 3). / [EN] Toll-like receptors, TLRs, are key receptors in the defence against pathogens capable of initiating the innate immune response to protect the host. Their role is not only limited to responding to foreign stimuli, but they can also detect damage to injured tissues or cells, inducing their response to what is known as 'sterile inflammation'. Immune system cells are not the only cells that display TLRs; they are also found in glial cells, neurons and neural precursors cells (NPCs). TLR2 and TLR4 NPCs from brain contribute to cell fate determination and neuronal plasticity. However, their roles in spinal cord pathophysiology and in critical processes such as neurogenesis, self-renewal or proliferation are not well defined. This doctoral thesis, distributed among three chapters, has focused: 1) on the study of the role of TLR2 and TLR4 in neonatal spinal cord-derived precursors (Chapter 1); 2) on evaluating the role of both TLR2 and TLR4 in the process of spontaneous regeneration or after ectopic transplantation of NPC, in a model of induced spinal cord injury (Chapter 2); 3) to study the role of TLR4 in modulating the inflammatory phenotype in response to chondroitin sulphate proteoglycan (CSPG) secreted after spinal cord injury with inhibitory activity on axonal regrowth after spinal cord injury (Chapter 3). / The student has been granted with a PhD fellowship from a predoctoral program at the CIPF and with International Research and Training Exchange Programme at the CIPF. This work has been supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (projects RTI2018-095872-B-C21; MAT2015-66666-C3-R; SAF2015-69187R) and Spanish Ministry of Heath, PNSD2018 I003. / Sánchez Petidier, M. (2022). Toll-like receptors in spinal cord derived neural precursor cells: implications on spinal cord injury and cell transplantation [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/180753 / TESIS

Adult neural precursor cells (NPCs) are a heterogeneous population of mitotically active, self-renewing multipotent cells of both adult and developing CNS. They can be expanded in vitro in the presence of mitogens. The B05 transgenic SCA1 mice, expressing human ataxin-1 with an expanded polyglutamine tract in cerebellar Purkinje cells (PCs), recapitulate many pathological and behavioral characteristics of the neurodegenerative disease spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1), including progressive ataxia and PC loss. We transplanted neural precursor cells (NPCs) derived from the subventricular zone of GFP-expressing adult mice into the cerebellar white matter of SCA1 mice when they showed absent (5 weeks), initial (13 weeks) and significant PC loss (24 weeks). A stereological count demonstrates that mice with significant cell loss exhibit highest survival of grafted NPCs and migration to the vicinity of PCs as compared to wt and younger grafted animals. These animals showed improved motor skills as compared to sham animals. Confocal analysis and profiling shows that many of implanted cells present in the cerebellar cortex have formed gap junctions with host PCs and express connexin43. Grafted cells did not adopt characteristics of PCs, but stereological and morphometric analysis of the cerebellar cortex revealed that grafted animals had more surviving PCs and a better preserved morphology of these cells than the control groups. Perforated patch clamp recordings revealed a normalization of the PC basal membrane potential, which was abnormally depolarized in sham-treated animals. No significant increase in levels of several neurotrophic factors was observed, suggesting, along with morphological observation, that the neuroprotective effect of grafted NPCs was mediated by direct contact with the host PCs. In this study, evidence for a neuroprotective effect came, in addition to motor behavior improvement, from stereological and electrophysiological analyses and suggest that timing of stem cell delivery is important to determine its therapeutic effect.<p>In a brain stem cell niche, NSCs reside in a complex cellular and extracellular microenvironment comprising their own progeny, ependymal cells, numerous blood vessels and various extracellular matrix molecules. Recently, it was reported that blood vessel ECs-NSCs crosstalk plays an important role in tissue homeostasis. Bloodstream offers a natural delivery vehicle especially in case of diffuse neurodegenerative diseases which require widespread distribution of exogenous cells. As NSCs are confronted with blood-brain barrier endothelial cells (BBB-ECs) before they can enter into brain parenchyma, we investigated their interaction using primary cultures in an in vitro BBB model. We isolated human fetal neural precursor cells (hfNPCs) from aborted fetal brain tissues and expanded in vitro. We showed that in an in vitro model, human BBB endothelium induces the rapid differentiation of hfNPCs and allows them to cross the endothelial monolayer, with the differentiated progeny remaining in close contact with endothelial cells. These results are not reproduced when using a non-BBB endothelium and are partly dependent on the cytokine MCP1. Our data suggest that, in the presence of attractive signals released by a damaged brain, intravascularly administered NPCs can move across an intact BBB endothelium and differentiate in its vicinity. Overall, our findings have implications for the development of cellular therapies for cerebellar degenerative diseases and understanding of the brain stem cell niche. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Impairment of mucociliary clearance with reduced airway fluid secretion leads to chronically inflamed airways. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is crucially involved in airway fluid secretion and dexamethasone (dexa) has previously been shown to elevate CFTR activity in airway epithelial cells. However, the pathway by which dexa increases CFTR activity is largely unknown. We aimed to determine whether the increase of CFTR activity by dexa is achieved by non-genomic signaling and hypothesized that the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway is involved in CFTR stimulation. Primary rat airway epithelial cells and human bronchial submucosal gland-derived Calu-3 cells were analyzed in Ussing chambers and kinase activation was determined byWestern blots. Results demonstrated a critical involvement of PI3K and protein kinase B (AKT) signaling in the dexa-induced increase of CFTR activity, while serum and glucocorticoid dependent kinase 1 (SGK1) activity was not essential. We further demonstrated a reduced neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 4-like (NEDD4L) ubiquitin E3 ligase activity induced by dexa, possibly responsible for the elevated CFTR activity. Finally, increases of CFTR activity by dexa were demonstrated within 30 min accompanied by rapid activation of AKT. In conclusion, dexa induces a rapid stimulation of CFTR activity which depends on PI3K/AKT signaling in airway epithelial cells. Glucocorticoids might thus represent, in addition to their immunomodulatory actions, a therapeutic strategy to rapidly increase airway fluid secretion.

[ES] La capacidad de las células madre para proliferar formando distintas células especializadas les otorga la potencialidad de servir de base para terapias efectivas para patologías cuyo tratamiento era inimaginable hasta hace apenas dos décadas. Sin embargo, esta capacidad se encuentra mediada por estímulos fisiológicos, químicos, y eléctricos, específicos y complejos, que dificultan su traslación a la rutina clínica. Por ello, las células madre representan un campo de estudio en el que se invierten amplios esfuerzos por parte de la comunidad científica. En el ámbito de la regeneración nerviosa, para modular su desarrollo y diferenciación el tratamiento farmacológico, la electroestimulación, y la estimulación optogenética son técnicas que están consiguiendo prometedores resultados. Es por ello por lo que en la presente tesis se ha desarrollado un conjunto de sistemas electrónicos para permitir la aplicación combinada de estas técnicas in vitro, con perspectiva a su aplicación in vivo. Hemos diseñado una novedosa tecnología para la liberación eléctricamente controlada de fármacos. Esta tecnología está basada en nanopartículas de sílice mesoporosa y puertas moleculares de bipiridina-heparina. Las puertas moleculares son electroquímicamente reactivas, y encierran los fármacos en el interior de las nanopartículas, liberándolos ante un estímulo eléctrico. Hemos caracterizado esta tecnología, y la hemos validado mediante la liberación controlada de rodamina en cultivos celulares de HeLa. Para la combinación de liberación controlada de fármacos y electroestimulación hemos desarrollado dispositivos que permiten aplicar los estímulos eléctricos de forma configurable desde una interfaz gráfica de usuario. Además, hemos diseñado un módulo de expansión que permite multiplexar las señales eléctricas a diferentes cultivos celulares. Además, hemos diseñado un dispositivo de estimulación optogenética. Este tipo de estimulación consiste en la modificación genética de las células para que sean sensibles a la radiación lumínica de determinada longitud de onda. En el ámbito de la regeneración de tejido mediante células precursoras neurales, es de interés poder inducir ondas de calcio, favoreciendo su diferenciación en neuronas y la formación de circuitos sinápticos. El dispositivo diseñado permite obtener imágenes en tiempo real mediante microscopía confocal de las respuestas transitorias de las células al ser irradiadas. El dispositivo se ha validado irradiando neuronas modificadas con luz pulsada de 100 ms. También hemos diseñado un dispositivo electrónico complementario de medida de irradiancia con el doble fin de permitir la calibración del equipo de irradiancia y medir la irradiancia en tiempo real durante los experimentos in vitro. Los resultados del uso de los bioactuadores en procesos complejos y dinámicos, como la regeneración de tejido nervioso, son limitados en lazo abierto. Uno de los principales aspectos analizados es el desarrollo de biosensores que permitiesen la cuantización de ciertas biomoléculas para ajustar la estimulación suministrada en tiempo real. Por ejemplo, la segregación de serotonina es una respuesta identificada en la elongación de células precursoras neurales, pero hay otras biomoléculas de interés para la implementación de un control en lazo cerrado. Entre las tecnologías en el estado del arte, los biosensores basados en transistores de efecto de campo (FET) funcionalizados con aptámeros son realmente prometedores para esta aplicación. Sin embargo, esta tecnología no permitía la medición simultánea de más de una biomolécula objetivo en un volumen reducido debido a las interferencias entre los distintos FETs, cuyos terminales se encuentran inmersos en la solución. Por ello, hemos desarrollado instrumentación electrónica capaz de medir simultáneamente varios de estos biosensores, y la hemos validado mediante la medición simultánea de pH y la detección preliminar de serotonina y glutamato. / [CA] La capacitat de les cèl·lules mare per a proliferar formant diferents cèl·lules especialitzades els atorga la potencialitat de servir de base per a teràpies efectives per a patologies el tractament de les quals era inimaginable fins fa a penes dues dècades. No obstant això, aquesta capacitat es troba mediada per estímuls fisiològics, químics, i elèctrics, específics i complexos, que dificulten la seua translació a la rutina clínica. Per això, les cèl·lules mare representen un camp d'estudi en el qual s'inverteixen amplis esforços per part de la comunitat científica. En l'àmbit de la regeneració nerviosa, per a modular el seu desenvolupament i diferenciació el tractament farmacològic, l'electroestimulació, i l'estimulació optogenética són tècniques que estan aconseguint prometedors resultats. És per això que en la present tesi s'ha desenvolupat un conjunt de sistemes electrònics per a permetre l'aplicació combinada d'aquestes tècniques in vitro, amb perspectiva a la seua aplicació in vivo. Hem dissenyat una nova tecnologia per a l'alliberament elèctricament controlat de fàrmacs. Aquesta tecnologia està basada en nanopartícules de sílice mesoporosa i portes moleculars de bipiridina-heparina. Les portes moleculars són electroquímicament reactives, i tanquen els fàrmacs a l'interior de les nanopartícules, alliberant-los davant un estímul elèctric. Hem caracteritzat aquesta tecnologia, i l'hem validada mitjançant l'alliberament controlat de rodamina en cultius cel·lulars de HeLa. Per a la combinació d'alliberament controlat de fàrmacs i electroestimulació hem desenvolupat dispositius que permeten aplicar els estímuls elèctrics de manera configurable des d'una interfície gràfica d'usuari. A més, hem dissenyat un mòdul d'expansió que permet multiplexar els senyals elèctrics a diferents cultius cel·lulars. A més, hem dissenyat un dispositiu d'estimulació optogenètica. Aquest tipus d'estimulació consisteix en la modificació genètica de les cèl·lules perquè siguen sensibles a la radiació lumínica de determinada longitud d'ona. En l'àmbit de la regeneració de teixit mitjançant cèl·lules precursores neurals, és d'interés poder induir ones de calci, afavorint la seua diferenciació en neurones i la formació de circuits sinàptics. El dispositiu dissenyat permet obtindré imatges en temps real mitjançant microscòpia confocal de les respostes transitòries de les cèl·lules en ser irradiades. El dispositiu s'ha validat irradiant neurones modificades amb llum polsada de 100 ms. També hem dissenyat un dispositiu electrònic complementari de mesura d'irradiància amb el doble fi de permetre el calibratge de l'equip d'irradiància i mesurar la irradiància en temps real durant els experiments in vitro. Els resultats de l'ús dels bioactuadors en processos complexos i dinàmics, com la regeneració de teixit nerviós, són limitats en llaç obert. Un dels principals aspectes analitzats és el desenvolupament de biosensors que permeteren la quantització de certes biomolècules per a ajustar l'estimulació subministrada en temps real. Per exemple, la segregació de serotonina és una resposta identificada amb l'elongació de les cèl·lules precursores neurals, però hi ha altres biomolècules d'interés per a la implementació d'un control en llaç tancat. Entre les tecnologies en l'estat de l'art, els biosensors basats en transistors d'efecte de camp (FET) funcionalitzats amb aptàmers són realment prometedors per a aquesta aplicació. No obstant això, aquesta tecnologia no permetia el mesurament simultani de més d'una biomolècula objectiu en un volum reduït a causa de les interferències entre els diferents FETs, els terminals dels quals es troben immersos en la solució. Per això, hem desenvolupat instrumentació electrònica capaç de mesurar simultàniament diversos d'aquests biosensors i els hem validat amb mesurament simultani del pH i la detecció preliminar de serotonina i glutamat. / [EN] The stem cells' ability to proliferate to form different specialized cells gives them the potential to serve as the basis for effective therapies for pathologies whose treatment was unimaginable until just two decades ago. However, this capacity is mediated by specific and complex physiological, chemical, and electrical stimuli that complicate their translation to clinical routine. For this reason, stem cells represent a field of study in which the scientific community is investing a great deal of effort. In the field of nerve regeneration, to modulate their development and differentiation, pharmacological treatment, electrostimulation, and optogenetic stimulation are techniques that are achieving promising results. For this reason, we have developed a set of electronic systems to allow the combined application of these techniques in vitro, with a view to their application in vivo. We have designed a novel technology for the electrically controlled release of drugs. This technology is based on mesoporous silica nanoparticles and bipyridine-heparin molecular gates. The molecular gates are electrochemically reactive and entrap the drugs inside the nanoparticles, releasing them upon electrical stimulus. We have characterized this technology and validated it by controlled release of rhodamine in HeLa cell cultures. For combining electrostimulation and controlled drug release we have developed devices that allow applying the different electrical stimuli in a configurable way from a graphical user interface. In addition, we have designed an expansion module that allows multiplexing electrical signals to different cell cultures. In addition, we have designed an optogenetic stimulation device. This type of stimulation consists of genetically modifying cells to make them sensitive to light radiation of a specific wavelength. In tissue regeneration using neural precursor cells, it is interesting to be able to induce calcium waves, favoring the cell differentiation into neurons and the formation of synaptic circuits. The designed device enable the obtention of real-time images through confocal microscopy of the transient responses of cells upon irradiation. The device has been validated by irradiating modified neurons with 100 ms pulsed light stimulation. We have also designed a complementary electronic irradiance measurement device to allow calibration of the irradiator equipment and measuring irradiance in real time during in vitro experiments. The results of using bioactuators in complex and dynamic processes, such as nerve tissue regeneration, are limited in an open loop. One of the main aspects analyzed is the development of biosensors that would allow quantifying of specific biomolecules to adjust the stimulation provided in real time. For instance, serotonin secretion is an identified response of neural precursor cells elongation, among other biomolecules of interest for the implementation of a closed-loop control. Among the state-of-the-art technologies, biosensors based on field effect transistors (FETs) functionalized with aptamers are promising for this application. However, this technology did not allow the simultaneous measurement of more than one target biomolecule in a small volume due to interferences between the different FETs, whose terminals are immersed in the solution. This is why we have developed electronic instrumentation capable of simultaneously measuring several of these biosensors, and we have validated it with the simultaneous pH measurement and the preliminary detection of serotonin and glutamate. / Monreal Trigo, J. (2023). Electronic Devices for the Combination of Electrically Controlled Drug Release, Electrostimulation, and Optogenetic Stimulation for Nerve Tissue Regeneration [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193841